Name: Utilisation de protéines fluorescentes pour surveiller glycosome Dynamics dans le trypanosome africain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Découvrez la dynamique des glycosomes dans les trypanosomes africains en utilisant des protéines fluorescentes et la cytométrie en flux. Cette méthode permet l'analyse en temps réel de milliers de cellules vivantes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été financé par le Creative Inquiry Program for Undergraduate Research et le Calhoun Honors College de l’Université de Clemson.

1. général trypanosomes élevage <ol><li> Peser les solides pour la préparation de milieux SDM79 (tableau 1). </li><li> Conserver à 4 ° C dans 50 ml conique ou un sac Ziploc. REMARQUE: Les réactifs sont stables pendant au moins 6 mois. </li><li> Dégel du sérum de veau fœtal (FBS) dans un bain-marie à 37 °, et mélanger périodiquement par inversion. REMARQUE: FBS est reçue par le fournisseur comme une solution stérile. Filtre stérilisant FBS réduit sa capacité à soutenir la croissance du parasite. </li><li> Une fois que la totalité du flacon est décongelé, la chaleur inactiver le sérum pendant 30 min dans un bain-marie à 56 ° C, en mélangeant périodiquement afin de minimiser la précipitation des composants du sérum. </li><li> Pénicilline dégel / solution de streptomycine (stylo / angine), hémine (2 mg / ml dans du NaOH 50 mM), et la solution aigle de vitamine milieu de base à la température ambiante. </li><li> Pour 1.000 ml graduée, ajouter 20,2 g de matières solides SDM79 (tableau 1) aux composants liquides (tableau 2) et bien mélanger sur une plaque d&#39;agitation. </li><li> Ajuster le pH à 7,35, et porter le volume à 850 ml avec de l&#39;eau. </li><li> Stériliser par filtration support par la fixation d&#39;un tuyau d&#39;aspiration sur le fond d&#39;une bouteille de filtre. Appliquer le vide jusqu&#39;à ce que la solution est filtrée. </li><li> Retirer la partie supérieure du filtre dans l&#39;enceinte de sécurité biologique et ajouter 150 ml d&#39;inactivé par la chaleur de FBS. Enlevez le couvercle de plastique du bouchon stérile et une bouteille de médias d&#39;étanchéité. </li><li> Préparer SDM80 support de la même manière que SDM79 avec les exceptions suivantes; ne pas ajouter de glucose ou de la glucosamine et utiliser MEM sans glutamine. A la place de 150 ml de FBS inactivé par la chaleur, ajouter 135 ml de dialyse, de la chaleur de FBS inactivé, et 15 ml de FBS inactivé par la chaleur. </li><li> Culture parasites PCF en flacon de 25 cm2 avec 10 ml de milieu approprié à 27 ° C et 5% de CO 2. NOTE: Les cellules doivent être comptabilisés quotidiennement en utilisant un hématimètre ou un cytomètre de flux (voir la section 6) et cultures doivent être maintenues à des densités entre 1 x 10 5 et 5 x 10 6 cellules / ml. </li></ol> 2 Transfection de PCF parasites avec la construction de rapporteur fluorescent NOTE: Pour suivre glycosome dynamique, une protéine rapporteur contenant la séquence de ciblage des peroxysomes (PTS2) de aldolase fusionnée à la protéine fluorescente jaune améliorée est exprimée dans les parasites. La séquence codant pour la protéine de fusion est clone dans pXS2bla 12, qui contient le promoteur de procycline et les régions intergéniques tubuline, qui recombinaison homologue dans le génome directe et le gène de résistance à la blasticidine de sélection. Lignées cellulaires hébergeant procyclique les gènes codant pour la polymerase T7 et répresseur tetracycline (PF29-13) sont transformées avec la construction de ciblage, pXS2: PTS2eYFP. <ol><li> Préparer CYTOMIX en mélangeant les composants répertoriés dans le tableau 3. Filtre stériliser et conserver à la température ambiante. </li><li> Linéarisation de l&#39;ADN de plasmide avec Mlul par pipetage de 10 ul de l&#39;ADN (1 ug / ul), le tampon d&#39;enzyme de restriction de 5 pi, 33 pi d&#39;eau, et 2 μ; L de MluI enzyme dans un tube à centrifuger. