Name: Une nouvelle méthode de clarification de visualiser biliaire dégénérescence Pendant foie métamorphose de la lamproie marine ( Petromyzon marinus) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Découvrez une méthode CLARITY modifiée pour visualiser la dégénérescence biliaire chez la lamproie marine Petromyzon marinus. Cette technique permet d'analyser les changements structuraux et cellulaires pendant la métamorphose.

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Les auteurs reconnaissent la contribution de la Station biologique de Hammond Bay, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Nous remercions également le Dr Melinda cadre au Centre de microscopie avancée à l&#39;Université d&#39;État du Michigan pour son soutien technique à balayage laser microscopie confocale. Cette étude est financée par des subventions de la Commission des pêcheries des Grands Lacs à YWCD et WML.

Une. Préparation Solution <ol><li> Faire une L 10x 0,1 M de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4): Peser 26,2 g de phosphate de sodium (monobasique), 115 g de phosphate de sodium (dibasique), et 87,66 g de NaCl. Dissoudre dans environ 800 ml de H 2 O distillée, ajuster le pH, et porter le volume à 1 L avec de l&#39;eau distillée 2 O. <ol><li> Faire une solution saline L 0,1 M de tampon phosphate (pH 7,4): Prendre 100 ml 10x PBS et ajouter 900 ml de H 2 O. distillée </li><li> Assurez 1 L 0,1 M de tampon phosphate salin (pH 7,4) avec 0,1% de Triton X-100: Prendre 100 ml 10x PBS, ajouter 1 ml de Triton X-100, et porter le volume à 1 L avec de l&#39;eau distillée 2 O. </li></ol></li><li> Assurez 1 L 10x 0,1 M tampon phosphate (PB, pH 7,4): Peser 26,2 g de phosphate de sodium (monobasique) et 115 g de phosphate de sodium (dibasique). Dissoudre dans environ 800 ml de H 2 O distillée, ajuster le pH, et porter le volume à 1 L avec de l&#39;eau distillée 2 O. <ol><li> Assurez 1 L 0,1 M de tampon phosphate (pH 7,4): Prendre 100 ml 10x PB,et ajouter 900 ml d&#39;eau distillée H 2 O. </li><li> Assurez 1 L 0,1 M de tampon phosphate (pH 7,4) avec 0,1% de Triton X-100: Prendre 100 ml 10x PB, ajouter 1 ml de Triton X-100, et porter le volume à 1 L avec de l&#39;eau distillée 2 O. </li></ol></li><li> Ajoutez la solution de monomère d&#39;hydrogel de 400 ml (4% d&#39;acrylamide, 0,25% de bis-acrylamide, du paraformaldéhyde 4%, 0,0075% de persulfate d&#39;ammonium, 0,0005% de saponine dans du PBS 0,1 M): Peser 0,3 g de persulfate d&#39;ammonium et 0,2 g de saponine. Ajouter 210 ml de H 2 O distillée, 40 ml 40% d&#39;acrylamide, 10 ml 2% de bis-acrylamide, 40 ml 10x PBS (pH 7,4), 100 ml 16% de paraformaldéhyde, et bien mélanger. </li><li> Préparer une solution de compensation de 4 L (4% de SDS dans 0,2 M d&#39;acide borique): Peser 49,464 g d&#39;acide borique et 160 g de SDS. Dissoudre dans environ 3,5 L H 2 O distillée, ajuster le pH à 8,5 avec NaOH, et porter le volume à 4 L. </li><li> Assurez 1 L solution de glycérol à 80%: Mesurer 800 ml de glycérol, ajouter 200 ml de H 2 O distillée, et bien mélanger. </li></ol> 2. Préparation des tissus <ol><li> Préparer la solution de monomère d&#39;hydrogel et aliquote de 10 ml de chaque tube de centrifugation de 15 ml. </li><li> On dissèque le tissu et fixer l&#39;ensemble dans l&#39;hydrogel pendant 2 jours à 4 ° C. Assurez-vous que la solution d&#39;hydrogel est d&#39;au moins 10 fois le volume du tissu. </li><li> Amener le tissu fixé d&#39;hydrogel (dans le tube de centrifugation de 15 ml) à une hotte de laboratoire. </li><li> Polymériser l&#39;hydrogel tissu fixé en ajoutant 5 pi de TEMED, bien mélanger et laisser reposer dans la hotte à température ambiante pendant 2-3 heures. </li><li> Retirer soigneusement le gel excès. Remarque: gel supplémentaire sera entraver le processus de compensation et de la pénétration d&#39;anticorps pendant la coloration. </li><li> Incuber le tissu fixé dans 10 ml de solution de compensation dans un shaker incubateur réglé à 70 tours par minute et 50 ° C pendant plusieurs jours jusqu&#39;à ce que le tissu devient transparent. Changer solution de compensation au moins une fois par jour et enlever le gel en excès du tissu lors du changement de la solution de compensation. </li><li> Rincer le tissu dans 10 ml de 0,1 M de PB avec 0,1% de Triton X-100 à 70 rh et à 37 ° C pendant une nuit. Répéter cette étape trois fois, et enlever le gel en excès du tissu lors du changement de la solution tampon. </li><li> Faire incuber le tissu clarifié dans la solution d&#39;anticorps primaire dans PB avec 0,1% de Triton X-100 à 70 rpm et 37 ° C pendant 2 jours. Remarque: solution suffisamment d&#39;anticorps primaire pour submerger les tissus. </li><li> Rincer le tissu dans 10 ml de PB avec 0,1% de Triton X-100 à 70 rpm et 37 ° C pendant une nuit. Répéter cette étape trois fois, et enlever le gel en excès du tissu lors du changement de la solution tampon. </li><li> Effectuez les étapes suivantes dans une pièce sombre ou en faible lumière. Couvrir les échantillons de papier d&#39;aluminium pour éviter photoblanchiment. </li><li> Faire incuber le tissu avec la solution clarifiée fluorescent de l&#39;anticorps secondaire en PB avec 0,1% de Triton X-100 et le sérum de blocage 70 tours par minute et à 37 ° C pendant 1 jour. </li><li> Rincer le tissu dans 10 ml de PB avec 0,1% de Triton X-100 à 70 rpm et 37 ° C pendant une nuit. Répétez cette étape 3 fois et enlever le gel excès felon le tissu lors du changement de la solution tampon. </li><li> Rincer le tissu dans 10 ml de PBS à 70 rpm et 37 ° C pendant une nuit. Répéter cette étape trois fois, et enlever le gel en excès du tissu lors du changement de la solution tampon. </li><li> Faire incuber le tissu clarifié dans 80% de glycerol à 70 rpm et 37 ° C pendant une nuit. </li><li> Stocker le tissu teinté fluorescente à 4 ° C avant la microscopie confocale. </li></ol>

