Évaluation de Cancer de l'ovaire Spheroid attachement et l'invasion des cellules mésothéliales en temps réel

L'invasion des cellules de cancer ovarien dans la garniture de mésothéliales du péritoine est un processus dynamique dans le temps. Utilisant un véritable analyseur de temps, la capacité d'invasion des cellules cancéreuses de l'ovaire dans un modèle sphéroïde mésothélial co-culture de cellules peut être quantifié sur des périodes de temps prolongées, apportant des éclairages sur les facteurs régissant le processus métastatique.

L’objectif global de cette procédure est de quantifier rapidement en temps réel l’invasion des cellules cancéreuses de l’ovaire dans un modèle de co-culture de cellules mésothéliales d’astéroïdes. Ceci est accompli en générant d’abord le cancer de l’ovaire à partir de lignées cellulaires en cultivant les cellules dans des conditions non adhérentes dans de la méthylcellulose. La deuxième étape consiste à préparer un analyseur de cellules en temps réel, une plaque CIM en codant la chambre supérieure des deux puits compartimentés avec du matrigel pour imiter la membrane basale qui sous-tend le mésothélium de la cavité péritonéale et la muqueuse mésothéliale elle-même.

Ensuite, les stéroïdes du cancer de l’ovaire sont récoltés et ajoutés aux chambres supérieures des puits de plaque de l’analyseur en temps réel. La dernière étape consiste à programmer et à lancer l’analyseur de cellules en temps réel, qui prendra des lectures périodiques à des intervalles prédéfinis sur une période prolongée de test. En fin de compte, les résultats obtenus décrivent le processus d’invasion continu, qui est utilisé pour déterminer les facteurs clés régulant les cellules cancéreuses de l’ovaire lorsqu’elles envahissent les barrières cellulaires et matricielles.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les tests transmondes standard de l’invasion des cellules cancéreuses est que cette approche permet des mesures continues de l’invasion des cellules cancéreuses sur de longues périodes de temps. Contrairement à un test à critère d’évaluation unique, qui ne capture pas pleinement la nature dynamique des métastases du cancer de l’ovaire, bien que cette méthode soit utilisée pour fournir des informations sur le cancer de l’ovaire, elle peut également être appliquée à l’étude de différents types de processus métastatiques tels que le cancer du sein ou l’apparition de cellules cancéreuses à travers une couche endothéliale. De même, il peut être utilisé pour étudier l’invasion cellulaire normale telle que l’invasion de trophoblastes lors de l’implantation d’embryons Pour préparer les cellules cancéreuses de l’ovaire au marquage des cellules fluorescentes.

Les cellules de première récolte à 75 % de fluidité et les cellules en suspension à une concentration finale de 1 million de cellules par millilitre dans un millilitre de PBS préchauffé par 0,1 % BSA L’ajout de la quantité optimale de stéroïdes par puits et la manipulation soigneuse des stéroïdes sont essentiels au succès de cette procédure. Ensuite, ajoutez deux microlitres d’un stock de cinq millimolaires de solution de CSFE à l’état de traces cellulaires aux cellules à une concentration finale de 10 micromolaires et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes Dans un bain-marie, éteignez la réaction avec un millilitre de milieu glacé contenant 10 % de FBS et regranulez par centrifugation. Reus. Passez 10 millilitres du milieu de croissance préchauffé approprié et ensemencez les cellules dans une culture en flacon à filtre de 75 centimètres carrés à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que le niveau de marquage par fluorescence soit adéquat pour la détection.

Commencez cette procédure en mesurant le volume de milieu de culture approprié pour chaque lignée cellulaire, qui est de 15 millilitres moins le volume de cellules nécessaires à la génération de sphe. Ajouter trois millilitres de solution mère de méthylcellulose au milieu de culture pour obtenir une concentration finale de méthylcellulose de 20 % et bien mélanger par inversion douce. Ajoutez 300 000 cellules dans le milieu contenant de la méthylcellulose et mélangez-les soigneusement par inversion douce, pipette 150 microlitres du mélange de milieu cellulaire de méthylcellulose dans chaque puits d’une plaque de culture à fond concave de 96 puits.