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Purifier la digestion de restriction en ajoutant 1 volume de tampon de liaison à l&#39;enzyme de digestion de restriction. Mélanger tampon de liaison et l&#39;ADN digéré par vortex. Centrifuger brièvement pour collecter l&#39;échantillon au fond du tube. </li><li> Insérer une colonne dans un tube de liaison 2 ml de collecte d&#39;ADN, et le transfert de l&#39;ADN digéré / solution tampon de liaison à la colonne. </li><li> Centrifuger 10 000 g pendant 1 min. Après centrifugation, éliminer le filtrat de tube de collecte et de retour à la colonne du tube de collecte. </li><li> Ajouter 700 ul de tampon de lavage SPW et centrifuger à 10 000 g pendant 1 min. </li><li> Jeter le filtrat à partir de tube de collecte, de retour à la colonne du tube de collecte et répéter SPW étape de lavage et centrifugation. </li><li> Filtrat Jeter, colonne de retour au tube de collecte, et centrifugeuse colonne vide pendant 3 min à 10 000 xg pour éliminer l&#39;éthanol résiduel. </li><li> Dans une enceinte de sécurité biologique, jeter coltube de collecte et lieu colonne dans un tube à centrifuger stérile. </li><li> Pour éluer l&#39;ADN, ajouter 25 ul d&#39;eau stérile à la colonne et incuber à température ambiante pendant 2 min. Centrifuger à 10 000 g pendant 1 min. </li><li> Ajouter un autre 25 pi d&#39;eau stérile dans la hotte de biosécurité à la colonne et incuber à température ambiante pendant 2 min. </li><li> Centrifuger à 10000 vitesse de g pendant 1 min. </li><li> Dans une enceinte de biosécurité transférer tout le volume de l&#39;ADN à un nouveau tube stérile. REMARQUE: Cette étape empêche la contamination par le couvercle ouvert pendant la centrifugation. </li><li> Ajouter l&#39;, purifié, de l&#39;ADN linéarisé stérile (10 mg) à 400 ul de CYTOMIX stérilisée par filtration. </li><li> Compter les cellules comme décrit dans l&#39;article 6 et récolter 5 x10 7 -10 8 cellules par centrifugation à 800 g pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Décanter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 450 pi d&#39;ADN + CYTOMIX utilisant une pipette sérologique de 1 ml. </li><li> la solution de transfert contenant CE<html> lls, ADN, et CYTOMIX à un écart de 4 mm cuvette et le lieu cuvette stérile dans la chambre d&#39;électroporation. </li><li> Sélectionnez «Décroissance exponentielle&quot; et entrer manuellement les paramètres suivants: tension: 1,5 kV, Capacité: 25 mF, Résistance: Ω, et de la Cuvette: 4 mm. impulsion de presse. Une fois que l&#39;impulsion est terminée, retirez la cuvette de la chambre d&#39;électroporation et revenir à l&#39;enceinte de sécurité biologique. </li><li> Dans un nouveau flacon stérile, une pipette 10 ml de SDM79. Transférer les cellules transformées dans le ballon avec 10 ml de SDM79. </li><li> Incuber sans sélection de médicaments pendant 24 heures à 27 ° C, 5% CO 2. Après 24 heures, ajouter du G418 (15 ug / ml), l&#39;hygromycine (50 mg / ml), et de la blasticidine (10 ug / ml). Passez 1 ml de cellules transformées avec le médicament dans 9 ml de SDM79 avec la drogue. </li><li> Analyser les cellules quotidienne comme décrit dans les sections 6 et 7 Lorsque les cellules sont fluorescentes, et ont atteint une densité cellulaire de 1 x 10 7 / ml, faire stabilats pour le stockage à long terme (3.1-3.3). </li></ol>ve_title &quot;&gt; 3. Faire stabilats <ol><li> Pour faire des milieux de congélation, ajouter un volume égal à 100% de glycérol à CYTOMIX et filtre stériliser. </li><li> Ajouter 200 ul de milieu de congélation de 800 pi de cellules (1 x 10 7) dans un tube cryogénique, mélanger doucement par inversion et entre deux supports en polystyrène et congeler à -80 ° C. </li><li> Une fois congelés (~ 24 h), les cellules de transfert à l&#39;azote liquide. NOTE: Il est important de déplacer des cellules dans LN 2 après 24 h, comme plus de stockage à -80 ° C conduit