Un Ex vivo Système de culture à étudier la thyroïde développement

L’objectif global de cette procédure est de disséquer une culture ex vivo, une souris, des implants thyroïdiens embryonnaires ou des lobes pour permettre l’étude des événements morphogénétiques et de différenciation survenant au cours du développement thyroïdien. Ceci est accompli en enlevant d’abord la mâchoire supérieure et la partie inférieure du corps du jour embryonnaire. E 12.5 à E 14.5 embryons de souris pour isoler la région du cou des embryons.

Dans la deuxième étape, le tube neural, les tissus latéraux et la langue sont retirés pour exposer la partie supérieure de la trachée et de l’œsophage. Ensuite, le bourgeon thyroïdien, les régions ou les lobes sont nettoyés de tous les tissus indésirables. Dans la dernière étape, les implants thyroïdiens sont plaqués pour la culture sur un micropuits enduit ou sur un filtre.

Enfin, l’imagerie en accéléré, la coloration immunitaire ou l’analyse de l’expression génique peuvent être réalisées pour étudier la morphogenèse épithéliale, l’organisation tridimensionnelle et les follicules, la vascularisation des implants ou la différenciation des progéniteurs thyroïdiens. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés de développement et de différenciation. Question sur l’organisation des cellules épithéliales thyroïdiennes en 3D, la formation de la lumière, la différenciation cellulaire, la polarisation et la croissance.

Fidel Marcel, un étudiant diplômé, et Myla LaCorte, une postdoctrice, tous deux de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure sous forme stérile dans la hotte à flux laminaire. Deux heures avant l’isolement du tissu thyroïdien, diluez le collagène stérile de type 1 à 50 microgrammes par millilitre. Concentration finale dans du chlorure d’hydrogène de 10 millimolaires, et placez le collagène sur de la glace.

Couvrez ensuite chacun des puits d’une chambre de culture en plastique avec 200 microlitres de collagène dilué et incubez la chambre à température ambiante Après deux heures, aspirez le collagène. Rincez les puits avec un milieu M1 99 et ajoutez un volume minimum de 200 microlitres de milieu de culture à chacun. Placez bien les chambres recouvertes dans l’incubateur, puis procédez à la dissection thyroïdienne.

Tout d’abord, placez l’utérus disséqué dans une plaque de 10 centimètres contenant HBSS. Ensuite, utilisez des pinces pour tenir une extrémité de l’utérus, puis ouvrez l’utérus avec de petits ciseaux pour libérer consécutivement chacun des embryons. Utilisez les ciseaux pour séparer les embryons du placenta, puis transférez les embryons à l’intérieur de leurs membranes embryonnaires supplémentaires dans une nouvelle plaque de 10 centimètres contenant du HBSS frais.

Ensuite, poursuivez la dissection au stéréomicroscope pour chaque embryon. Tout d’abord, retirez le sac vitellin et l’amnion. Ensuite, il tient des aiguilles de tungstène dans des capillaires de verre comme un couteau et une fourchette.

Retirez la partie supérieure de la tête, y compris la mâchoire supérieure et les oreilles. Tenez l’embryon sur son dos. Ensuite, retirez un morceau supplémentaire du tube neural, puis retirez la partie inférieure de l’embryon juste sous les membres antérieurs et au-dessus du cœur.

Pour orienter le tissu, transférez la tranche d’embryon contenant la langue et la région du cou dans une nouvelle plaque de 10 centimètres contenant du HBSS frais et retirez le tube neural et les tissus postérieurs à l’œsophage et à la trachée. Maintenant, séparez doucement la tranche de tissu des deux côtés de la langue. Localisez ensuite l’œsophage et la trachée, disséquez la langue, laissant le gonflement rétinoïde et le tissu des deux côtés de l’œsophage et de la trachée.

Après avoir retiré la langue, disséquez l’œsophage et placez la trachée, côté ventral vers le haut. Ensuite, disséquez les tissus indésirables tels que le thymus et tous les tissus situés latéralement aux artères de l’arc pharyngé. Ensuite, pour les embryons E 13.5 ou E 14.5, visualisez les lobes thyroïdiens de chaque côté de la trachée et disséquez davantage les lobes de la trachée.