<ol><li>Applegate, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+sea+lamprey+%28Petromyzon+marinus%29+in+Michigan%5BTitle%5D)+AND+%22US+Fish+and+Wildlife+Service+Special+Science+Report+on+Fishery+Service%22%5BJournal%5D)">Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan.</a> US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).</li>
<li>Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHardisty%2C+MW+%22The+biology+of+lampreys%22">The biology of lampreys</a>. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).</li>
<li>Youson, J. H., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+description+of+the+stages+in+the+metamorphosis+of+the+anadromous+sea+lamprey%2C+Petromyzon+marinus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).</li>
<li>Boomer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocyte+apoptosis+is+an+early+event+during+induced+metamorphosis+in+the+sea+lamprey%2C+Petromyzon+marinus+L%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).</li>
<li>Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+and+results+of+operative+management+of+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Technique and results of operative management of biliary atresia.</a> World J. Surg. 2, 571-580 (1978).</li>
<li>Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+patients%E2%80%99+outcome+post-Kasai+operation%3A+a+19-year+experience+with+modification+of+the+hepatic+portoenterostomy+and+applying+a+novel+steroid+therapy+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen.</a> Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).</li>
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<li>Sidon, E. W., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+changes+in+the+liver+of+the+sea+lamprey%2C+Petromyzon+marinus+L.%2C+during+metamorphosis%3A+I.+Atresia+of+the+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts.</a> J. Morphol. 177, 109-124 (1983).</li>
<li>Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+synthesis+and+secretion+of+bile+salts+as+an+adaptation+to+developmental+biliary+atresia+in+the+sea+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokeratins+in+the+liver+of+the+sea+lamprey+%28Petromyzon+marinus%29+before+and+after+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis.</a> Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).</li>
<li>Youson, J. H., Ogilvie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+features+of+degeneration+of+the+gallbladder+during+lamprey+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia.</a> Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).</li>
<li>Morii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+apoptosis+in+the+cystic+duct+during+metamorphosis+of+a+Japanese+lamprey%2C+Lethenteron+reissneri%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri.</a> Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Ce protocole est modifié à partir d&#39;une nouvelle méthode appelée «clarté» 12, qui réticule tissu intact avec polyacrylamide pour former un hydrogel nanoporeux, puis supprime le membrane plasmique des tissus pour assurer la transparence optique et la perméabilité macromoléculaire. «Clarté» permet l&#39;imagerie des tissus intacts de projection à long terme et le câblage du circuit local dans le système nerveux. Cette nouvelle méthode peut être utilisée pour visualiser l&#39;ensemble du système biliaire dan...