à une diminution de la viabilité cellulaire. </li></ol> 4. stocks dégel congelés <ol><li> Retirer flacon congelé entre -80 ° C et décongélation à température ambiante pendant environ 10 min. </li><li> Pipette 9 ml de SDM79 avec la drogue dans un nouveau flacon stérile. Ajouter cellules décongelées à ce flacon. Faire passer les cellules 01 heures 10 en ajoutant 1 ml de cette culture à 9 ml de SDM79 dans un nouveau flacon (concentration finale de 1 x 10 5 / ml). </li><li> Avant que les cellules atteignent une densité de 10 7 / ml, commencer cytomètre mettreet des dosages de dilution. </li></ol> 5. configuration du cytomètre <ol><li> Allumez le cytomètre en flux et ouvrir programme cflow Plus. REMARQUE: Avant d&#39;effectuer des échantillons, la fluidique devraient être rincé et rincés selon les étapes 5.2 à 5.7. </li><li> Remplacer le tube d&#39;eau nanopure dans lequel la gorgée est enregistrée avec un tube vide. </li><li> Sélectionnez le bouton &quot;backflush&quot;. </li><li> Une fois backflush est terminée, retirez tube de l&#39;gorgée et défausse. </li><li> Placez un nouveau tube contenant 1 ml d&#39;eau nouvelle nanopure sur la gorgée. </li><li> Sélectionnez un nouveau puits dans le programme cflow. Sous la rubrique «Limites Run&quot; régler le temps pendant 2 min. Sous la rubrique «fluidique», sélectionnez «rapide» et «Run». </li><li> Une fois le délai de 2 min est terminée, cliquez sur le bouton &quot;Supprimer des exemples de données&quot;. </li></ol> 6 Comptage des cellules en utilisant le cytomètre de flux <ol><li> Remplacer l&#39;eau par l&#39;échantillon à être compté. Set &quot;Limites Exécuter &quot;pour 30 secondes,&quot; Fluidics &quot;à&quot; rapide &quot;puis sélectionnez&quot; Exécuter &quot;. </li><li> Après le délai de 30 secondes est terminée, cflow ainsi fournira les événements / ul sous &quot;Last Run.&quot; Répétez comptage pour chaque culture. REMARQUE: Avant de cellules atteignent 1 x 10 7 cellules / ml, procéder à essai de dilution. Les cellules doivent être interrompues après un essai de dilution est terminée. Les cellules en culture pendant de plus longues périodes perdent leur capacité à répondre à des conditions environnementales. </li></ol> 7. fluorescence de mesure utilisant le cytomètre de flux <ol><li> Pour évaluer la fluorescence, réglez «Limites Run&quot; à 10.000 événements, et «fluidique» à «ralentir». Sélectionnez «seuil Set&quot;. Sous &quot;Seuil primaire&quot;, sélectionnez &quot;éliminer de manière permanente les événements sur», «FSC-H&quot; (dans menu déroulant) et entrez moins de 30.000. Cliquez sur &quot;Appliquer&quot;, puis &quot;close&quot;. </li><li> Sélectionnez l&#39;220; &quot;dans une des nouvelles fenêtres de tracé et sélectionnez&quot; histogramme FSC-A &quot;De la liste déroulante, sélectionnez&quot; FL1-A &quot;. REMARQUE: mesures FL1-A fluorescence dans la longueur d&#39;onde de 530 nm. </li><li> Sélectionnez &quot;Exécuter&quot; et répétez l&#39;opération pour toutes les cultures. </li><li> Exécuter solution de nettoyage à travers la ligne fluidique pendant 2 min et de l&#39;eau pendant 2 min. </li></ol> 8. dilution dosages <ol><li> Passez cellules à une densité de 1 x 10 5 cellules / ml dans 3 ml de SDM79 en 25 cm ballon de 2 culture et de mesurer floraison immédiatement après le passage, puis à 3 h et 24 h. </li></ol> Analyse 9. données <ol><li> Sélectionnez &quot;Analyser&quot; onglet sur cflow Plus. </li><li> Cliquez sur le bouton &quot;Histogramme&quot; sous &quot;Faire une nouvelle parcelle.&quot; Sélectionner &quot;FSC-A&quot; et une liste de menu déroulant apparaîtra. Sélectionnez le canal &quot;FL1-A.&quot; </li><li> Mettez en surbrillance un puits à analyser. Sélectionnez le bouton &quot;Gate&quot;, et d&#39;en tirer manuellement une vannepour la population d&#39;intérêt. </li><li> Flow Plus fournira cellule &quot;comte&quot; dans cette porte et &quot;% de ce complot&quot;. </li></ol>

