Name: Évaluation de Cancer de lovaire Spheroid attachement et linvasion des cellules mésothéliales en temps réel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse en temps réel pour quantifier l'invasion des cellules de cancer de l'ovaire dans la couche mésothéliale périnéale. Cette technique permet de mesurer continuellement la métastase et d'identifier les facteurs clés régulant ce processus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par une fondation CASS sciences et de médecine de subvention; (MB); une Santé et médecine du Conseil national de recherches du projet Australie Grant (KLS, 338516); et par Programme opérationnel d&#39;appui aux infrastructures du gouvernement du Victoria (Australie).

1. Préparation de cellules, des médias et réactifs <ol><li> Préparation du milieu contenant de la méthylcellulose, <ol><li> Dissoudre 1,5 g de méthyl dans 100 ml de milieu Eagle modifié par Dulbecco stérile (DMEM) (a aucune additifs) dans un ballon de 250 ml. </li><li> Chauffer la solution à basse au micro-ondes pendant 5 minutes; prendre soin d&#39;éviter de déborder. </li><li> Une fois la poudre de méthylcellulose est semi-dissous, ajouter un agitateur magnétique propre et médias à prendre le volume à 125 ml. </li><li> Mélanger, inverser, et agiter à température ambiante pendant 1,5 h, puis on a agité à 4 ° C pendant une nuit. </li><li> Diviser la solution également dans quatre tubes de 50 ml et centrifuger pendant 1,5 heure à 2300 x g. </li><li> Recueillir le surnageant clair, très visqueux (environ 90-95% du stock), aliquote en tubes de 50 ml stériles et conserver à 4 ° C pendant 3 mois. </li></ol></li><li> Culture et d&#39;étiquetage des cellules <ol><li> Maintenir les lignées cellulaires de cancer de l&#39;ovaire en monocouche dans un tissu incubateur de culture à 37 ° C, 5% CO2 dans un milieu de croissance approprié (DMEM pour les cellules KGN 17 et MCBD110: M199 pour les lignées cellulaires OVCA429 et OVCA433 18) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM de L -glutamine et 1% de pénicilline-streptomycine. </li><li> Maintenir les cellules mésothéliales humaines LP9 dans M199: Jambons milieu F12 contenant 15% de FBS, 10 ng / ml facteur de croissance épidermique (EGF) et 400 ng / ml d&#39;hydrocortisone, dans un incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> cellules de semences dans la taille de flacon désiré et poussent à environ 75% de confluence. Récupération des cellules par traitement à la trypsine en utilisant 0,05% de trypsine / EDTA, rotation à 186 g pendant 5 min, et laver culot cellulaire deux fois avec PBS. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hématimètre. </li></ol></li><li> Fluorescent Moyens portable d&#39;étiquetage <ol><li> cellules de cancer du Remettre en suspension à une concentration finale de 1 x 10 6 cellules / ml dans 1 ml de PBS contenant 0,1% de BSA préchauffé. </li><li> Ajouter 2 ul de 5 mM cellules Trsolution de SCDF as (ou un autre marqueur cellulaire préférée qui est retenu à long terme) à des cellules à une concentration finale de 10 uM et incuber à 37 ° C pendant 10 à 15 min dans un bain-marie. </li><li> Stopper la réaction avec 1 ml de glace milieu froid contenant 10% de FBS et re-granulés par centrifugation. Remettre en suspension dans 10 ml du milieu de culture préchauffé approprié (voir l&#39;étape 1.2.1). </li><li> cellules de semences dans un flacon de 75 cm2 et culture filtre plafonné à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Voir les cellules sous un microscope à fluorescence pour vérifier que le niveau de marquage par fluorescence est suffisante pour la détection. Une fois les cellules atteignent environ 75% de confluence, la récolte et comptent comme dans les étapes 1.2.3 et 1.2.4 ci-dessus. </li></ol></li></ol> 2. Génération de Sphéroïdes en méthylcellulose <ol><li> Calculer le volume des cellules cancéreuses de l&#39;ovaire de la section 1 nécessaires pour la production sphéroïde (un total de 300 000 cellules sont nécessaires pour chaque expérience complète de la plaque de 96 puits). Aucunte: si vous utilisez différentes lignées cellulaires que présenté ici, les densités cellulaires pour la production de sphéroïde uniforme peuvent avoir besoin d&#39;être optimisé pour chaque ligne. </li><li> Pour le calcul de la dilution des cellules dans un milieu de méthylcellulose, soustraire une part le volume de la cellule souhaitée (étape 2.1) à partir de 15 ml. </li><li> Ajouter 3 ml de solution mère de la méthylcellulose (pour faire 20% de méthylcellulose final) pour un volume de milieu de culture approprié pour chaque lignée cellulaire, égale à 15 ml moins le volume de la cellule et bien mélanger par inversion douce. </li><li> Ajouter 300.000 cellules au moyen de méthylcellulose contenant et soigneusement mélangé par inversion douce. </li><li> Introduire à la pipette 150 ul de la combinaison cellule / support / méthylcellulose (pour un total de 3.000 cellules / puits) dans chaque puits d&#39;une plaque de culture 96 puits à fond concave et la culture à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 1-4 jours ou jusqu&#39;à sphéroïdes uniformes forment (1 sphéroïde / puits est généralement observé). </li></ol> 3. RTCA invasion cellulaire dosages NOTE: lectures d&#39;impédance sont exprimés en indice cellulaire (CI), un paramètre sans dimension qui est un changement par rapport à l&#39;impédance de la cellule de mesure représentant l&#39;état de la cellule. Pour l&#39;analyse, importer des données dans un tableur, comme Microsoft Excel. <ol><li> Préparation de la plaque <ol><li> En groupes de 4 puits à la fois, ajouter 50 matrice de pi (dilué à 1:10 dans du milieu de culture sans sérum) à chaque puits de la chambre supérieure d&#39;une plaque de 16 puits RTCA CIM pour garantir que la surface totale est recouverte . Retirer 30 pl de la matrice immédiatement, mais lentement, de se débarrasser de tout excès de liquide. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant 4 heures avant de l&#39;utiliser dans un incubateur de culture tissulaire. </li><li> Ajouter 30 ul de milieu sans sérum (SFM) appropriés pour chaque ligne de cellules de cancer de la chambre supérieure et 160 pi de milieu avec ou sans sérum (selon votre conception expérimentale) à la chambre basse. </li><li> Assembler la plaque CIM en cliquant sur la chambre basse dans la chambre supérieure et equilibrmangé dans un incubateur à 37 ° pendant 1 h dans un incubateur de culture tissulaire. </li></ol></li><li> Programmation de l&#39;instrument RTCA <ol><li> Ouvrez le programme RTCA et sélectionnez l&#39;onglet «Mise en page». Mettez en surbrillance tous les puits expérimentaux. </li><li> Faites un clic droit sur les puits et sélectionnez «Activer le puits»; puis remplir dans des conditions expérimentales et les noms de cellules comme vous le souhaitez. </li><li> Pour ajouter des étapes ou sous-étapes au programme, sélectionnez l&#39;onglet &quot;Calendrier&quot; et un clic droit sur «Ajouter une étape. La première étape est un fond balayage préprogrammé, qui est automatiquement intégré dans le programme une fois &#39;ajouter une étape&#39; est choisi. </li><li> Entrez les détails du programme souhaités pour l&#39;étape 2 du programme RTCA, qui