La mesure de la perméabilité à l'eau Coefficient osmotique (P _F) Des cellules sphériques: protoplastes de plantes isolées comme un exemple

L’objectif général de l’expérience suivante est d’en apprendre davantage sur la fonction des aquaporines en déterminant le coefficient de perméabilité à l’eau osmotique, ou PF, des protoplastes végétaux. Découpez un morceau d’une feuille sans épiderme axial et mettez-le sur une solution isotonique. Transférez les morceaux dans une solution enzymatique et incubez pendant 20 minutes à 28 degrés Celsius, puis dans une solution isotonique fraîche.

Ensuite, prélevez les protoplastes contenant la solution avec une pointe coupée. Dans un deuxième temps, préparez une chambre expérimentale. Fixez une lamelle au bas de la glissière à l’aide de graisse silicone.

Enduisez ensuite le fond de la chambre d’une colle à charge positive et remplissez la chambre d’une solution isotonique. Des protoplastes isolés sont ensuite ajoutés à la chambre, et la chambre est placée délicatement sur la platine du microscope. Par la suite, les protoplastes sont exposés à une solution hypotonique tandis que des vidéos sont enregistrées pour capturer leur gonflement.

Ensuite, l’évolution du temps de gonflement est analysée numériquement par un logiciel incluant des procédures de cursertage afin de déterminer la PF de chaque protoplaste sur la base des résultats d’analyse numérique obtenus qui montrent des différences de PF induites, par exemple, par l’expression de différents gènes de l’aquaporine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie des membranes cellulaires, telles que la régulation de la fonction de l’aquaporine. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’eau matique, la perméabilité des plantes d’eau des plantes indigènes ou génétiquement modifiées.

Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que l’origine exposée d’intérêt. Avant de commencer cette procédure, préparez les solutions isotoniques et hypertoniques requises et vérifiez leur osmolarité. À l’aide d’un système OSM, l’osmolarité de chaque solution doit se situer à moins de 3 % de la valeur cible.

Remplissez une boîte de Pétri de 10 centimètres avec environ six gouttes de solution isotonique. Pelez le sceau ABBA ou abaissez l’épiderme d’une feuille de lapin opsys et coupez la feuille pelée en carrés d’environ quatre par quatre millimètres. Placez les petits morceaux sur les gouttes de solution isotonique avec le côté axial exposé, face vers le bas et en touchant la solution.

Ensuite, dissolvez 5,7 milligrammes du mélange d’enzymes dans 165 microlitres de solution isotonique dans un tube de 1,5 millilitre et mélangez doucement en pipetant pendant environ une minute jusqu’à ce qu’il soit dissous. Placez plusieurs gouttes similaires de la solution enzymatique dans la même boîte de Pétri. Transférez les morceaux de feuilles sur la solution enzymatique. Gouttes.

Fermez le plat et fermez le couvercle avec un tour de perfil. Faites flotter le plat dans un bain-marie réglé à 28 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après 20 minutes, ajoutez plusieurs gouttes supplémentaires de la solution isotonique dans le plat à l’aide d’une pince.

Soulevez chaque morceau de feuille par son bord pour le transférer dans une nouvelle goutte de solution isotonique, puis séquentiellement dans une deuxième goutte. Secouez le morceau de feuille dans la deuxième goutte pour libérer les protoplastes à l’aide d’une pointe de pipette de 100 microlitres coupée. Collectez les gouttes avec les protoplastes dans un tube de 1,5 millilitre.

Préparez le système de profusion en remplissant une colonne avec la solution isotonique et une autre colonne avec la solution hypotonique. Ouvrez la vanne pour laisser couler une solution hypotonique pour remplir le tube jusqu’au collecteur d’entrée. Après vous être assuré qu’il n’y a pas de bulles d’air emprisonnées, fermez la vanne.

Répétez l’opération pour la solution isotonique. Scellez une lamelle à l’aide de graisse silicone pour faire un fond pour la chambre à l’intérieur de la lame en plexiglas afin de rendre le fond de la chambre collant pour les protoplastes, enduisez-le de sulfate de protamine porteur de charge positive ou de poly L lysine. À l’aide d’une pointe de pipette, étalez cette colle sur la lamelle.

Attendez une à deux minutes. Rincez trois à quatre fois avec la solution isotonique et secouez le reste de la solution. Remplissez la chambre avec la solution isotonique.

Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette coupée, ajoutez une goutte de protoplastes contenant de la solution dans la chambre. Et attendez trois à quatre minutes pour que les protoplastes se déposent. Couvrez la chambre avec un couvercle transparent touchant la surface de la solution.

Évitez de piéger les bulles d’air en dessous. Placez doucement une lame sur une table de microscope inversée et connectez-la connectée au système de perfusion et à la pompe protégeant contre les bulles d’air dans la tubulure. Activez le débit de solution isotonique pour une perfusion constante à un millilitre par minute.

Pour enregistrer les changements de volume, choisissez un champ d’affichage avec autant de cellules que possible de forme sphérique et un contour de cellule bien ciblé sur leur périmètre le plus grand. Enregistrer une 62e vidéo de protoplastes immobiles sélectionnés à une vitesse d’une image par seconde ou d’un hertz. Démarrez l’enregistrement par un lavage de 15 secondes de la solution isotonique et passez à la solution hypertonique pendant 45 secondes.

Pour analyser une série d’images d’une cellule gonflée, utilisez les plugins Image Explorer et protoplasts analyzer du logiciel image J. Démarrez l’image J.To ouvrez le film, cliquez sur fichier dans le panneau Image J, puis consécutivement sur les menus déroulants au fur et à mesure qu’ils déplient l’importation. Puis explorateur d’images.

Mettez en surbrillance le film choisi. Faites un clic droit dessus, puis à gauche. Cliquez sur l’analyseur de protoplastes.