<ol><li>Stuart, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetoplastids%3A+related+protozoan+pathogens%2C+different+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases.</a> J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).</li>
<li>Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+glycosomes+during+life-cycle+differentiation+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei.</a> Autophagy. 4, 294-308 (2008).</li>
<li>Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+related+processes+in+trypanosomatids%3A+insights+from+genomic+and+bioinformatic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses.</a> Autophagy. 2, 107-118 (2006).</li>
<li>Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+functions+of+glycosomes+in+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids.</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).</li>
<li>Michels, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomes%2C+glyoxysomes+and+glycosomes+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review).</a> Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).</li>
<li>Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+peroxisomes+and+glycosomes%3A+trypanosomatid+glycosome+assembly+is+a+promising+new+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).</li>
<li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).</li>
<li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).</li>
<li>Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+aspects+of+glycosomes+in+trypanosomatidae+-+new+data+and+views%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Today%22%5BJournal%5D)">Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views.</a> Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).</li>
<li>Michels, P. A., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+kinetoplastid+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">The evolution of kinetoplastid glycosomes.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).</li>
<li>Hannaert, V., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+function%2C+and+biogenesis+of+glycosomes+in+kinetoplastida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).</li>
<li>Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmentally+regulated+glycosome+protein+composition+in+the+african+trypanosome%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome.</a> Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).</li>
<li>Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+of+glycosomes+from+bloodstream+form+and+procyclic+culture+form+Trypanosoma+brucei+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei.</a> Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).</li>
<li>Opperdoes, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+carbohydrate+metabolism+in+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).</li>
<li>Kessler, P. S., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+role+of+compartmentation+of+glycolysis+in+procyclic+form+Trypanosoma+brucei%3A+RNA+interference+studies+of+PEX14%2C+hexokinase%2C+and+phosphofructokinase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).</li>
<li>Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+trypanosomatids%3A+adaptation+to+available+carbon+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).</li>
<li>Coustou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-induced+remodeling+of+intermediary+and+energy+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).</li>
<li>Lamour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei+is+down-regulated+in+the+presence+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).</li>
<li>Vertommen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+glycosomal+and+mitochondrial+proteins+in+the+two+major+life-cycle+stages+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).</li>
<li>Vickerman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+cycles+and+biology+of+pathogenic+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22British+medical+bulletin%22%5BJournal%5D)">Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes.</a> British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).</li>
<li>Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elongation+and+clustering+of+glycosomes+in+Trypanosoma+brucei+overexpressing+the+glycosomal+Pex11p%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p.</a> The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).</li>
<li>Saveria, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PEX19-binding+motifs+required+for+protein+targeting+to+mammalian+peroxisomal+and+trypanosome+glycosomal+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes.</a> Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).</li>
<li>Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+trypanosomatid+PEX19%3A+functional+characterization+reveals+impact+on+cell+growth+and+glycosome+size+and+number%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number.</a> Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).</li>
<li>Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+Trypanosoma+cruzi%27s+glycosomal+adenylate+kinase+containing+a+peroxisomal+targeting+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+parasitology%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal.</a> Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).</li>
<li>Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+peroxisomal+compartment+in+living+mammalian+cells%3A+dynamic+behavior+and+association+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules.</a> The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).</li>
<li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).</li>
<li>Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+endoplasmic+reticulum+to+peroxisome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation.</a> Cell. 122, 85-95 (2005).</li>
<li>Furuya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+is+toxic+to+glycosome-deficient+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Glycosomes sont des organites essentiels, dynamiques, spécifiques du parasite. Les processus qui régissent la biogenèse, la maintenance, la prolifération et le remodelage de ces organites sont probablement des cibles de médicaments qui pourraient être exploitées à des fins thérapeutiques. Malgré potentiellement forte abondance de ces cibles de médicaments, le domaine de la glycosome biogenèse a pris du retard l&#39;étude des processus similaires dans d&#39;autres organismes, principalement en raison de l&#39;absence d&#...