va enregistrer des lectures lors de l&#39;établissement de la monocouche LP9. Ajouter les intervalles de temps entre les lectures d&#39;impédance en sélectionnant l&#39;onglet «Interval» et entrer dans &#39;15 minutes &#39;. Ajouter durée expérimentale en sélectionnant la &#39;Durée&#39; onglet und entrer dans un temps compris entre 12-24 heures. </li><li> Pour ajouter des étapes suivantes, cliquez sur l&#39;onglet &quot;Calendrier&quot; et un clic droit sur «Ajouter une étape &#39;et entrez les détails des mesures supplémentaires, comme ci-dessus. Étape 3 du programme RTCA dirigera l&#39;instrument pour prendre des lectures lors de l&#39;invasion sphéroïde; entrer &#39;5 min »sous le« Interval »onglet et &#39;48 h &#39;sous l&#39;onglet&#39; Durée &#39;. </li><li> Sélectionnez «Plate» sur la barre de menu et enregistrer. </li></ol></li><li> Génération de LP9 monocouche et évaluation de sphéroïde Invasion <ol><li> Placer la plaque dans CIM instrument RTCA et programme ouvert à l&#39;étape 3.2 ci-dessus. Avant d&#39;ajouter des cellules, sélectionnez «Exécuter» dans la barre de menus, puis sur «Démarrer». Un balayage de fond sera automatiquement effectuée (étape 1 dans les instructions du logiciel RTCA). </li><li> Retirer la plaque CIM de l&#39;instrument suivant le balayage de fond et le placer dans une hotte de culture de tissus. </li><li> Plaque 50,000 LP9 cellules en suspension dans 160 ul GDF dans la chambre supérieure de chaque plaque CIM bien. </li><li> Placer la plaque dans l&#39;instrument RTCA et prendre des lectures toutes les 15 minutes alors que la monocouche LP9 établit nuit (étape 2 du programme RTCA). </li><li> Sphéroïdes de cancer de récolte générés à l&#39;étape 2 «Génération de sphéroïdes méthylcellulose», ci-dessus. <ol><li> Aseptique, couper 1 mm sur le dessus d&#39;une pointe de pipette de 1 ml et utiliser pour récupérer doucement le contenu de chaque puits. Transférer dans un tube stérile. </li><li> Centrifugeuse sphéroïdes à 120 g pendant 8 min, puis retirez la méthylcellulose contenant du milieu par aspiration douce. </li><li> Laver deux fois plus sphéroïdes avec du PBS, une centrifugation à 120 g pendant 8 min pour sédimenter les sphéroïdes après chaque lavage. </li><li> Pour chaque puits expérimental, remettre en suspension un total de 10 sphéroïdes à 160 ul de milieu sans SVF. </li><li> Pause de l&#39;expérience RTCA en sélectionnant &#39;Exécuter&#39; dans la barre de menu et de vérifier et# 8216; Pause. Retirer la plaque CIM de l&#39;instrument, et le placer dans une hotte de culture de tissus. Aspirer les médias de chaque puits et les remplacer par les médias sphéroïde contenant (10 sphères 160 pi) ou du milieu frais pour les puits de contrôle LP9 seule. </li></ol></li><li> Retour de la plaque à l&#39;instrument RTCA. Sélectionnez «Exécuter» dans la barre de menu et cocher &quot;Abandonner étape. Le programme se déplace à l&#39;étape suivante automatiquement. Pour reprendre l&#39;expérience, sélectionnez «Exécuter» dans la barre de menu et cochez &quot;Démarrer / Continuer». Étape 3 dans le programme RTCA lancera. </li></ol></li><li> Analyse des données <ol><li> Pour déterminer le niveau de l&#39;invasivité de cellules sphéroïde, soustraire les valeurs obtenues pour la monocouche de LP9 seulement d&#39;après les valeurs obtenues pour les différentes lignées de cellules ovariennes de cancer à chaque point de temps. </li><li> Pour tracer &#39;invasion sphéroïde », normaliser toutes les valeurs au point au cours de laquelle les sphéroïdes ont été ajoutés à la plaque de temps, en sise ce point de temps à &#39;0 &#39;. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+worldwide+burden+of+cancer+in+2008%3A+GLOBOCAN%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN.</a> Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).</li>
<li>Ahmed, N., Stenvers, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+know+ovarian+cancer+ascites%3A+opportunities+for+targeted+therapy-+based+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li>
<li>Karst, A. M., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+pathogenesis%3A+a+model+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution.</a> J Oncol. 2010, (2010).</li>
<li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+development+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer development and metastasis.</a> Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).</li>
<li>Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+spheroids+in+ovarian+cancer+metastases%3A+Biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology.</a> Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).</li>
<li>Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+plasticity+of+neoplastic+ovarian+epithelium%3A+unique+cadherin+profiles+in+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).</li>
<li>Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurleson%2C+KM+%22J+Transl+Med%22">J Transl Med</a>. 4, 6(2006).</li>
<li>Burleson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).</li>
<li>Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+spheroids+disaggregate+on+type+I+collagen+and+invade+live+human+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers.</a> Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).</li>
<li>Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+steps+of+ovarian+cancer+cell+metastasis+are+mediated+by+MMP-2+cleavage+of+vitronectin+and+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin.</a> J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).</li>
<li>Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+First+Line+of+Abdominal+Metastatic+Attack%3A+Breaching+the+Mesothelial+Cell+Layer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer.</a> Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).</li>
<li>Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+confrontation+assay%3A+a+simple+method+to+monitor+the+three-dimensional+migration+of+different+cell+types+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro.</a> Ann Anat. 193, 181-184 (2011).</li>
<li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).</li>
<li>Latifi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumor+cells+from+the+ascites+of+ovarian+cancer+patients%3A+molecular+phenotype+of+chemoresistant+ovarian+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+mesothelial+clearance+assay+that+models+the+early+steps+of+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li>
<li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).</li>
<li>Nishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+steroidogenic+human+granulosa-like+tumor+cell+line%2C+KGN%2C+that+expresses+functional+follicle-stimulating+hormone+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor.</a> Endocrinology. 142, 437-445 (2001).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outcome+of+heregulin-induced+activation+of+ovarian+cancer+cells+depends+on+the+relative+levels+of+HER-2+and+HER-3+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression.</a> Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).</li>
</ol>

Frais d’accès ouvert payés par ACEA Biosciences, Inc. et l’Institut de recherche médicale MIMR-PHI.

