Évaluation non invasive de la Cardiac Malformations en auto-immune expérimentale myocardite par résonance magnétique microscopie imagerie chez la souris

L'objectif général de cette procédure est de déterminer les anomalies fonctionnelles cardiaques en imagerie des cœurs d'animaux vivants atteints d'une maladie cardiaque inflammatoire. Cela est réalisé en induisant d'abord la maladie, par exemple une myocardite. La deuxième étape consiste à préparer l'animal pour l'imagerie par microscopie à résonance magnétique et à le placer dans le support pour animal.

Ensuite, la souris est placée à l'intérieur de l'aimant afin d'acquérir les images cardiaques. L'étape finale consiste à analyser les paramètres fonctionnels cardiaques à l'aide du logiciel Segment. En définitive, cette technique permet de calculer le volume diastolique final et la fraction d'éjection chez des souris atteintes de myocardite auto-immune.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'histopathologie, est qu'elle est non invasive et offre une vue tridimensionnelle du cœur avec une résolution élevée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la cardiologie, notamment concernant le diagnostic des maladies inflammatoires du cœur. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison d'un manque de familiarité avec la préparation des animaux pour l'acquisition d'images par microscopie par résonance magnétique.

Par conséquent, la démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Commencez ce protocole par la préparation d'une solution peptidique destinée à induire une myocardite auto-immune : dissolvez le peptide 334-352 de la chaîne lourde alpha de la myosine cardiaque dans du tampon salin phosphate à une concentration finale de deux milligrammes par 1,5 millilitre. Ensuite, préparez la toxine de la coqueluche en ajoutant un millilitre de solution tampon salin phosphate stérile 1 x à un flacon contenant 50 microgrammes de toxine de la coqueluche lyophilisée.

Pour obtenir une concentration stock de 50 nanogrammes par microlitre, prélevez ensuite 20 microlitres de la solution mère dans un tube stérile de 1,5 millilitre et ajoutez 980 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate stérile à 1 x afin d'obtenir une concentration de travail de 1 nanogramme par microlitre. Préparez également l'adjuvant complet de Freund ou CFA en ajoutant 40 milligrammes d'extrait de mycobactérie tuberculeuse H 37 RV ou MTB à 10 millilitres de CFA pour obtenir une concentration finale de 5 milligrammes par millilitre.

Préparez maintenant l'émulsion de CFA pour obtenir un aliquot d'émulsion de 1,5 millilitre : ajoutez 750 microlitres de solution du peptide de la chaîne lourde alpha de la myosine cardiaque, peptide 3 34 à 3 52, dans un tube de 1,5 millilitre, puis faites un aliquot d'un volume égal de CFA enrichi en extrait de MTB dans un autre tube de 1,5 millilitre. Ensuite, à l’aide d’une seringue de trois millilitres à verrou de type lure lock, aspirez d’abord la solution peptidique, puis l’extrait de CFA-MTB. Fixez la seringue à un robinet trois voies et reliez l’autre sortie du robinet à une seringue vide de trois millilitres.

Régler l'ouverture du robinet. Ainsi, le mélange de peptide et de CFA s'écoule d'une seringue à l'autre avec une résistance raisonnablement élevée. Mélanger en poussant le contenu d'une seringue à l'autre de manière répétée pendant environ une minute, puis placer l'ensemble sur de la glace pendant environ trois minutes.

Répétez cette procédure au moins 10 fois. Déterminez la consistance de l'émulsion en déposant soigneusement une minuscule goutte sur de l'eau stagnante dans un bécher en verre de 100 millilitres. La goutte ne doit pas se disperser dans l'eau ; sinon, continuez à mélanger jusqu'à l'obtention de la consistance souhaitée.

Transférez le contenu de l'émulsion depuis les seringues de trois millilitres vers une seringue d'un millilitre. Connectez la seringue d'un millilitre en remplaçant l'une des deux seringues de trois millilitres fixées au robinet à trois voies. Puis fixez une aiguille de 27 et demie gauge.

Injecter 150 microlitres de l'émulsion de peptide CFA en doses fractionnées par voie sous-cutanée dans les deux régions inguinales de souris femelles âgées de six à huit semaines. Administrer ensuite 100 microlitres de suspension de toxine de la coqueluche par voie intrapéritonéale à chaque animal au jour zéro et au jour deux post-immunisation. Répéter la procédure d'immunisation au jour sept en administrant 150 microlitres de l'émulsion de peptide CFA en doses fractionnées par voie sous-cutanée de chaque côté du sternum.

Préparez cette émulsion fraîche comme décrit. Ensuite, au jour 21, soumettez les animaux à une imagerie par IRM. Pour préparer l’imagerie, placez d’abord chaque souris dans une chambre d’induction anesthésique contenant un mélange d’air à 2 % d’ISO avec un tapis chauffant afin de maintenir la chaleur.

Ensuite, transférez l'animal vers un support pour animal spécialement conçu. Fixez la tête à l'aide d'une barre dentaire afin d'immobiliser l'animal en position prone. Le museau doit s'insérer dans le cône nasal pour maintenir l'anesthésie.

Activer le chauffage à air soufflé en insérant son tuyau de sortie dans l'ouverture verticale du scanner afin de maintenir la température corporelle de l'animal pendant l'expérience. Maintenir l'anesthésie à 1 à 2 % d'isoflurane avec un débit de deux millilitres par minute pendant toute la durée de la session d'imagerie. Vérifier l'anesthésie en pinçant l'orteil.