Trypanosoma brucei cause la maladie du sommeil en Afrique chez les humains et une maladie débilitante, nagana, chez les bovins. Médicaments utilisés dans le traitement de ces maladies sont vétustes et très toxique, les vaccins ne sont pas disponibles, et le potentiel pour le développement de la résistance aux médicaments nécessitent la recherche de nouvelles cibles de médicaments 1. Au cours de son cycle de vie, T. brucei, alterne entre un insecte vecteur et hôte mammifère; deux hôtes qui présentent des environnements très différents dans lesquels le parasite doit survivre. Un certain nombre de changements métaboliques et morphologiques se produisent comme le parasite est exposé à des conditions environnementales différentes. Certains des changements les plus importants sont observés dans microbodies spécifiques parasites seule membrane délimitée, appelé glycosomes 13. Les niveaux de glucose sont relativement élevés (~ 5 mM) dans le sang et la circulation sanguine des parasites (BSF) génèrent ATP exclusivement par wh de la glycolysemétabolisme mitochondrial ile est réprimée 14. Contrairement à d&#39;autres eucaryotes dans laquelle se produit la glycolyse dans le cytoplasme, T. brucei compartimente la plupart des enzymes de la glycolyse dans glycosomes 14,15. Les parasites sont prises par la mouche tsé-tsé au cours d&#39;un repas de sang et connaissent une baisse de la glycémie, qui tombe à des niveaux indétectables dans les 15 minutes d&#39;être ingéré par la mouche. Le métabolisme de l&#39;insecte, de la forme procyclique (PCF), parasites est plus souple et de glucose, ainsi que des acides aminés tels que la proline, peuvent être utilisés dans la synthèse de l&#39;ATP de 16 à 18. Études protéomiques comparatives révèlent les changements du cycle de vie dépendent en glycosomale et protéines mitochondriales avec des protéines glycolytiques augmentation dans la circulation sanguine des parasites et des protéines mitochondriales impliquées dans le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire 13,19. Alors que de nombreuses études ont porté sur les différences entre BSF et glycosomes PCF, on sait peu sur les changements dans glycosomes PCF qui se produisent en réponse à envchangements ironmental. Dans le gros intestin de la mouche, les niveaux de glucose sont faibles à des augmentations transitoires au cours d&#39;une alimentation 20. Dans la plupart des études in vitro, les parasites PCF sont cultivées dans des milieux contenant du glucose. Cependant, des études récentes ont démontré que les changements du métabolisme PCF significativement en réponse au glucose disponibilité 17. En l&#39;absence de glucose, la proline et la proline absorption augmentation de l&#39;activité déshydrogénase 18. Ce changement dans le métabolisme mitochondrial est probablement accompagnée par un changement de la composition et de la morphologie de glycosome, cependant, ceci n&#39;a pas été directement évalué. Microscopie électronique et de fluorescence sont des techniques courantes utilisées pour étudier la dynamique de glycosome en T. brucei 2,21-24. Ces protocoles sont le temps et de main-d&#39;œuvre, coûteux et difficiles à adapter aux études en temps réel et des protocoles à haut débit. Pour surmonter cette limitation, un système rapporteur fluorescent u-organitesed pour étudier organites dans les systèmes de mammifères et de levure a été modifié pour une utilisation dans T. brucei 12. Systèmes rapporteurs fluorescents-organelles ont été largement utilisés dans des eucaryotes supérieurs tels que des levures, des plantes, des cellules de mammifères et de 25 à 27. Dans de tels systèmes, une protéine fluorescente est fusionnée à une séquence d&#39;acides aminés qui cible la protéine à des organites spécifiques. La dégradation ou la synthèse des protéines cibles est mesurée par fluorescence et des changements dans la composition des organites sont reflétés par des changements dans la fluorescence de la cellule. Lorsque le cadre du renforcement de la protéine fluorescente jaune (EYFP) de lecture ouvert est fusionnée à une séquence de type II de ciblage des peroxysomes (PTS2) 12, la protéine PTS2eYFP est importé dans glycosomes matures, importation compétent et de la fluorescence peut être contrôlé par cytométrie de flux. Les variations de composition glycosome se traduisent par des changements dans la fluorescence cellulaire. Ce système peut aider à résolVing les mécanismes qui régulent les changements induits par l&#39;environnement dans glycosome composition. Ce manuscrit décrit la génération d&#39;un système glycosome rapporteur dans parasites PCF en collaboration avec la cytométrie de flux pour suivre la dynamique de glycosome en temps réel à des parasites vivants et fournit un exemple de la façon dont il a été utilisé pour suivre l&#39;évolution de glycosome composition en réponse à des environnements différents. En résumé, glycosome composition est influencée par les concentrations de glucose extracellulaire et le passage des cultures en phase logarithmique dans un milieu frais déclenche des changements dans glycosome composition. Ce système peut être modifié pour étudier le comportement dynamique des autres organites dans les trypanosomes et les autres parasites.