Invasion des cellules cancéreuses de l&#39;ovaire interagissent avec une variété de types de cellules à la surface du péritoine, y compris des fibroblastes, des adipocytes et des cellules mésothéliales, et une communication bidirectionnelle entre les cellules cancéreuses et les cellules peritoneales sont supposés jouer un rôle clé dans la conduite du processus métastatique 2. Une fois maîtrisé, le protocole décrit ci-après est facilement adaptable à l&#39;étude de ces interactions à l&#39;intérieur de la micro-péritonéale, par exemple, par l&#39;addition de cytokines exogènes, facteurs de croissance, ou des inhibiteurs spécifiques aux chambres supérieure ou inférieure de la plaque CIM puits ou d&#39;une manipulation génétique du cancer ou des lignées de cellules péritonéales. En outre, cette méthode peut être utilisée avec des cellules tumorales ovariennes primaires fraîchement récoltées à partir d&#39;ascites malignes et / ou des cellules primaires du péritoine pour mieux comprendre directe dans les signaux de régulation et les interactions cellulaires qui gouvernent la création d&#39;une lésion métastatique à l&#39;intérieur de la cavité péritonéale <sjusqu&#39;à&gt; 2. L&#39;utilisation de l&#39;instrument RTCA pour mesurer la capacité d&#39;invasion des cellules ou des sphéroïdes simples offre plusieurs avantages par rapport aux tests finaux simples classiques et analyse d&#39;image temps-lapse. L&#39;instrument mesure la RTCA invasion cellulaire à des intervalles définis de façon continue au cours d&#39;un dosage, ce qui peut prendre des heures ou des jours. Cela permet la détermination des changements dans le taux d&#39;invasion dans le temps, qui surmonte les limitations des essais de point de terminaison unique. Par exemple, l&#39;examen des données de l&#39;invasion des différentes lignées cellulaires de cancer à un seul critère (figure 2), par exemple, 3 heures, aurait pu conduire à la conclusion erronée que KGN et OVCA433 cellules étaient beaucoup plus invasive que OVCA429 cellules. Un autre avantage de cette technologie est que l&#39;instrument RTCA mesure les variations de l&#39;impédance électrique. Cela signifie que les tests peuvent être exécutés sans marquage des cellules avec un agent exogène, ce qui pourrait avoir des effets inattendus sur phen cellulaireOTYPE ou fonction. Cela devient particulièrement important lorsque l&#39;on étudie les cellules cancéreuses ovariennes primaires dérivés de l&#39;ascite maligne, avec lesquels il est impératif de garder les manipulations au minimum afin d&#39;éviter l&#39;introduction de changements moléculaires et phénotypiques qui ne sont pas le reflet de leur nature in vivo 2. En outre, l&#39;utilisation de l&#39;instrument RTCA permet la collecte de données quantitatives en temps réel, ce qui, non seulement évite la fastidieuse analyses associées à la microscopie time-lapse mais également permet la détermination rapide de fenêtres expérimentales clés pour l&#39;optimisation du dosage. Ceci est particulièrement utile lorsque l&#39;on compare les effets d&#39;une série de facteurs sur l&#39;invasion sphéroïde, comme différents facteurs peuvent exercer leurs effets maximaux à différents points dans le temps ou avec beaucoup profils différents au fil du temps. Bien que ce protocole est susceptible de modifications (par exemple, l&#39;utilisation de différents matrice ECM, différentes lignées cellulaires de cancer, ou différents cel ciblels), si une telle mesure, il est important de noter que les diverses conditions expérimentales doivent d&#39;abord être optimisés. Par exemple, avant de commencer les études d&#39;invasion sphéroïde, le nombre optimal de cellules cancéreuses / plaque CIM puits doit tout d&#39;abord être déterminée par dosage du nombre de cellules dans les titrages culture monocouche. Le nombre optimal de sphéroïdes à utiliser par puits est alors basé sur cette analyse. Par exemple, dans le procédé actuel, sphéroïdes comprennent environ 3000 cellules lorsque chaque première généré. Si initiales titrages nombre de cellules indiquent que 30 000 cellules monocouche sont optimales pour la détection dans l&#39;invasion des analyses, puis 10 sphéroïdes sont ajoutés par plaque de CIM bien. En outre, lorsque la conduite d&#39;expériences de co-culture, il est important d&#39;étudier les comportements de la monocouche de cellule «cible» séparément afin de déterminer si ces cellules sont par nature invasive, ce qui pourrait brouiller les résultats. Dans l&#39;exemple montré, les sphéroïdes de cancer sont plaquées sur le dessus d&#39;une cellule Monola LP9yer, avec et sans FBS ajouté au bas ainsi qu&#39;un chemoattractant. En parallèle, les cellules sont cultivées LP9 seul, dans chaque condition de traitement. De même, lorsque l&#39;on étudie la capacité d&#39;invasion des cellules et des sphéroïdes, il est également important d&#39;examiner leurs capacités migratoires ainsi afin de distinguer les deux comportements (c.-à-invasion nécessite la digestion protéolytique d&#39;une barrière ECM alors que la migration ne fonctionne pas). Pour ce faire, omettre la barrière de l&#39;ECM (3.1.1 - 3.1.3) et effectuer le test en parallèle avec la barrière de l&#39;ECM en place. Cette dernière mesure «d&#39;invasion» peut être corrigée à l&#39;ancienne mesure de «migration», si désiré. Enfin, il est important de noter que les informations obtenues à partir de mesures de l&#39;impédance électrique d&#39;une portée limitée: une fois que les cellules ont envahi dans la chambre inférieure, les variations de leur fixation, la propagation, la prolifération et sur la face inférieure de la membrane peuvent contribuer aux changements de impédance reabosses. Par conséquent, cette méthode est la plus informative lorsqu&#39;il est utilisé conjointement avec d&#39;autres tests de viabilité sphéroïde cellulaire, l&#39;adhérence, la migration et la morphologie afin d&#39;évaluer globalement les comportements cellulaires sphéroïde. Par exemple, dans l&#39;idéal, afin de bien comprendre les interactions sphéroïde mésothéliales, co-cultures distinctes devraient également être visualisés périodiquement en microscopie de phase standard, de sorte que les évaluations qualitatives des sphéroïde morphologie et de la santé peuvent être faites en parallèle avec les tests RTCA quantitatives de l&#39;invasion. Si l&#39;étape de marquage facultatif est effectué, puis les comportements des cellules cancéreuses individuelles peuvent être déterminées par microscopie fluorescente ils ventilent de la sphéroïde et interagissent avec les cellules mésothéliales non étiquetés. Un avantage supplémentaire de marquage par fluorescence les cellules cancéreuses lors de la co-culture avec un second type de cellule est qu&#39;il est alors possible de confirmer que seules les cellules cancéreuses ont envahi à travers les barrières cellulaires et ECM. <p class="jove_content"&gt; En résumé, cette méthode représente une analyse quantitative à haut débit de l&#39;ovaire invasion sphéroïde de cancer de mésothéliales et ECM obstacles. Grâce à l&#39;addition de cytokines exogènes, facteurs de croissance, ou des inhibiteurs spécifiques aux cavités supérieures ou inférieures de la plaque de CIM ainsi, ce procédé permet un rapide, la détermination des facteurs qui régulent les interactions entre les cellules sphéroïdes de cancer de l&#39;ovaire invasion à travers mésothéliales et les barrières de matrice au-dessus de temps.

