Une nouvelle méthode de clarification de visualiser biliaire dégénérescence Pendant foie métamorphose de la lamproie marine ( Petromyzon marinus)

L’objectif global de cette procédure est de clarifier l’ensemble du foie et la jonction avec l’intestin pour des analyses globales, structurelles et cellulaires de la dégénérescence biliaire. Chez la lamproie C métamorphique. Ceci est accompli en fixant d’abord les tissus dans la solution de monomère d’hydrogel.

Ensuite, l’hydrogel est polymérisé avec les tissus fixés. Ensuite, la membrane plasmique du tissu fixé est retirée et le tissu devient transparent. Enfin, la coloration immunofluorescente est réalisée au laser de la peau et la microscopie confocale est utilisée pour montrer les changements structurels et cellulaires globaux au cours de la dégénérescence biliaire chez la lamproie métamorphique.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine biomédical, telles que les connectomes du système nerveux central et, dans notre cas, la dégénérescence biliaire lors de la métamorphose du point sérum. Les implications de cette technique s’étendent au traitement ou au diagnostic de la biliaire humaine ou de l’atrésie, car cette maladie infantile congénitale rare partage des caractéristiques similaires à la dégénérescence arytique lors de la métamorphose du point sérum. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons trouvé un article de presse sur nature et présenté la vidéo en ligne lors de notre réunion de laboratoire démontrant que la procédure sera Ann Scott, une étudiante diplômée de notre laboratoire Après avoir fabriqué une solution saline tamponnée au phosphate et un tampon de phosphate ou pb, selon le protocole de texte.

Dans une hotte, préparez 400 millilitres d’hydrogel en combinant de l’eau distillée, 40 % d’acrylamide, 2 % d’acrylamide 10 XPBS, 16 % de paraforme, d’aldéhyde, de saponine et d’ammonium par sulfate. Préparez un litre de solution éclaircissante composée de 4 % de SDS et de 0,2 molaire d’acide borique, et préparez 500 millilitres de glycérol à 80 % pour préparer les tissus dans la hotte. Eloqua 10 millilitres de solution d’hydrogel monomère dans des tubes à centrifuger de 15 millilitres.

Disséquez l’échantillon de tissu et placez-le dans chaque tube d’hydrogel à quatre degrés Celsius pendant deux jours. Suite à l’incubation sous hotte, polymériser le tissu fixé en ajoutant cinq microlitres de témid. Ensuite, mélangez bien et laissez les échantillons incuber à température ambiante pendant deux à trois heures.

Après l’incubation, retirez soigneusement l’excès de gel pour éliminer les échantillons de tissus. Placez chacun dans 15 millilitres de solution éclaircissante et incubez à 50 degrés Celsius et 70 tr/min pendant plusieurs jours jusqu’à ce qu’ils deviennent transparents. Changez la solution éclaircissante au moins une fois par jour et retirez tout excès de gel.

Transférez les échantillons dans 15 millilitres de 0,1 PB molaire avec 0,1 % Triton X 100 à 37 degrés Celsius et 70 tr/min pendant la nuit. Répétez l’incubation deux fois de plus avec un tampon frais. Maintenant que le tissu est nettoyé et débarrassé de tout excès de gel, immergez les échantillons dans l’anticorps primaire dans PB tritton X 100 et incubez à 37 degrés Celsius et 70 RPM pendant deux jours après l’incubation, utilisez 15 millilitres de PB avec 0,1 % tritton X 100 pour laver les échantillons de tissu à 37 degrés Celsius et 70 RPM pendant la nuit.

Répétez le lavage trois fois après avoir retiré le tampon de lavage final, ajoutez une solution d’anticorps secondaires fluorescents dans du PB avec 0,1 % de Trix 100 et du sérum bloquant et incubez dans l’obscurité à 37 degrés Celsius et 70 tr/min pendant une journée. Après avoir lavé les échantillons trois fois dans 10 millilitres de PB tritton X 100 à 37 degrés Celsius et 70 tr/min pendant la nuit, effectuez trois lavages de nuit dans PBS. Enfin, incubez le tissu clarifié dans 80 % de glycérol recouvert d’une feuille pendant la nuit.

L’imagerie par microscopie confocale est ensuite réalisée dans l’obscurité ou la pénombre, bien que les lumières soient allumées dans cette vidéo à des fins de visualisation. Plusieurs événements développementaux importants se produisent dans le système biliaire HEPA au cours de la métamorphose de la lamproie, par exemple, comme le montre ici, le canal biliaire et la vésicule biliaire subissent une apoptose et dégénèrent. Après avoir utilisé la méthode de clarification modifiée et la coloration avec le marqueur de cellules hépatiques cytokératine 19 marqueur anti-apoptotique, la microscopie confocale à balayage laser BCL deux a été utilisée pour effectuer une coupe optique à travers le foie intact.

La coloration a révélé que le processus dégénératif se produit aux stades métamorphiques deux à quatre. Les panneaux supérieurs sont de l’avant et les panneaux inférieurs sont de l’extrémité postérieure. On voit ici l’arbre biliaire et ici les cellules apoptotiques d’aspect dendritique foncé et les canalicules et les outils de canal environnants dans le foie.

Cette figure représente des images tridimensionnelles reconstruites : la série confocale Z de trois foies entre les stades métamorphiques deux et trois marqués avec des anticorps contre la cytokératine 19 et la BCL deux, l’arbre biliaire et les cellules apoptotiques d’aspect dendritique foncé et les canalicules et les outils de canal environnants sont marqués respectivement par des flèches blanches et noires. On voit ici une coupe optique confocale des voies biliaires d’un échantillon entre les stades métamorphiques deux et trois avec des gouttelettes de bile dans la lumière. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de clarifier l’ensemble du tissu pour des analyses d’imagerie plus approfondies.

N’oubliez pas que travailler avec des solutions de paraform, d’aldéhyde et de polyacrylamide peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port de gants et l’utilisation de la hotte doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.