<table><tbody><tr><td>Adénosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A10781</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A15804</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>CalBiochem</td><td>1820</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>Acide p-aminobenzoïque</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102569</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)</td><td>Sigma</td><td>B6891</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Fisher</td><td>BP232-1</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>VWR</td><td>BDH0224</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td>Ingrédient</td></tr><tr><td>Cytomix EZNA Gel Kit d’extraction</td><td>Omega Biotek</td><td>D2500-01</td><td>Purification de l’ADN</td></tr><tr><td>Sérum</td><td>Fisher</td> <td>de qualité recherche03-600-511</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>Acide folique</td><td>ICN Biomedicals</td><td>101725</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>Glucosamine HCl</td><td>ICN Biomedicals</td><td>194671</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>GIBCO</td><td>15023-021</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>CalBiochem</td><td>3520</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Acros Organics</td><td>Ac15892-0010</td><td>Média de congélation</td></tr><tr><td>Graces insecte cell media poudre</td><td>GIBCO</td><td>11300-043</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>Guanosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A11328</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79</td></tr><tr><td>Ingrédient Chlorure</td> <td>de magnésiumFisher</td><td>BP214-500</td><td>Cytomix Ingrédient</td></tr><tr><td>L-Méthionine</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>MEM Acides aminés (50x)</td><td>Cellgro</td><td>25-030-CI</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>NEAA Mixture (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (1x) avec L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>10-010-CM</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>Biocarbonate de sodium</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine Solution</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>L-Phénylalanine</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102623</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>Cytomix </td></tr><tr><td>Ingrédient Phosphate de potassium dibasique anhydre</td><td>Fisheer</td><td>P290-212</td><td>Ingrédient du cytomix</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Fisher</td><td>BP392-100</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Acros Organics</td><td>56-45-1</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>Acide pyruvique, sel de sodium</td><td>Acros Organics</td><td>113-24-6</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>L-Taurine</td><td>TCI America</td><td>A0295</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>L-Thréonine</td><td>Acros Organics</td><td>72-19-5</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>ICN Biomedicals</td><td>103183</td><td>SDM79 Ingrédient</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D6492-02</td><td>Purification de l’ADN</td></tr><tr><td>Tampon de liaison</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR041</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lavage SPW</td> pour la purification de l’ADN <td>Omega Biotek</td><td>PDR045</td><td>Purification de l’ADN</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Biorad</td><td>165-2660 Transformation du</td><td>trypanosome</td></tr><tr><td>4 mm Cuvettes d’électroporation</td><td>VWR</td><td></td><td>Transformation du trypanosome</td></tr></tbody></table>