Cancer de l&#39;ovaire a le taux de mortalité le plus élevé de tous les cancers gynécologiques 1. Dans le monde, il ya ~ 230 000 cas et plus de 100 000 décès dus à la maladie chaque année 1. La plupart des patients (&gt; 75%) sont diagnostiqués après le cancer a déjà métastasé, lorsque le traitement est encore compliquée par l&#39;augmentation de la résistance à la chimiothérapie et le pronostic est médiocre 2. Les patients de stade III-IV maladie métastatique ont des taux de survie à 5 ans de seulement 30-40% 3. Ainsi, il ya un besoin urgent d&#39;une meilleure compréhension des comportements cellulaires qui sous-tendent les métastases du cancer de l&#39;ovaire afin de traiter efficacement la maladie avancée. Le modèle actuel de la métastase de cancer de l&#39;ovaire propose plusieurs étapes du processus métastatique, dont chacune a lieu dans un micro-environnement distinct qui a une incidence sur le comportement de la tumeur. Métastases de cellules cancéreuses de l&#39;ovaire initialement tombent à partir du site de la tumeur primaire et de survivre dans un nonadherEtat ent au sein du liquide péritonéal forme de cellules isolées ou de structures multicellulaires tridimensionnels, dite agrégats ou des sphéroïdes multicellulaires 2,4,5. Les cellules qui ne forment pas des sphéroïdes en suspension sont plus sensibles à anoikis 2,4,5. Sphéroïdes présentent également une résistance à des agents chimiothérapeutiques ont augmenté, contribuant à la maladie résiduelle et la récurrence subséquente de la 2,4,5 de cancer. Une deuxième étape critique dans la métastase de cancer de l&#39;ovaire est la transition d&#39;agrégats de clusters libres flottant à des tumeurs secondaires établis dans la paroi péritonéale et épiploon 5,6. Interactions cellule-cellule et cellule-substrat ont été impliqués dans la formation d&#39;agrégats, la survie et l&#39;adhésion à la matrice extracellulaire (MEC) produite par la muqueuse mésothéliales du péritoine 4-11. Pour l&#39;instant, ces processus sont encore mal compris. Pour définir les mécanismes impliqués dans la diffusion des cancers de l&#39;ovaire, sphéroïdes peuvent être généralementATED à partir de lignées de cellules cancéreuses établies à l&#39;aide de méthodes de culture non adhérentes, le maintien de cellules en suspension, soit en ajoutant de la méthylcellulose à des milieux de culture 12,13 ou par culture de cellules sur des plaques de fixation à faible 2,14. Lorsque cultivées de cette manière, les cellules de cancer ovarien s&#39;assemblent en agrégats multicellulaires ou de sphéroïdes qui présentent des propriétés cellulaires, moléculaires, biochimiques et similaires à ceux des agrégats de la tumeur in vivo trouvé 2,14. Après formation, les sphéroïdes peuvent être ensuite récoltés à partir du milieu non adhérent et à nouveau ensemencées sur une variété de surfaces solides pour des études fonctionnelles. Ceci représente un progrès par rapport à des dosages en culture monocouche, qui ne sont pas de modéliser avec précision le comportement des cellules de cancer ovarien métastases au sein d&#39;un environnement non-adhérent tel que le fluide par voie intrapéritonéale. La capacité d&#39;invasion des sphéroïdes de cancer peut être évaluée dans des essais finaux traditionnels dans Boyden chambres 2 </sup&gt;, mais cette approche peut être trompeur, comme l&#39;invasion des cellules de cancer de l&#39;ovaire est un processus dynamique au fil du temps. Une méthode en temps réel récente a été conçu en utilisant time-lapse vidéo-microscopie de la clairance de cellules mésothéliales en envahissant sphéroïdes de cancer de l&#39;ovaire 15,16; Cependant, l&#39;analyse des données laps de temps prend du temps et peut être subjective. Ici, un procédé rapide, quantitatif pour évaluer les comportements invasifs de sphéroïdes de cancer ovarien en temps réel est décrit. Tout d&#39;abord, un modèle de cellules mésothéliales-ellipsoïde a été établi, qui représente la phase de la métastase de cancer de l&#39;ovaire lors de sphéroïdes multicellulaires fixent à et envahissent le péritoine pour former des tumeurs secondaires. Ensuite, la méthodologie pour un analyseur en temps réel portable (RTCA, voir le tableau des matériaux pour les détails de la société) a été adapté pour mener de véritables mesures quantitatives de temps de la capacité invasive de différentes lignées cellulaires de cancer de l&#39;ovaire cultivées sous forme de sphéroïdes et testées dans ce modèle. Dans le RTCAinstrument, les réponses cellulaires sont contrôlées en permanence au cours d&#39;un dosage, sans la nécessité d&#39;étiquettes exogènes, en mesurant les variations de l&#39;impédance électrique. Des plaques de culture spécialement conçus ont microélectrodes d&#39;or revêtues situées en dessous d&#39;une membrane microporeuse à l&#39;interface entre les chambres supérieure et inférieure d&#39;un puits 2 chambrés (plaques &quot;ICM&quot;). L&#39;emplacement des électrodes dans la chambre inférieure permet de mesurer des variations de l&#39;impédance électrique en tant que cellules envahissent à travers un ou ECM ECM / barrière cellulaire. L&#39;interface de la membrane entre les deux chambres de chaque plaque ainsi CIM est tout d&#39;abord revêtu avec le composant ECM d&#39;intérêt. Dans le système de modèle de cellule sphéroïde-mésothéliales, l&#39;interface est revêtue d&#39;une couche de Matrigel (voir la table des matières pour les détails de l&#39;entreprise), de mimer l&#39;ECM complexe qui sous-tend la doublure mésothéliales du péritoine, suivie d&#39;une monocouche confluente de mésothéliales humaines &#39; «cellules cibles. Enfin, sphéroïdes de cancer de l&#39;ovaire préformés sont added. Les cellules de cancer ovarien sphéroïdes doivent envahir activement à travers la couche de cellules cibles et de la matrice pour accéder à la chambre inférieure et de modifier les lectures d&#39;impédance électrique. Les cellules cibles sur leurs propres sont également évalués pour s&#39;assurer qu&#39;ils ne sont pas envahir à travers la couche de matrice et peuvent être utilisés dans ce dosage.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence RTCA DP Analyseur</td><td>ACEA biosciences</td><td>RTCA DP</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence CIM plates&nbsp ;</td><td>ACEA biosciences</td><td>5665817001</td><td></td></tr><tr><td>Cell TraceTM CFSE&nbsp ;</td><td>Sondes moléculaires</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Méthylcellulose (4 000 centipose)</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Moyen 199&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie&nbsp ;</td><td></td><td></td>11150067</tr><tr><td>Ham F-12 Nutrient</td><td>mix Life Technologies&nbsp ;</td><td></td><td></td>11765062</tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique (EGF)</td><td>PeproTech&nbsp ;</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture concave à 96 puits&nbsp ;</td><td>Grenier Bio-One</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>LP9 Lignée cellulaire mésothéliale humaine</td><td>Institut Coriell de recherche médicale.</td><td></td><td></td>AG07086</tr><tr><td>Matrice matrigel à facteur de croissance réduit</td><td>BD Biosciences&nbsp ;</td><td>Référence 354230</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de cancer de l&#39;ovaire spheroid attachement et l&#39;invasion des cellules mésothéliales en temps réel