Pour les embryons E 12.5, la dissection peut être effectuée comme nous venons de le démontrer jusqu’à l’excision de la langue et de l’œsophage. Ensuite, après avoir localisé les artères de l’arc pharyngé, retirez tous les tissus latéraux comme pour les embryons E 13,5 à 14,5. Enfin, à l’aide d’une pointe filtrante pré-humidifiée sur une micropipette P 200, transférez le tissu isolé dans une plaque de culture de 35 millimètres contenant un milieu de culture préchauffé.

Avant de plaquer l’explan thyroïdien X E 13.5 à E 14.5. Tout d’abord, lavez le tissu par transfert successif dans trois puits d’une plaque de 24 puits contenant un millilitre de milieu de culture préchauffé pour déposer les lobes sur les chambres pré-enrobées. Tout d’abord, aspirez le milieu de culture et utilisez une micro-pipette avec des pointes filtrées pour plaquer soigneusement un lobe thyroïdien dans chacune des chambres de culture.

Retirez tout excès de milieu, puis placez la chambre de culture dans un incubateur de culture tissulaire pour permettre aux explants de se fixer à la matrice. Ensuite, après deux heures, ajoutez doucement 200 à 300 microlitres de milieu de culture préchauffé dans chaque puits et remettez les chambres dans l’incubateur pour plaquer la région de la trachée E 12.5 ou les lobes thyroïdiens sur des filtres semi-poreux. Tout d’abord, remplissez les puits d’une plaque de 24 puits avec cent 30 microlitres de culture Prewarm.

Le lieu moyen filtre sur le milieu. En prenant soin d’éviter de piéger des bulles d’air sous le filtre de culture. Ensuite, utilisez une micro-pipette avec des pointes filtrées pour transférer soigneusement l’explan thyroïdien ou les lobes, et un volume minimal de milieu au centre de chacun des filtres jusqu’à un maximum de quatre x explan par filtre.

Lorsque vous placez l’explan X sur le filtre, il est important de les transférer au centre du filtre avec une quantité minimale de milieu pour éviter que le milieu n’entre en contact et ne crée un ménisque avec la paroi du filtre. Enfin, retirez tout excès de fluide et utilisez une aiguille en tungstène pour les espacer. Ensuite, placez-les dans l’incubateur de culture tissulaire jusqu’à sept jours, en changeant de milieu de culture tous les deux jours sous le capot à flux laminaire.

Après une journée de culture sur un filtre, la ligne médiane de laa est visible sous la forme d’un tissu allongé couvrant toute la longueur supérieure et formant deux lobes de chaque côté de la trachée. Avec la culture, les lobes se dilatent en subissant la morphogenèse de l’organisation des cellules épithéliales en structures folliculaires macroscopiquement visibles. Comme le démontrent ces images, l’organisation et la polarisation des cellules épithéliales positives et cohérentes peuvent être visualisées par immunomarquage de l’ezrin.

Au fil du temps, les structures intracellulaires positives d’ezrin ont fusionné avec le pôle de la cellule qui deviendra le pôle apical. Au cours de ce processus, les cellules endothéliales positives quatre pcam prolifèrent et s’organisent autour des follicules en développement pour former des unités angio-folliculaires. Pour quantifier la différenciation des thro, des cytes et des cellules C, l’expression des gènes peut être dosée par R-T-Q-P-C-R de l’ARN, isolé des lobes thyroïdiens en culture.

Alors que l’expression du facteur de transcription thyroïdienne, NK X 2.1, ne change pas au cours de la culture, l’expression de la thyroglobuline spécifique et de la calcitonine spécifique des cellules C augmente considérablement, indiquant une différenciation fonctionnelle. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer et de cultiver l’explan thyroïdien. Vous n’êtes pas prêt à effectuer une expérience de gain et de perte de fonction en utilisant des embryons de type sauvage ou NOCO.