Cela se traduira par un total de 3000 cellules par culture de puits à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant un à quatre jours ou jusqu’à ce que le PHE se forme uniformément. Généralement, un stéroïde par puits est observé, l’analyseur de cellules en temps réel ou le test d’invasion cellulaire RTCA utilise une plaque CIM RTCA à deux chambres de 16 puits. En travaillant par groupes de quatre puits à la fois, ajoutez 50 microlitres de matrice dans chaque puits de la chambre supérieure de la plaque pour vous assurer que toute la surface est couverte.

Retirez 30 microlitres de matrice immédiatement mais lentement pour vous débarrasser de tout excès de liquide. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant quatre heures avant de l’utiliser dans un incubateur de culture tissulaire. Après quatre heures, ajoutez 30 microlitres de sérum gratuit, un milieu approprié pour chaque lignée cellulaire cancéreuse dans la chambre supérieure et 160 microlitres de milieu avec ou sans sérum.

Selon la conception expérimentale de la chambre inférieure, assemblez la plaque CIM en enclenchant la chambre inférieure dans la chambre supérieure et équilibrez-la dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Pendant une heure dans un incubateur de culture tissulaire, ouvrez le programme RTCA et sélectionnez l’onglet de mise en page. Mettez en surbrillance tous les puits expérimentaux, faites un clic droit sur les puits et sélectionnez Activer les puits.

Remplissez ensuite les conditions expérimentales et vendez les noms que vous souhaitez. Pour ajouter des étapes ou des sous-étapes au programme, sélectionnez l’onglet Horaire et faites un clic droit sur Ajouter une étape. La première étape est un balayage d’arrière-plan préprogrammé, qui est automatiquement incorporé dans le programme.

Une fois que vous avez choisi d’ajouter une étape, entrez les détails du programme souhaité pour la deuxième étape du programme RTCA, qui enregistrera les lectures lors de l’établissement de la monocouche de cellules mésothéliales humaines LP nine. Ajoutez les intervalles de temps entre les lectures d’impédance en sélectionnant l’onglet intervalle et en saisissant 15 minutes. Ajoutez une durée expérimentale en sélectionnant l’onglet durée et en saisissant une durée comprise entre 12 et 24 heures.

Les étapes suivantes sont ajoutées de la même manière. La troisième étape du programme RTCA dirigera l’instrument pour prendre des mesures lors de l’invasion du frid. Entrez cinq minutes sous l’onglet intervalle et 48 heures sous l’onglet durée.

Sélectionnez la plaque dans la barre de menu et enregistrez. Pour commencer cette procédure, placez la plaque CIM dans l’instrument RTCA et ouvrez le programme enregistré précédemment. Sélectionnez Exécuter dans la barre de menus, puis lancez un balayage en arrière-plan qui sera automatiquement effectué.

Après le balayage de fond, retirez la plaque CIM de l’instrument et placez-la dans une plaque de capot de culture tissulaire. 50 000 LP neuf cellules suspendues dans 160 microlitres de milieu sans sérum dans la chambre supérieure de chaque plaque CIM. Placez la plaque dans l’instrument RTCA et prenez des mesures toutes les 15 minutes pendant que la monocouche LP neuf s’établit pendant la nuit du lendemain, coupez aseptiquement un millimètre du haut d’une pointe de pipette d’un millilitre et utilisez-la pour récupérer doucement le contenu de chaque puits pour chaque lignée cellulaire.

Pool 10 stéroïde dans une centrifugeuse à tube stérile. Stéroïdes à 120 GS pendant huit minutes, puis éliminer le milieu contenant de la méthylcellulose par aspiration douce. Lavez la broche deux fois de plus avec le centrif PBS pour l’utiliser à 120 GS pendant huit minutes pour granuler les stéroïdes après chaque lavage.

Pour chaque puits expérimental, Resus dépense un total de 10 stéroïdes dans 160 microlitres de milieu sans PBS. Interrompez l’expérience RTCA en sélectionnant Exécuter dans la barre de menus et en cochant la case Pause. Retirez la plaque CIM de l’instrument et placez-la dans un capot de culture tissulaire.

Aspirez le milieu de chaque puits et remplacez-le par un milieu contenant des stéroïdes. Remettez la plaque dans l’instrument RTCA. Sélectionnez Exécuter dans la barre de menus et cochez l’étape d’abandon.