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Cancers de l&#39;ovaire métastasent en versant dans le liquide péritonéal et la dispersion des sites distaux dans le péritoine. Des cultures monocouches ne modélisent pas avec précision le comportement des cellules cancéreuses au sein d&#39;un environnement non adhérentes, comme les cellules cancéreuses se rassemblent en soi dans les structures multicellulaires qui contribuent au processus métastatique et en attachant à envahir le péritoine pour former des tumeurs secondaires. Pour modéliser cette étape importante de métastases de cancer ovarien, agrégats multicellulaires, ou sphéroïdes, peut être généré à partir de lignées de cellules de cancer de l&#39;ovaire établis maintenus dans des conditions non-adhérentes. Pour imiter le micro-péritonéale rencontrée par les cellules tumorales in vivo, un modèle de co-culture sphéroïde-mésothéliales a été créé en sphéroïdes préformés qui sont plaquées sur le dessus d&#39;une monocouche de cellules mésothéliales humaines, formée par-dessus une barrière de matrice extracellulaire. Méthodes ont ensuite été développées en utilisant un analyseur de cellules en temps réel pour effectuer réel quantitativeLes mesures de temps de la capacité d&#39;invasion des différentes lignées de cellules de cancer ovarien cultivées sous forme de sphéroïdes. Cette approche permet la mesure en continu de l&#39;invasion sur de longues périodes de temps, ce qui présente plusieurs avantages sur les dosages de point final traditionnels et des analyses d&#39;image plus laborieuse réel de microscopie temps. En bref, cette méthode permet une rapide, la détermination des facteurs qui régissent les interactions entre les cellules sphéroïdes de cancer ovarien invasion par mésothéliales et matrice des obstacles au fil du temps.

Sphéroïdes du cancer des ovaires peuvent être générés à partir de nombreux types de lignées cellulaires en les cultivant en suspension ou en récoltant les cellules tumorales primaires à partir de l&#39;ascite maligne 2,14. Ici deux lignes épithéliaux de l&#39;ovaire de cellules cancéreuses, et OVCA433 OVCA429, et une lignée tumorale de cellules de la granulosa de l&#39;ovaire, KGN, ont été utilisées pour générer des sphéroïdes (Figure 1A). Dans cette méthode, les cellules sont cultivées dans des puits à fond en U pendant la suspension dans des milieux qui ont été faites visqueuse par l&#39;addition de méthylcellulose. Dans ces conditions, de nombreuses cellules cancéreuses de l&#39;ovaire présentent une capacité inhérente à s&#39;agréger pour former des sphéroïdes 13. Après une nuit de culture en suspension dans de la méthylcellulose / médias, les trois lignées de cellules formées structures sphéroïdes compacts d&#39;environ 400-500 m de diamètre (figure 1A). Pendant ce temps, la plaque RTCA CIM est préparé, tout d&#39;abord par revêtement de l&#39;interface de la membrane poreuse avec la matrice, puis une monocouche confluente de mes humainescellules othelial (figure 1B). Une fois formées, les sphéroïdes sont ensuite transférées à la plaque CIM préparé. Sphéroïdes cancéreuses récoltés sont plaquées sur le dessus de la monocouche LP9 et évalués comme décrit ci-dessous. Images sous microscopie de phase standard (ou sous microscopie à fluorescence, si l&#39;étape de marquage des cellules en option) a été suivie de cultures parallèles sont prises périodiquement pour aider à l&#39;interprétation des données RTCA (figure 1C). Il est instructif d&#39;évaluer à la fois le niveau de base de l&#39;invasion d&#39;une lignée de cellules de cancer, ainsi que d&#39;invasion induite chimioattractant. Typiquement, l&#39;invasivité basal est mesuré par l&#39;addition de SFM à la fois les chambres supérieure et inférieure. Milieu complet (FBS à 10%), qui contient de nombreux agents chimio-attractifs potentiels, est utilisé dans le présent exemple pour examiner invasion &#39;induite chimioattractant-&#39; (Figure 2). Des études parallèles de cellules mésothéliales LP9 seuls ont confirmé que ces cellules sont très peu eninvasives plus de 2 jours dans une ou l&#39;autre base ou «chemoattractant« conditions induites et donc étaient un bon type de cellules à utiliser dans des essais de co-culture avec des cellules de cancer de l&#39;ovaire (Figures 2A et 2B). Par contraste, les sphéroïdes de cancer ovarien générés en utilisant n&#39;importe lequel des trois lignées cellulaires ont montré la capacité d&#39;envahir vers un agent chimio-attractif (FBS) (Figures 2A-2C). L&#39;avantage majeur de l&#39;utilisation des instruments en temps réel RTCA sur les essais finaux traditionnels est que les changements dans le comportement cellulaire / sphéroïde peuvent être quantifiés dans le temps. Au cours de l&#39;essai de deux jours, les lignées cellulaires OVCA433 KGN, OVCA429, et tous ont présenté la capacité à envahir vers un agent chimio-attractif (indiqué par l&#39;augmentation des indices de cellule), mais de faibles niveaux de base de l&#39;invasion (figure 2C). Les lignées cellulaires présentaient des taux similaires d&#39;invasion, comme indiqué par les pentes des courbes parallèles (Figure 2C); Cependant, la courbe OVCA429 présentait une asymptote supérieure plus élevée,qui ont indiqué un niveau maximal plus élevé de l&#39;invasion par rapport aux autres lignées cellulaires. En outre, les lignées cellulaires présentaient des différences dans leurs temps d&#39;apparition de l&#39;invasion, aux cellules KGN envahir rapidement les barrières cellulaires et de la matrice et la OVCA433 OVCA429 cellules et en prenant 3 à 5 fois plus d&#39;envahir, respectivement (figure 2D). Surtout, leurs comportements à l&#39;apparition d&#39;invasion n&#39;étaient pas prédictive de leur capacité globale de l&#39;invasion (figures 2C et 2D). Ceci suggère différentes capacités inhérentes des lignées cellulaires de cancer, mais aussi peut indiquer que différents facteurs peuvent réguler les comportements invasifs précoces et tardifs de sphéroïdes. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1 génération sphéroïde et le modèle de expérimental mis en place A:.. Images sous microscope à contraste de phase de sphéroïdes formant dans la méthylcellulose / médias (en haut) et de la ligne de cellule d&#39;adaptation grandi comme une monocouche (bas) B:. Schéma montrant la RTCA 2 chambré plaque CIM bien mis en place, dans lequel préformé cancer de l&#39;ovaire sphéroïdes sont plaquées sur le dessus d&#39;une monocouche d&#39;une couche mésothéliale LP9 / matrice barrière dans la chambre supérieure et des médias ± FBS comme un agent chimio-attractif est ajouté à la chambre inférieure. Électrodes en dessous de l&#39;interface de la mesure 2 chambres de plus en plus l&#39;impédance électrique de plusieurs cellules envahissent les barrières à la chambre inférieure C:. Images de sphéroïdes KGN sur le dessus de la monocouche LP9 au microscope à contraste de phase (à gauche) ou la microscopie à fluorescence (à droite). Barres d&#39;échelle = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> .. Figure 2 des données d&#39;invasion de sphéroïde cancer de l&#39;ovaire en temps réel A - B: Les résultats représentatifs de l&#39;invasion essai RTCA menée avec et sans FBS dans la chambre inférieure d&#39;une plaque CIM bien. L&#39;invasion des cellules KGN est comparée à des cellules mésothéliales LP9. Les résultats sont présentés en moyenne ± écart-type Indice Cellulaire à partir de puits en triple à l&#39;heure timepoint 24 (A) et sur ​​une période d&#39;essai de deux jours, l&#39;ensemble de (B) C - D:. Une comparaison de la capacité d&#39;invasion des KGN, OVCA429, et cellule OVCA433 lignes représentées sur une période de 24 heures (C) et de façon plus détaillée sur une période de temps de 2,5 h (D).