La lamproie marine se développer à travers trois étapes distinctes vie 1,2. Larvaire lamproie (L) passent plus de temps dans des terriers comme filtreurs benthiques. Après avoir traversé sept étapes métamorphiques de changements dramatiques dans la morphologie externe et la réorganisation des organes internes 3, les mineurs résultant (JV) entrent dans un stade parasitaire au cours de laquelle ils se nourrissent de sang et les liquides tissulaires de poisson hôte, l&#39;augmentation de la masse corporelle de plus de 100 fois . Après 1.0 à 1,5 ans d&#39;alimentation sur le poisson hôte dans l&#39;océan ou les grands lacs, les adultes cessent de s&#39;alimenter au début du printemps et migrent dans les rivières pour frayer et mourir 1,2. Au cours de métamorphose, le foie de la lamproie marine perd la vésicule biliaire et l&#39;ensemble de l&#39;arbre biliaire, un phénotype mutant évolutif qui imite la maladie infantile humaine atrésie des voies biliaires. Atrésie des voies biliaires infantile est une maladie du foie pédiatrique rare avec de graves complications médicales 4,5,6,7, 8,9,10, mais la pathogénie et l&#39;étiologie de l&#39;atrésie des voies biliaires sont en grande partie inconnus 4. Les patients présentant une atrésie des voies biliaires meurent dans les deux ans après la naissance, sauf si une intervention chirurgicale (procédure Kasai) est effectuée 5. Par la suite, ces patients ont besoin d&#39;une vaste prise en charge clinique et souvent une transplantation du foie 6. De nombreuses théories de l&#39;atrésie des voies biliaires étiopathogenèse ont été proposées, telles que l&#39;infection virale, une malformation congénitale, maladie auto-immune, et insulte toxique. Toutefois, la contribution de chacun à l&#39;élaboration d&#39;atrésie des voies biliaires restent peu concluantes 7,8,9,10. Contrairement nourrissons qui souffrent atrésie des voies biliaires pathologique, la lamproie marine subir de développement programmé atrésie des voies biliaires sans necroinflammation vaste, fibrose ou de cirrhose 10. Les animaux peuvent souffrir cholestase transitoire pendant ce processus 10, mais s&#39;adapter à cet état ​​de développementpar l&#39;intermédiaire de la synthèse de novo et de la sécrétion de sels biliaires dans l&#39;intestin après l&#39;atrésie biliaire développementale, en plus des mécanismes connus tels que la réduction de la synthèse des sels biliaires dans le foie 11. Ce processus de développement dans la grande lamproie marine fournit la seule occasion connue pour examiner la progression de l&#39;atrésie des voies biliaires. Une méthode nouvellement développé appelé «clarté» permet imagerie à haute résolution dans les systèmes nerveux des mammifères complexes en transformant tissu intact dans un hydrogel nanoporeux optiquement transparent 12. Utilisation de la lamproie marine foie et un protocole de CLARITY modifié, l&#39;imagerie des tissus intacts de la dégénérescence biliaire peut être documentée tout au long de la métamorphose du foie.

<table><tbody><tr><td>40 % d’acrylamide&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2 % bis-acrylamide&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>persulfate d’ammonium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>acide borique</td><td>Sigma</td><td>B7901-1KG</td><td></td></tr><tr><td>saponine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>dodécylsulfate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>L337-500G</td><td></td></tr><tr><td>phosphate de sodium (monobasique)</td><td>Sigma</td><td>04269-1KG</td><td></td></tr><tr><td>phosphate de sodium (dibasique)</td><td>Sigma</td><td>S5136-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>glycérol&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>G9012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>16 % paraformaldéhyde&nbsp ;</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>pastilles de NaOH&nbsp ;</td><td>EMD</td><td>SX0590-3</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubes à centrifuger</td><td>Toute marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Outils de dissection&nbsp ;</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une nouvelle méthode de clarification de visualiser biliaire dégénérescence pendant foie métamorphose de la lamproie marine ( petromyzon marinus)