utilisation de protéines fluorescentes pour surveiller glycosome dynamics dans le trypanosome africain

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei est un parasite qui provoque kinétoplastide la trypanosomiase humaine africaine (THA) ou maladie du sommeil, et une maladie débilitante, nagana, chez les bovins 1. Les parasite alterne entre la circulation sanguine de l&#39;hôte mammifère et le vecteur de mouche tsé-tsé. La composition de nombreux organites cellulaires change en réponse à ces différentes conditions extracellulaires 5.2. Glycosomes sont peroxysomes hautement spécialisées dans laquelle beaucoup des enzymes impliquées dans la glycolyse sont compartimentés. Changements dans la composition glycosome d&#39;une manière intellectuelle et ICPE 4-11. Actuellement, les techniques les plus couramment utilisées pour étudier la dynamique glycosome sont la microscopie électronique et fluorescence; techniques qui coûtent cher, de temps et de main-d&#39;œuvre, et pas facilement adapté à l&#39;analyse à haut débit. Pour surmonter ces limitations, un système rapporteur fluorescent dans glycosomece qui a renforcé la protéine fluorescente jaune (EYFP) est fusionnée à une séquence de ciblage de peroxysome (PTS2), qui dirige la protéine de fusion à glycosomes 12, a été établi. Lors de l&#39;importation de la protéine de fusion PTS2eYFP, glycosomes deviennent fluorescentes. la dégradation des organites et le recyclage entraîne la perte de la fluorescence qui peut être mesuré par cytométrie de flux. Un grand nombre de cellules (5000 cellules / sec) peuvent être analysées en temps réel avec une préparation de l&#39;échantillon tel que la fixation et le montage. Ce procédé offre un moyen rapide de détection de changements dans la composition d&#39;un organite, en réponse aux fluctuations des conditions ambiantes.

Dans ce système, un changement dépendant du glucose dans glycosome composition a été observée. Lorsque les cellules sont cultivées dans des milieux contenant du glucose, deux populations sont observés; un brillant et un faible (figure 2A). Cellules sombres abritent glycosomes immatures, qui ne sont pas importés du PTS2eYFP tandis que les cellules lumineuses abritent un mélange de glycosomes matures et immatures 12. Lorsque le glucose est présent dans les médias, mauvaise localisation des prot...

La dynamique des glycosomes dans les trypanosomes africains est difficile à étudier par les techniques traditionnelles de biologie cellulaire telles que la microscopie électronique et la microscopie à fluorescence. Comme moyen d’observer le comportement dynamique des organites, un système rapporteur d’organites fluorescents a été utilisé en conjonction avec la cytométrie en flux pour surveiller la dynamique des glycosomes en temps réel chez les parasites vivants.

Utilisation de protéines fluorescentes pour surveiller glycosome Dynamics dans le trypanosome africain

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer en temps réel les changements de composition glucidique dans des cellules vivantes. Cela est réalisé en exprimant une protéine fluorescente fusionnée à une séquence ciblant les peroxyosomes, appelée PTs deux. La protéine de fusion est importée dans les glycozones matures, qui deviennent ainsi des organites fluorescents.La dégradation et le recyclage entraînent une perte de fluorescence pouvant être suivie par cytométrie en flux. Les cellules sont exposées à différentes conditions environnementales afin d'identifier les facteurs déclenchant la remodélisation glycosidique. Les résultats montrent que la composition glycosidique varie en réponse aux changements environnementaux, en fonction des variations de la fluorescence cellulaire lors du passage des cellules d'un milieu pauvre en nutriments à un milieu riche en nutriments. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la microscopie électronique et la microscopie de fluorescence, réside donc dans sa capacité à analyser en temps réel des milliers de cellules.La procédure sera démontrée par Sarah Bauer, étudiante diplômée, et Megan

using-fluorescent-proteins-to-monitor-glycosome-dynamics-african

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette expérience visualisé est un guide pour utiliser un clone moléculaire fluorescent du VIH pour vivre des expériences d'imagerie confocale.

Visualisation cellule à cellule de transfert du VIH en utilisant des clones fluorescents du VIH et Live microscopie confocale

Nous décrivons des méthodes d'imagerie nous utilisons pour étudier la distribution et la mobilité des protéines fluorescentes transfectées résidant dans le réticulum endoplasmique (RE) par l'intermédiaire de l'imagerie confocale de cellules vivantes. Nous analysons également ultrastructuralement l'effet de leur expression sur l'architecture de ce compartiment subcellulaire.