L&#39;invasion des cellules de cancer ovarien dans la garniture de mésothéliales du péritoine est un processus dynamique dans le temps. Utilisant un véritable analyseur de temps, la capacité d&#39;invasion des cellules cancéreuses de l&#39;ovaire dans un modèle sphéroïde mésothélial co-culture de cellules peut être quantifié sur des périodes de temps prolongées, apportant des éclairages sur les facteurs régissant le processus métastatique.

Évaluation de Cancer de l&#39;ovaire Spheroid attachement et l&#39;invasion des cellules mésothéliales en temps réel

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

L'objectif général de cette procédure est de quantifier rapidement, en temps réel, l'invasion des cellules cancéreuses de l'ovaire dans un modèle de co-culture avec des cellules mésotéliales en présence d'agrégats cellulaires, reproduisant ainsi les conditions de métastase. Cette approche repose tout d'abord sur la génération de cellules cancéreuses de l'ovaire à partir de lignées cellulaires, en cultivant ces cellules dans des conditions non adhérentes en présence de méthylcellulose. La deuxième étape consiste à préparer un analyseur cellulaire en temps réel, une plaque CIM, en recouvrant la chambre supérieure des puits à deux compartiments avec du Matrigel, afin de simuler la membrane basale située sous le mésothélium de la cavité péritonéale ainsi que le revêtement mésothélial lui-même.Ensuite, les stéroïdes du cancer de l'ovaire sont récoltés et ajoutés aux chambres supérieures des puits de la plaque de l'analyseur en temps réel. La dernière étape consiste à programmer et à démarrer l'analyseur cellulaire en temps réel, qui effectuera des mesures périodiques à des intervalles prédéfinis pendant une période prolongée de l'essai. En fin de compte, les résultats obtenus illustrent le processus d'envahissement continu, utilisé pour déterminer les facteurs clés régulant les cellules du cancer de l'ovaire lorsqu'elles franchissent les barrières cellulaires et matricielles.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les tests standards d'envahissement cellulaire cancéreux, réside dans sa capacité à permettre des mesures continues de l'envahissement des cellules cancéreuses sur des périodes prolongées. Contrairement à un test à point final unique, qui ne rend pas pleinement compte de la nature dynamique des métastases du cancer de l'ovaire, cette méthode, bien qu'utilisée pour mieux comprendre le cancer de l'ovaire, peut également s'appliquer à l'étude de divers types de processus métastatiques, tels que le cancer du sein ou la migration des cellules cancéreuses à travers une couche endothéliale. De même, elle peut être utilisée pour étudier l'envahissement cellulaire normal, comme l'envahissement des trophoblastes durant l'implantation de l'embryon. Pour préparer les cellules cancéreuses de l'ovaire au marquage fluorescent des cellules.Prélevez d'abord les cellules à une confluence de 75 % et resuspendez-les à une concentration finale d'un million de cellules par millilitre dans un millilitre de PBS préchauffé contenant 0,1 % de BSA. L'ajout de la quantité optimale de stéroïde par puits et la manipulation soigneuse du stéroïde sont essentielles à la réussite de cette procédure. Ensuite, ajoutez deux microlitres d'une solution mère de Cell Trace CSFE à cinq millimolaire aux cellules pour atteindre une concentration finale de 10 micromolaire, puis incubez de 10 à 15 minutes à 37 degrés Celsius. Dans un bain-marie, arrêtez la réaction en ajoutant un millilitre de milieu glacé contenant 10 % de FBS, puis re-pelletez par centrifugation. Resuspendez dans 10 millilitres de milieu de croissance approprié préchauffé et semez les cellules dans un flacon de culture de 75 centimètres carrés à bouchon filtrant, à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, jusqu'à ce que le niveau de marquage fluorescent soit suffisant pour être détecté.Commencez cette procédure en mesurant le volume de milieu de culture approprié pour chaque lignée cellulaire, soit 15 millilitres moins le volume de cellules nécessaire à la formation des sphéroïdes. Ajoutez trois millilitres de solution mère de méthylcellulose au milieu de culture afin d'obtenir une concentration finale de méthylcellulose de 20 %, puis mélangez soigneusement par retournements doux. Ajoutez 300 000 cellules au milieu contenant de la méthylcellulose et mélangez soigneusement par retournements doux. Pipetez 150 microlitres du mélange de cellules en milieu à base de méthylcellulose dans chaque puits d'une plaque de culture de 96 puits à fond concave.Cela permettra d'obtenir une culture totale de 3000 cellules par puits à 37 degrés Celsius, sous 5 % de dioxyde de carbone, pendant un à quatre jours ou jusqu'à l'obtention d'une formation uniforme de PHE. Généralement, un stéroïde par puits est observé ; l'analyseur cellulaire en temps réel ou le test d'invasion cellulaire RTCA utilise une plaque CIM à deux chambres et 16 puits RTCA. En travaillant par groupes de quatre puits à la fois, ajouter 50 microlitres de matrice dans chaque puits de la chambre supérieure de la plaque afin de garantir que toute la surface soit recouverte.Retirer lentement 30 microlitres de matrice immédiatement afin d'éliminer tout excès de liquide. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant quatre heures avant utilisation dans un incubateur de culture tissulaire. Après quatre heures, ajouter 30 microlitres de milieu sans sérum, adapté à chaque lignée cellulaire cancéreuse, dans la chambre supérieure et 160 microlitres de milieu avec ou sans sérum.Suivant le plan expérimental relatif à la chambre inférieure, assembler la plaque CIM en cliquant la chambre inférieure dans la chambre supérieure et équilibrer dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Pendant une heure dans un incubateur de culture tissulaire, ouvrir le programme RTCA et sélectionner l'onglet disposition. Sélectionner toutes les puits expérimentaux, cliquer avec le bouton droit sur les puits et choisir d'activer les puits.Ensuite, remplissez les conditions expérimentales et les noms des ventes selon vos besoins. Pour ajouter des étapes ou des sous-étapes au programme, sélectionnez l'onglet planning et cliquez avec le bouton droit pour ajouter une étape. La première étape est une balayage de fond préprogrammé, qui est automatiquement intégré au programme.Une fois qu'une étape a été ajoutée, saisissez les détails souhaités du programme pour la deuxième étape du programme RTCA, qui enregistrera les mesures pendant l'établissement de la monocouche de neuf cellules mésothéliales humaines LP. Ajoutez les intervalles de temps entre les mesures d'impédance