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey (Petromyzon marinus)

Atrésie des voies biliaires est une maladie rare de l&#39;enfance, avec une fréquence d&#39;environ 1 à 15 000 dans le sud-est des États-Unis, mais plus fréquente dans les pays en Asie de l&#39;Est, avec une fréquence déclarée de 1 à 5000 à Taiwan. Bien que beaucoup est connu au sujet de la gestion de l&#39;atrésie des voies biliaires, sa pathogénie est encore insaisissable. La lamproie marine (Petromyzon marinus) offre une occasion unique d&#39;examiner le mécanisme et la progression de la dégénérescence des voies biliaires. La lamproie marine développer à travers trois étapes de la vie distincts: larves, parasites, et adultes. Lors du passage de larves à des mineurs parasite, la lamproie marine subir la métamorphose de la réorganisation dramatique et le remodelage de la morphologie externe et les organes internes. Dans le foie, l&#39;ensemble du système biliaire est perdu, y compris la vésicule biliaire et des voies biliaires. Une méthode nouvellement développé appelé «clarté» a été modifié pour clarifier l&#39;ensemble du foie et la jonction avec l&#39;intestin dans métamorphique lamproie marine. Laprocessus de dégénérescence biliaire a été visualisée et discerné lors de la lamproie marine métamorphose en utilisant la numérisation laser microscopie confocale. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier atrésie des voies biliaires dans un modèle animal unique.

Plusieurs événements importants se produisent dans le développement du système hépatobiliaire au cours de la lamproie marine métamorphose. La voie biliaire et de la vésicule biliaire et subissent une apoptose dégénérée (Figure 1). La combinaison de la méthode de clarification modifié et coloration au foie marqueur de cellules cytokératine 19 (CK19, présents dans les deux cholangiocytes et les hépatocytes avant et après la métamorphose 13) et Bcl2 marqueur anti-apoptotiques en utilisant la mic...

La lamproie marine perdre la vésicule biliaire et des voies biliaires au cours de la métamorphose, un processus similaire à l&#39;atrésie biliaire humaine. Une nouvelle méthode de fixation et de clarification (CLARITY) a été modifié pour visualiser l&#39;ensemble de l&#39;arbre biliaire en utilisant la numérisation laser microscopie confocale. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier la dégénérescence biliaire.

Une nouvelle méthode de clarification de visualiser biliaire dégénérescence Pendant foie métamorphose de la lamproie marine ( Petromyzon marinus)

Biliary atresia is a rare disease of infancy, with an estimated 1 in 15,000 frequency in the southeast United States, but more common in East Asian ...