Visualisation de réticulum endoplasmique sous-domaines dans les cellules cultivées

La translocation effectrice dans les cellules hôtes via un système de sécrétion de type III est une stratégie de virulence courante chez les bactéries à Gram négatif. Un test basé sur la fusion d’effecteurs bêta-lactamases pour l’analyse quantitative de la translocation a été appliqué. Dans les cellules infectées par Yersinia, la conversion d’un rapporteur FRET par la bêta-lactamase est surveillée à l’aide d’une microscopie à balayage laser.

Analyse de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effecteur translocation dans les cellules hôtes à l&#39;aide de bêta-lactamase effecteur Fusions

Ce manuscrit décrit l’utilisation d’une souche bioluminescente de trypanosomes africains pour permettre le suivi de l’infection à un stade avancé et démontre comment l’imagerie en direct in vivo peut être utilisée pour visualiser les infections au sein du système nerveux central en temps réel.

Bioluminescence Imaging pour détecter Late Stage infection de la trypanosomiase africaine

L’ajout d’une étiquette à une protéine est un moyen puissant de mieux comprendre sa fonction. Ici, nous décrivons un protocole permettant de marquer de manière endogène des centaines de protéines de Trypanosoma brucei en parallèle afin que le marquage à l’échelle du génome soit réalisable.

Haut-débit Gene Tagging dans<em&gt; Trypanosoma brucei</em

L'imagerie de la morphogenèse des embryons d'insectes avec la microscopie de fluorescence à base de feuille de lumière est devenu état de la technique. Ce protocole décrit et compare trois techniques de montage appropriées pour les embryons Tribolium castaneum, introduit deux nouvelles lignées transgéniques sur mesure bien adapté pour l' imagerie en direct, discute des contrôles de qualité essentiels et indique les limites expérimentales actuelles.

Feuille à base de lumière de la vie Microscopie Fluorescence ou fixe et Stained<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embryons

Les auteurs décrivent comment les techniques micro - et photomanipulation comme FRAP et photoactivation permettent la détermination des paramètres de la motilité et la dynamique spatio-temporelle des protéines au sein de la migration des cellules. Afficheurs expérimentales incluent dynamique subcellulaire et chiffre d’affaires de régulateurs de la motilité ou du cytosquelette d’actine sous-jacent.

Techniques de micromanipulation permettant l’analyse de la dynamique morphogénétique et chiffre d’affaires des organismes de réglementation du cytosquelette

Interactions protéines-protéines sont essentielles pour les systèmes biologiques, et des études de la cinétique de liaison donnent un aperçu de la dynamique et la fonction de complexes protéiques. Les auteurs décrivent une méthode qui quantifie les paramètres cinétiques d’une protéine complexe à l’aide de transfert d’énergie de fluorescence par résonance et la technique de flux stoppé.

À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

Ici, des méthodes non invasives sont décrites pour la localisation des protéines de la membrane photoréceptrice et l’évaluation de la dégénérescence rétinienne dans l’œil composé de la drosophile à l’aide de la fluorescence eGFP.

Étude du trafic de protéines membranaires dans les cellules photoréceptrices de la drosophile à l’aide de protéines marquées eGFP

Ce protocole décrit le marquage et l’injection par fluorescence personnalisés à base d’anticorps dans les embryons précoces de drosophile pour permettre l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou de modifications post-traductionnelles difficiles à détecter à l’aide des approches traditionnelles GFP/mCherry-tag.

Visualisation des protéines de faible abondance et des modifications post-traductionnelles dans des embryons de drosophile vivants par injection d’anticorps fluorescents

Nous décrivons une méthode pour étudier comment le pH répond aux signaux environnementaux dans les glycosomes de la forme sanguine des trypanosomes africains. Cette approche implique une sonde de protéine héréditaire sensible au pH en combinaison avec la cytométrie en flux pour mesurer la dynamique du pH, à la fois en tant que test temporel et dans un format de criblage à haut débit.

Mesure des changements dynamiques du pH glycosomal chez Trypanosoma brucei vivant

Découvrez la dynamique des glycosomes dans les trypanosomes africains en utilisant des protéines fluorescentes et la cytométrie en flux. Cette méthode permet l'analyse en temps réel de milliers de cellules vivantes.

Utilisation de protéines fluorescentes pour surveiller glycosome Dynamics dans le trypanosome africain

Explorer plus de vidéos