en sélectionnant l'onglet intervalle et en indiquant 15 minutes. Ajoutez la durée de l'expérience en sélectionnant l'onglet durée et en indiquant un temps compris entre 12 et 24 heures.Les étapes suivantes sont ajoutées de la même manière. L'étape trois du programme RTCA dirigera l'appareil pour effectuer des mesures pendant l'invasion par frid. Saisissez cinq minutes dans l'onglet intervalle et 48 heures dans l'onglet durée.Sélectionnez « plate » dans la barre de menu et enregistrez. Pour commencer cette procédure, placez la plaque CIM dans l'instrument RTCA et ouvrez le programme qui a été enregistré précédemment. Sélectionnez « exécuter » dans la barre de menu, puis démarrez : un balayage de fond sera automatiquement effectué.Après le balayage de fond, retirez la plaque CIM de l'appareil et placez-la dans une hotte de culture tissulaire. Suspendez 50 000 cellules LP nine dans 160 microlitres de milieu sans sérum et ajoutez-les dans la chambre supérieure de chaque plaque CIM. Placez ensuite la plaque dans l'appareil RTCA et effectuez des mesures toutes les 15 minutes pendant que la monocouche de cellules LP nine s'établit durant la nuit. Le jour suivant, coupez aseptiquement un millimètre au sommet d'une pipette de 1 mL et utilisez-la pour prélever délicatement le contenu de chaque puits pour chaque lignée cellulaire.Rassembler 10 stéroïdes dans un tube stérile et centrifuger à 120 ×g pendant huit minutes, puis éliminer le milieu contenant la méthylcellulose par aspiration douce. Laver les sphéroïdes deux fois supplémentaires avec du PBS en centrifugeant à 120 ×g pendant huit minutes pour former un culot de stéroïdes après chaque lavage.Pour chaque puits expérimental, ajoutez un total de 10 stéroïdes dans 160 microlitres de milieu sans PBS. Mettez en pause l'expérience RTCA en sélectionnant « exécuter » dans la barre de menu et en cochant « pause ». Retirez la plaque CIM de l'appareil et placez-la dans une hotte de culture tissulaire.Aspirez le milieu de chaque puits et remplacez-le par un milieu contenant des stéroïdes. Replaquez la plaque dans l'appareil RTCA. Sélectionnez « exécuter » dans la barre de menu et cochez l'étape d'arrêt.Le programme passera automatiquement à l'étape suivante. Pour reprendre l'expérience, sélectionnez exécuter dans la barre de menu et cochez démarrer continuer. L'étape trois du programme RTCA lancera dans cette expérience deux lignées cellulaires de cancer épithélial de l'ovaire, OVCA 4 33 et OVCA 4 29, ainsi qu'une lignée de tumeur cellulaire granuleuse ovarienne.Des cellules KGN ont été utilisées pour produire des stéroïdes après une culture nocturne et des puits en U contenant des milieux avec de la méthylcellulose. Les trois lignées cellulaires ont formé des structures stéroïdiennes compactes d’environ 400 à 500 micromètres de diamètre. Les panneaux inférieurs montrent la lignée cellulaire correspondante cultivée en monocouche.Les barres représentent 100 micromètres une fois formées. Les stéroïdes ont été récoltés et ensemencés en surcouche d'une monocouche de cellules mésothéliales LP9 dans une plaque R-T-C-A-C-I-M. Des images en microscopie de contraste de phase ou en microscopie fluorescente de cultures parallèles ont été prises périodiquement afin d'aider à l'interprétation des données RTCA.Il est instructif d'évaluer à la fois la couche basale d'invasion d'une lignée cellulaire cancéreuse et l'invasion induite par un chémotactisme. Dans cet exemple, l'invasivité basale est mesurée en ajoutant un milieu sans sérum (SFM) dans les deux chambres, supérieure et inférieure. Un milieu complet contenant 10 % de FBS, qui renferme de nombreux chémoattractants potentiels, est utilisé pour examiner l'invasion induite par des chémoattractants.Les résultats présentés ici sont représentatifs d'une comparaison de l'invasion cellulaire entre les cellules KGN et les cellules mésothéliales LP9. Le test d'invasion RTCA a été réalisé avec et sans FCS dans la chambre inférieure d'une plaque CIM. Les résultats sont exprimés comme l'indice cellulaire moyen positif moins l'écart-type (SD) provenant de puits triplicates au point temporel de 24 heures et sur l'ensemble de la période du test s'étendant sur deux jours.Ces résultats confirment que les cellules LP9 sont faiblement invasives sur une période de deux jours, que ce soit dans des conditions basales ou induites par un chémotactique, et constituent donc un bon type cellulaire à utiliser dans des essais de co-culture avec des cellules cancéreuses ovariennes. En revanche, les cellules KG et les stéroïdes des cellules cancéreuses ovariennes ont montré une capacité à envahir en direction d'un chémotactique. Ce graphique présente les résultats d'une comparaison de la capacité invasive des lignées cellulaires K-G-N-O-V-C-A 4 29 et OVCA 4 33, représentée sur une période de 24 heures au cours du test de deux jours.Les trois lignées cellulaires ont montré une capacité à envahir en direction d'un chémoadjuvant, comme en témoignent les indices cellulaires croissants. Les lignées cellulaires présentaient des taux d'invasion similaires, indiqués par les pentes parallèles des courbes. Toutefois, la courbe d'OVCA 429 présente une asymptote supérieure plus élevée, ce qui indique un niveau maximal d'invasion plus important par rapport aux autres lignées cellulaires.En revanche, les niveaux basaux d'envahissement de toutes les lignées cellulaires étaient faibles. De plus, les lignées cellulaires présentaient des différences quant à leurs délais de début d'envahissement, comme le montre une analyse plus détaillée des données d'envahissement sur une période de 2,5 heures. Les cellules KGN envahissent rapidement les barrières cellulaires et matricielles, tandis que les cellules OVC 4 33 et OVC 4 29 mettent respectivement trois et cinq fois plus de temps pour envahir.Importamment, leurs comportements au début de l'invasion ne permettaient pas de prédire leur capacité globale à envahir. Cela suggère des aptitudes intrinsèques différentes des lignées cellulaires cancéreuses, mais pourrait également indiquer que différents facteurs régulent les comportements invasifs précoces et tardifs des stéroïdes. Une fois maîtrisée, cette technique peut facilement être adaptée pour étudier diverses molécules de signalisation et voies cellulaires au sein du microenvironnement péritonéal qui influencent le comportement métastatique.Cela peut être obtenu par l'ajout de facteurs de croissance exogènes, de cytokines ou d'inhibiteurs soit dans la chambre inférieure, soit dans la chambre supérieure du puits. Alternativement, vous pouvez manipuler génétiquement les cellules cancéreuses elles-mêmes ou les cellules cibles péritonéales.