Sur la première image, utilisez la souris pour dessiner des cercles autour des protoplastes sélectionnés. Cliquez ensuite sur OK. Dans le tableau des paramètres de détection qui s’affiche pour lancer l’algorithme de détection des protoplastes, cliquez sur local dans le panneau supérieur de l’image des protoplastes.

Ensuite, traitez. Dans le menu déroulant, examinez les cercles verts autour des protoplastes sélectionnés tout au long du film. À l’aide du curseur inférieur, enregistrez les résultats dans un fichier Excel.

L’analyse se fait image par image. Par conséquent, dans le cas de plus d’une cellule, un tri est nécessaire pour séparer les lignes appartenant à chaque cellule ici. Les trois parcours temporels sont affichés dans une feuille Excel avant et après le tri avec les valeurs de surface converties de pixels en micromètres carrés.

Chaque cours est ensuite exporté dans un fichier texte distinct. Pour commencer cette procédure, connectez la chambre au système de perfusion et à la pompe et allumez le débit de la matrice indicatrice pour un débit de perfusion constant d’un millilitre par minute, enregistrez une 62e vidéo à la vitesse d’un hertz. Démarrez l’enregistrement avec 15 secondes de matrice indicatrice, puis passez à la solution hypertonique Pendant 45 secondes, arrêtez l’enregistrement.

Affleurer avec l’indicateur. Meurt à nouveau pendant au moins 30 secondes. Avant de démarrer une nouvelle vidéo, enregistrez et enregistrez cinq à six vidéos pour analyser les vidéos.

Pour obtenir une évolution temporelle moyenne de la transmission de la matrice de l’indicateur de changement, démarrez l’image J cliquez sur le fichier. Ouvrez ensuite et recherchez le film. Pour chaque film, dessinez un rectangle vertical de 10 pixels de large n’importe où sur la première image du film, cliquez sur l’image dans le panneau principal de l’image J.

Cliquez ensuite sur recadrer dans le menu déroulant. Pour aligner les 60 images sur une rangée, cliquez sur image, puis cliquez consécutivement dans les menus déroulants pendant qu’elles déplient les piles et effectuent le montage. Dessinez un rectangle horizontal d’un pixel de haut n’importe où le long de toute la rangée d’images et cliquez sur analyser dans le panneau principal de l’image J.

Ensuite, cliquez sur Tracer le profil. Dans le menu déroulant, copiez les listes des données de transmission dans un fichier Excel. Faites la moyenne des trajets de temps de transmission obtenus à partir des films Sero des vidages de matrice de l’indicateur.

Générez une base en temps réel en multipliant le numéro séquentiel de l’image par 0,1. Enregistrez l’évolution temporelle moyenne dans un fichier texte pour calculer les différents paramètres de l’évolution temporelle de l’osmolarité. Utilisez le programme d’ajustement MATLAB PF fit, qui est disponible.

Gratuit. Des détails sur le téléchargement et l’utilisation de ce programme sont disponibles dans le texte du protocole. Dans le panneau d’ajustement de l’indicateur.

Importez les données de l’évolution temporelle moyenne de la transmission du colorant indicateur. Entrez manuellement les paramètres de l’expérience actuelle, les suppositions initiales des paramètres avec la fourmi H.La description de l’évolution temporelle de la concentration de colorant indicateur peut également être modifiée. Cliquez sur exécuter pour afficher le tracé de l’évolution temporelle de l’indicateur de concentration en DAI et de l’osmolarité du bain modélisée.

Un bon ajustement aux données est essentiel pour déterminer le coefficient de perméabilité à l’eau. Passez au panneau d’ajustement du volume. Choisissez d’importer le fichier de données de la zone.

Choisissez le dernier raccord d’indicateur comme source de paramètre. Choisissez la classe de modèle. Commencez par deux.

Les paramètres PF pf PF lent et delay doivent être initialisés, par exemple, comme indiqué, mais d’autres valeurs sont également possibles. Mark vérifie les trois paramètres à installer. Cliquez sur Exécuter.

Ensuite, regardez la figure provisoire et ajustez le paramètre de retard et la durée de l’enregistrement si nécessaire. Examinez le graphique des résultats pour évaluer l’ajustement, la qualité et enregistrer l’erreur d’ajustement. Modifiez les paramètres d’initialisation plusieurs fois chacun et réexécutez.

Répétez cette procédure plusieurs fois, en commençant par différentes combinaisons de paramètres d’initialisation, en visant la valeur la plus basse de l’erreur d’ajustement afin de déterminer le coefficient de perméabilité à l’eau ou pf, et comparez l’activité de différentes aquaporines Mesil Protoplasts d’une feuille opsys de lapin ont été isolés et transformés séparément avec trois constructions génétiques avec des gènes d’aquaporine d’un lapin, Opsys et Maze. Les protoplastes ont été marqués en collaboration avec un vecteur codant pour une protéine fluorescente verte améliorée. L’évolution temporelle des changements de volume cellulaire lors de l’exposition à la provocation hypotonique a été obtenue pour chaque cellule ainsi que l’évolution temporelle de la variation de l’osmolarité du bain pendant la provocation hypotonique, les valeurs PF ont été dérivées pour chaque cellule.

À l’aide du programme PF FIT, il a été observé que les valeurs de PF des PROTOPLASTS transformés avec chacune des trois aquaporines étaient significativement plus élevées que les valeurs PF de la cellule témoin transformée avec la GFP seule. Une fois maîtrisée, cette technique peut permettre d’analyser quelques dizaines de cellules en quelques jours d’expérimentation si elle est réalisée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer la perméabilité à l’eau SMO dans des protoplastes isolés ou d’autres cellules focales soumises à un test hypotonique.

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