L'objectif général de cette procédure est de clarifier l'ensemble du foie et la jonction avec l'intestin afin d'effectuer des analyses globales, structurales et cellulaires de la dégénérescence biliaire chez la lamproie métamorphique C. Cela est réalisé en fixant d'abord les tissus dans une solution monomère d'hydrogel.Ensuite, l'hydrogel est polymérisé avec les tissus fixés. Puis, la membrane plasmique du tissu fixé est éliminée et le tissu devient transparent. Enfin, une coloration immunofluorescente est réalisée, et l'imagerie par microscopie laser et microscopie confocale est utilisée pour révéler les modifications structurelles et cellulaires globales au cours de la dégénérescence biliaire chez la lamproie métamorphique.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine biomédical, telles que les connectomes dans le système nerveux central, et dans notre cas, la dégénérescence biliaire durant la métamorphose au point sérique. Les implications de cette technique s'étendent vers le traitement ou le diagnostic de la maladie biliaire humaine ou de l'atrésie, car cette maladie congénitale rare du nourrisson partage des caractéristiques similaires avec la dégénérescence ary durant la métamorphose au point sérique. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons trouvé un article scientifique dans Nature et présenté la vidéo en ligne lors de notre réunion de laboratoire, démontrant la procédure réalisée par Ann Scott, étudiante diplômée de notre laboratoire, après avoir préparé la solution saline tamponnée au phosphate et le tampon phosphate ou pb, selon le protocole décrit.Dans une hotte, préparez 400 millilitres de gel hydrogel en combinant de l'eau distillée, 40 % d'acrylamide, 2 % de bis-acrylamide, 10 X PBS, 16 % de paraformaldéhyde, de la saponine et du persulfate d'ammonium. Préparez un litre de solution de clarification composée de 4 % de SDS et d'acide borique 0,2 molaire, et préparez 500 millilitres de glycérol à 80 % pour traiter les tissus dans la hotte. Répartissez 10 millilitres de solution monomère d'hydrogel dans des tubes centrifuge de 15 millilitres.Dissez l'échantillon de tissu et placez le tissu dans chaque tube contenant du fixateur hydrogelé à quatre degrés Celsius pendant deux jours. Après l'incubation sous hotte, polymérisez le tissu fixé en ajoutant cinq microlitres de temid. Mélangez ensuite soigneusement et laissez les échantillons s'incuber à température ambiante pendant deux à trois heures.Après l'incubation, éliminer soigneusement l'excès de gel afin de clarifier les échantillons de tissu. Placer chacun dans 15 millilitres de solution de clarification et incuber à 50 degrés Celsius et 70 tr/min pendant plusieurs jours, jusqu'à ce qu'ils deviennent transparents. Changer la solution de clarification au moins une fois par jour et retirer tout excès de gel.Transférez les échantillons dans 15 millilitres de PB 0,1 molaire contenant 0,1 % de Triton X-100 à 37 degrés Celsius et 70 tr/min pendant la nuit. Répétez l'incubation deux fois supplémentaires avec du tampon frais. Maintenant que le tissu est clarifié et débarrassé de tout excès de gel, immergez les échantillons dans l'anticorps primaire dans du PB Triton X-100 et incubez à 37 degrés Celsius et 70 tr/min pendant deux jours. Après l'incubation, utilisez 15 millilitres de PB contenant 0,1 % de Triton X-100 pour laver les échantillons de tissu à 37 degrés Celsius et 70 tr/min pendant la nuit.Répétez le lavage trois fois ; après avoir éliminé le dernier tampon de lavage, ajoutez une solution d'anticorps secondaire marqué fluorescent dans du PB contenant 0,1 % de Triton X-100 et du sérum bloquant, puis incubez à l'obscurité à 37 degrés Celsius et 70 tr/min pendant un jour. Après avoir lavé les échantillons trois fois dans 10 millilitres de PB Triton X-100 à 37 degrés Celsius et 70 tr/min pendant la nuit, effectuez trois lavages prolongés dans du PBS. Incubez enfin le tissu clarifié dans du glycérol à 80 % recouvert de papier d’aluminium pendant la nuit.L’imagerie par microscopie confocale est ensuite réalisée dans l’obscurité ou une lumière tamisée, bien que les lumières soient allumées dans cette vidéo à des fins de visualisation. Plusieurs événements développementaux importants se produisent dans le système biliaire hépatique pendant la métamorphose de la lamproie, par exemple, comme illustré ici, le canal biliaire et la vésicule biliaire subissent une apoptose et se dégradent. Après avoir utilisé la méthode de clarification modifiée et coloré avec le marqueur des cellules hépatiques cytokeratine 19 et le marqueur anti-apoptotique BCL2, une microscopie confocale à balayage laser a été utilisée pour effectuer des coupes optiques à travers le foie intact.La coloration a révélé que le processus dégénératif se produit au cours des stades métamorphiques deux à quatre. Les panneaux supérieurs proviennent de l'extrémité antérieure et les panneaux inférieurs de l'extrémité postérieure. On observe ici l'arbre biliaire et, ici, des cellules apoptotiques sombres à aspect dendritique ainsi que les canalicules et les conduits environnants dans le foie.Cette figure représente des images tridimensionnelles reconstruites à partir de séries Z confocales de trois foies, entre les stades métamorphiques deux et trois, marqués par des anticorps dirigés contre la cytokeratine 19 et la BCL deux, l'arbre biliaire et les cellules apoptotiques sombres à aspect dendritique ainsi que les canalicules et canaux environnants, qui sont indiqués respectivement par des flèches blanches et noires. On observe ici une coupe optique confocale des canaux biliaires d'un spécimen compris entre les stades métamorphiques deux et trois, avec des gouttelettes de bile dans la lumière. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de clarifier l'ensemble du tissu en vue d'analyses d'imagerie ultérieures.N'oubliez pas que le travail avec le paraforme, les aldéhydes et les solutions de polyacrylamide peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port de gants et l'utilisation de la hotte aspirante doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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L'embryon de poisson zèbre est un excellent modèle pour la recherche sur la biologie du développement. Au cours de l'embryogenèse, le poisson-zèbre se développer avec une masse jaune, qui pose des problèmes en trois dimensions pour l'observation et l'analyse des échantillons. Ce protocole décrit comment créer deux dimensions planes monter préparatifs de la montagne toute in situ (WISH) colorées de spécimens d'embryons de poisson zèbre.