assessment-ovarian-cancer-spheroid-attachment-invasion-mesothelial

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Un test pour mesurer quantitativement Transforming Growth Factor (TGF)-β-induite invasion dans des gels de collagène en 3 dimensions est décrite. Ce test prend avantage de la série MCF10A de lignées cellulaires, qui représentent les différentes étapes du développement du cancer du sein. Cette méthode peut être adoptée pour être utilisé avec d'autres lignées cellulaires et pourraient être utilisées pour étudier d'autres activateurs ou des inhibiteurs potentiels de l'invasion.

Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion

Le dosage jeu mésothéliales décrite ici prend avantage des cellules marquées par fluorescence et la microscopie vidéo time-lapse de visualiser et de mesurer quantitativement les interactions de sphéroïdes multicellulaires cancer de l'ovaire et les monocouches de cellules mésothéliales. Ce test modélise les étapes précoces de métastases du cancer de l'ovaire.

Test in vitro avec dégagement mésothéliales que les modèles les étapes précoces de métastases du cancer de l&#39;ovaire

Hétérotypique tridimensionnelle<em&gt; In Vitro</em&gt; Modélisation des interactions stroma-épithéliales lors de l&#39;initiation et la progression du cancer des ovaires

Dans cette vidéo, nous montrons le développement d’un modèle tridimensionnel in vitro de la muqueuse de la cavité péritonéale. Cette culture organotypique peut aider à étudier l’adhésion, l’invasion et la prolifération des cellules cancéreuses de l’ovaire.

Modélisation des métastases du cancer de l’ovaire dans la muqueuse de la cavité péritonéale : une méthode pour établir un modèle 3D in vitro de la muqueuse péritonéale

Cette vidéo décrit une technique permettant de mesurer quantitativement l’interaction des sphéroïdes du cancer de l’ovaire avec les cellules mésothéliales, à l’aide de cellules marquées par fluorescence et d’une microscopie vidéo en accéléré. Cet essai in vitro modélise l’interaction entre les sphéroïdes des cellules cancéreuses de l’ovaire métastasantes et les cellules mésothéliales tapissant la cavité péritonéale in vivo.

Dosage de la clairance mésothéliale : une technique in vitro pour quantifier la capacité d’invasion des sphéroïdes du cancer de l’ovaire dans les monocouches de cellules mésothéliales

L’invasion des tissus normaux environnants est une caractéristique déterminante des tumeurs malignes. Nous fournissons ici un test simple et semi-automatisé sur microplaque d’invasion dans une biomatrice 3D naturelle qui a été illustré par un certain nombre de modèles de cancers humains avancés.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Nous décrivons un protocole qui met en œuvre des approches in vivo et ex vivo pour étudier la colonisation par le cancer de l’ovaire des tissus adipeux péritonéaux, en particulier de l’épiploon. De plus, nous présentons un protocole pour quantifier et analyser les structures cellulaires immunitaires de l’épiploon connues sous le nom de taches laiteuses, qui favorisent les métastases du tissu adipeux péritonéal.

Dans vivo et ex vivo approches pour étudier Cancer de l&#39;ovaire métastatique colonisation de Lactée spot Structures en péritonéale adipeux

Les métastases du cancer de l’ovaire sont caractérisées par de nombreuses lésions intra-péritonéales diffuses, de sorte qu’il est difficile de quantifier visuellement avec précision la charge tumorale.  Nous décrivons ici une méthode de quantification in situ et ex vivo de la charge tumorale métastatique à l’aide de cellules tumorales marquées à la protéine fluorescente rouge (RFP) et de l’imagerie optique.

Quantification du commerce intra-péritonéale Cancer de l&#39;ovaire Métastase

Cette méthode évalue l’invasion des cellules cancéreuses des sphéroïdes dans une matrice 3D environnante.  Les sphéroïdes sont générés par la méthode de culture de gouttes suspendues, puis intégrés dans une matrice composée de matériaux de membrane basale et de collagène de type I.  L’invasion des sphéroïdes est ensuite surveillée.

Une cellule cancéreuse Spheroid test pour évaluer Invasion dans un Cadre 3D

Ici, nous présentons un protocole pour construire un modèle in vitro tridimensionnel de la muqueuse de la cavité péritonéale, composé de cellules mésothéliales humaines primaires et de fibroblastes superposés avec une matrice extracellulaire, comme outil pour étudier l’adhésion, l’invasion et la prolifération des cellules cancéreuses de l’ovaire.

Modélisation des étapes précoces de cancer de l&#39;ovaire Diffusion dans une culture organotypique de la cavité péritonéale humain

Pour étudier la progression de la tumeur ovarienne dans un modèle physiologiquement pertinente, sphéroïdes multicellulaires ont été cultivées dans un microdispositif dans l'écoulement de fluide simulé. Ce modèle 3D dynamique émule l'environnement intrapéritonéale avec les composants cellulaires et mécaniques où les métastases du cancer de l'ovaire se produit.

Modélisation Comportement cancer de l&#39;ovaire multicellulaire Spheroid dans un Microdevice Dynamic 3D péritonéale

Découvrez une méthode d'analyse en temps réel pour quantifier l'invasion des cellules de cancer de l'ovaire dans la couche mésothéliale périnéale. Cette technique permet de mesurer continuellement la métastase et d'identifier les facteurs clés régulant ce processus.

Évaluation de Cancer de l'ovaire Spheroid attachement et l'invasion des cellules mésothéliales en temps réel

Explorer plus de vidéos