Le programme passera automatiquement à l’étape suivante. Pour reprendre l’expérience, sélectionnez exécuter dans la barre de menus et cochez Démarrer, continuer. La troisième étape du programme RTCA lancera dans cette expérience deux lignées cellulaires de cancer épithélial de l’ovaire OVCA 4 33 et OVCA 4 29 et une lignée de cellules tumorales de la granulosa ovarienne.

Les KGN ont été utilisés pour générer des stéroïdes après une culture pendant la nuit et des séjours à fond en U en suspension dans des milieux contenant de la méthylcellulose. Les trois lignées cellulaires ont formé des structures stéroïdiennes compactes d’environ 400 à 500 micromètres de diamètre. Les panneaux inférieurs montrent la lignée cellulaire correspondante cultivée à l’échelle monocouche.

Les barres représentent 100 micromètres une fois formées. Les stéroïdes ont été récoltés et placés sur une monocouche de cellules mésothéliales LP neuf dans une plaque R-T-C-A-C-I-M. Des images de cultures parallèles ont été prises périodiquement par microscopie à contraste de phase ou par microscopie fluorescente pour faciliter l’interprétation des données RTCA.

Il est informatif d’évaluer à la fois la couche basale d’invasion d’une lignée cellulaire cancéreuse ainsi que l’invasion induite par la chimiothérapie. Dans cet exemple, le caractère basal invasif est mesuré par l’ajout de milieu libre sérique ou SFM aux chambres supérieure et inférieure. Un milieu complet avec 10 % FBS, qui contient de nombreux attractifs de chimiothérapie potentiels, est utilisé pour examiner l’invasion induite par l’attractif de chimiothérapie.

Voici les résultats représentatifs d’une comparaison de l’invasion cellulaire entre les cellules kgn et les neuf cellules mésothéliales LP. L’essai d’invasion RTCA a été réalisé avec et sans FBS dans la chambre inférieure d’une plaque CIM A. Les résultats sont présentés sous forme d’indice cellulaire moyen positif moins SD à partir de puits triples au point de temps de 24 heures et sur une période d’essai complète de deux jours.

Ces résultats confirment que les cellules LP neuf sont peu invasives sur deux jours dans des conditions induites par la basale ou la chimioattraction, et qu’elles constituaient donc un bon type de cellule à utiliser dans des essais de co-culture avec des cellules cancéreuses de l’ovaire. En revanche, les stéroïdes du cancer de l’ovaire et de la KG ont montré la capacité d’envahir un attractif de chimiothérapie. Ce graphique présente les résultats d’une comparaison de la capacité invasive des lignées cellulaires K-G-N-O-V-C-A 4 29 et OVCA 4 33 représentée sur une période de 24 heures au cours de l’essai de deux jours.

Les trois lignées cellulaires ont montré la capacité d’envahir un attractif de chimiothérapie, comme l’indiquent les indices cellulaires croissants. Les lignées cellulaires présentaient des taux d’invasion similaires, comme l’indiquent les pentes parallèles des courbes. Cependant, la courbe OVCA 4 29 présente un fourre-tout supérieur plus élevé, ce qui indique un niveau maximal d’invasion plus élevé par rapport aux autres lignées cellulaires.

En revanche, les niveaux basaux d’invasion de toutes les lignées cellulaires étaient faibles. De plus, les lignées cellulaires présentaient des différences dans leurs délais jusqu’au début de l’invasion, comme le montre une analyse plus détaillée des données d’invasion sur une période de 2,5 heures. Les cellules KGN envahissent rapidement les barrières cellulaires et matricielles, tandis que les cellules OVC 4 33 et OVC 4 29 mettent respectivement trois et cinq fois plus de temps à envahir.

Il est important de noter que leurs comportements au début de l’invasion n’étaient pas prédictifs de leur capacité globale d’invasion. Cela suggère différentes capacités inhérentes aux lignées cellulaires cancéreuses, mais peut également indiquer que différents facteurs régulent les comportements invasifs précoces et tardifs des stéroïdes. Une fois maîtrisée, cette technique est facilement adaptable pour étudier diverses molécules de signalisation et voies cellulaires dans le microenvironnement péritonéal qui affectent le comportement métastatique.

Cela peut être réalisé par l’ajout de facteurs de croissance exogènes, de cytokines ou d’inhibiteurs dans la chambre inférieure ou supérieure du puits. Alternativement, vous pouvez manipuler génétiquement les cellules cancéreuses elles-mêmes ou les cellules cibles péritonéales.