Ensuite, installez un capteur pneumatique en forme d'oreiller et une sonde de température rectale afin de surveiller la respiration et la température corporelle tout au long de la séance d'imagerie. Un capteur d'oxymétrie de pouls à fibre optique doit également être fixé à la cheville gauche, et le pied doit être maintenu en place à l'aide d'une boucle de fil et de ruban adhésif. L'imagerie sera obtenue en synchronisant les signaux respiratoires et cardiaques, sans utiliser d'agents de contraste.

Un aimant vertical à large diamètre de 9,4 Tesla doit être utilisé pour obtenir des images tridimensionnelles de microscopie par résonance magnétique à haute résolution. Après avoir préparé l'animal, placer la souris dans le scanner de manière à ce que le cœur soit positionné au centre du champ de vision. Ensuite, exécuter l'interface d'imagerie, sélectionner le type d'étude « mune » dans la barre de commandes, ouvrir la page de réglage, puis choisir « démarrer la sonde », « régler » et « mise à l'échelle automatique ».

Utilisez les boutons de réglage à distance situés à l'extrémité de la bobine pour ajuster la bobine RF à la fréquence de résonance du proton de 400 mégahertz. Ensuite, accédez à la page de pré-numérisation. Pour effectuer l'étalonnage de la fréquence et de la puissance, appuyez sur le bouton rapide X, Y, Z afin d'afficher la page de réglage du champ magnétique.

Ensuite, sélectionnez toutes les itérations et effectuez l'ajustage automatique du champ magnétique. Sélectionnez une séquence d'orientation. Modifiez le champ de vision à 35 millimètres.

Conserver les autres paramètres par défaut et exécuter la séquence. Si le cœur ne se trouve pas au centre du champ de vision, ajuster la position du support de l'animal, réajuster la bobine RF et réacquérir l'image pilote. Ensuite, sélectionner la séquence gem.

Saisissez les paramètres d'acquisition indiqués ici dans l'onglet « acquire » afin d'obtenir deux plans orthogonaux selon l'axe court et l'axe long du cœur. Ensuite, sélectionnez la séquence ciné pour acquérir les images ciné de l'axe court avec oxymétrie de pouls et mesurer les paramètres du ventricule gauche, ainsi que les paramètres anatomiques et fonctionnels. Saisissez les paramètres indiqués ici pour obtenir la séquence ciné en gradient d'écho.

Ajustez la position et l'angle des coupes d'imagerie en fonction de la vue selon l'axe long du cœur. Ensuite, exécutez la séquence. Une fois l'imagerie terminée.

Convertir les images acquises au format DICOM à l'aide de l'onglet IO et transférer les fichiers correspondants au centre de données pour traitement. À la fin de la procédure d'imagerie, laisser l'animal se réveiller de l'anesthésie dans une cage équipée d'un couvercle filtrant. Ne pas laisser la souris sans surveillance jusqu'à ce qu'elle retrouve une conscience suffisante pour maintenir une position sterno-abdominale.

Ici, un logiciel de segmentation est utilisé pour analyser les paramètres anatomiques et fonctionnels du ventricule gauche. Commencez par charger les images au format DICOM, de type ciné, dans le logiciel. Ensuite, sélectionnez MRGE comme technique d'imagerie, ciné comme type d'image et axe court au niveau ventriculaire moyen.

En tant que plan de visualisation de l'image, spécifiez les intervalles de temps à utiliser pour la fin de la diastole et la fin de la systole à l'aide des sous-menus définir l'intervalle de temps actuel comme fin de diastole et définir l'intervalle de temps actuel comme fin de systole situés dans le menu édition. Ensuite, utilisez les boutons de commande VG, puis endo et EPI situés sur le panneau inférieur droit. Pour dessiner manuellement le ventricule gauche, l'endocarde et l'épicarde respectivement, supprimez les muscles papillaires en appuyant sur le bouton de commande correspondant.

Afin d'augmenter la précision des calculs, lisez les paramètres quantifiés du ventricule gauche, tels que le volume diastolique, le volume systolique, le volume d'éjection et la fraction d'éjection, sur le panneau supérieur droit. Ensuite, utilisez le bouton de commande « mis » puis le bouton de commande du compas de mesure pour mesurer les paramètres du ventricule gauche, tels que l'épaisseur de la paroi et le diamètre ventriculaire. Enfin, veillez à utiliser l'option « enregistrer les deux séries d'images et la segmentation » afin de sauvegarder les images, y compris les segmentations au format dot mat, pour pouvoir les retravailler si nécessaire.

L'angle selon lequel le cœur a été sectionné pour l'acquisition d'images en vue à deux chambres peut être observé ici. On observe ici une augmentation d'environ 1,5 fois de l'épaisseur du ventricule gauche, indiquant des anomalies structurelles chez les souris atteintes de myocardite auto-immune par rapport aux souris saines. Le débit cardiaque, mesuré à partir du volume diastolique et de la fraction d'éjection du ventricule gauche, était réduit chez les souris atteintes de myocardite auto-immune par rapport aux souris saines.

Enfin, les cœurs des groupes de traitement susmentionnés ont été évalués pour l'inflammation par une évaluation histologique à l'aide de colorations à l'hématéine et à l'éosine. L'évaluation histologique des cœurs de souris atteintes de myocardite, mais non de souris saines, a révélé la présence d'infiltrats multifocaux de lymphocytes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de s'assurer que la température corporelle de l'animal reste constante afin que la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire ne changent pas de manière significative pendant les expériences. Ceci est essentiel pour obtenir des résultats reproductibles.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la technique microscopique par résonance magnétique permettant d’évaluer les anomalies fonctionnelles des maladies cardiaques inflammatoires telles que la myocardite chez la souris. Mais n’oubliez pas que le travail avec des champs magnétiques élevés peut être extrêmement dangereux, aussi le support pour animal et les autres composants doivent être non magnétiques.