Appartement Mont Préparation pour l&#39;observation et l&#39;analyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Pour aider à évaluer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération biliaire du foie due au poisson-zèbre, nous avons établi un modèle de lésion hépatique dans lequel les hépatocytes exprimant la nitroréductase sont génétiquement ablatés lors d’un traitement au métronidazole.  Dans ce protocole, nous décrivons comment manipuler, surveiller et analyser habilement l’ablation des hépatocytes et la régénération hépatique induite par les voies biliaires.

Ablation spécifique des hépatocytes chez le poisson zèbre pour étudier conduit biliaire-Régénération hépatique

Le squelette branchial, y compris les branchicténies, les dents pharyngées et les os branchiaux, sert de site principal de transformation des aliments chez la plupart des poissons. Nous décrivons ici un protocole pour disséquer et monter à plat ce squelette interne chez les épinoches à trois épines. Cette méthode est également applicable à une variété d’autres espèces de poissons.

Dissection et Flat-montage de l&#39;épinoche à trois épines branchiale Squelette

Les poissons-zèbres sont en train de devenir un modèle précieux de traitement des lipides alimentaires et de maladies métaboliques. Il décrit des protocoles d’alimentation des larves riches en lipides, l’imagerie en direct d’analogues lipidiques fluorescents alimentaires et la quantification de l’apport alimentaire. Ces techniques peuvent être appliquées à une variété de techniques de dépistage, d’imagerie et d’enquête basée sur des hypothèses.

Haute teneur en graisses Alimentation Paradigm pour larvaire Zebrafish: Alimentation, imagerie en direct, et la quantification de la prise alimentaire

Nous présentons ici un protocole visant à isoler et de caractériser la structure, puissance olfactive et réaction de composés de phéromones putatifs de la lamproie marine.

L’Identification des phéromones de la lamproie marine à l’aide de fractionnement Bioassay-guidé

Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer le sillon oculaire supérieur, une structure récemment identifiés, évolutivement conservée dans le œil de vertébrés. À l’aide de larves de poisson zèbre, nous démontrons techniques nécessaires pour identifier les facteurs qui contribuent à la formation et la fermeture du sillon oculaire supérieur.

Visualisation du sillon oculaire supérieure durant l’embryogenèse Danio rerio

Nous présentons une méthode assez simple et sensible pour la quantification précise de la densité de conduit biliaire dans le foie de souris. Cette méthode peut aider à déterminer les effets des modificateurs génétiques et environnementaux et l'efficacité des thérapies potentielles dans les modèles murins des maladies biliaires.

Détermination de la densité de duct biliaire dans le foie de souris

Ici nous démontrons une méthode pour quantifier la taille du foie dans le poisson zèbre larvaire, fournissant un moyen d'évaluer les effets des manipulations génétiques et pharmacologiques sur la croissance et le développement de foie.

Quantifier la taille du foie chez le poisson zèbre larvaire à l'aide de la microscopie Brightfield

La régénération des muscles squelettiques est entraînée par les cellules souches musculaires résidentes des tissus, qui sont altérées dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire.

Examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson-zèbre de maladie musculaire

Ce protocole décrit la procédure pour enlever le lobe ventral du foie dans le poisson zèbre adulte pour permettre l’étude de la régénération de foie.

Hépatectomie partielle chez le poisson zèbre adulte

Ce protocole décrit la récolte et la visualisation d’écailles d’élasmoïdes de poisson-zèbre au cours de la régénération in vivo . De plus, la culture ex vivo de ces cochenilles jusqu’à 7 jours après la récolte est présentée.

Régénération d’écailles de poisson-zèbre Culture d’écailles in toto et ex vivo

Découvrez une méthode CLARITY modifiée pour visualiser la dégénérescence biliaire chez la lamproie marine Petromyzon marinus. Cette technique permet d'analyser les changements structuraux et cellulaires pendant la métamorphose.

Une nouvelle méthode de clarification de visualiser biliaire dégénérescence Pendant foie métamorphose de la lamproie marine ( Petromyzon marinus) (Vidéo) | JoVE Journal

Une nouvelle méthode de clarification de visualiser biliaire dégénérescence Pendant foie métamorphose de la lamproie marine ( Petromyzon marinus)

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