Identification des protéines d'interaction partenaires dans les cellules de mammifères à l'aide SILAC-immunoprécipitation quantitatives en protéomique

L’objectif général de cette procédure est d’identifier des partenaires d’interaction protéique pour une protéine d’intérêt donnée. Ceci est accompli en cultivant d’abord les cellules dans des milieux de culture cellulaire contenant de l’arginine et de la lysine marquées avec différents isotopes stables du carbone et de l’azote. La deuxième étape consiste à transfecter des plasmides et à enrober une protéine d’intérêt ou un plasmide de contrôle dans les cellules marquées.

Ensuite, les cellules sont lysées et les échantillons sont immunoprécipités à partir des lysats. Ensuite, des volumes égaux de précipités immunologiques de contrôle et d’échantillon sont combinés et soumis à l’analyse lc MS MS. La dernière étape consiste à analyser les données de spectrométrie de masse pour identifier les protéines qui interagissent avec la protéine d’intérêt.

En fin de compte, le marquage isotopique stable des acides aminés dans les cultures cellulaires ou les précipitations d’acides aminés silac est capable d’identifier un grand nombre d’interactions directes et indirectes avec une protéine d’intérêt à partir de cellules de culture tissulaire. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le marquage par taraudage, est qu’elle élimine la nécessité pour l’enquêteur d’envoyer des bandes individuelles de la spectrométrie de masse. Cela élimine une source importante de biais tout en augmentant la sensibilité.

Bien que cette méthode puisse être utilisée pour mieux comprendre les protéines cellulaires, les interactions protéiques peuvent également être appliquées à d’autres systèmes, tels que l’étude des interactions entre les agents pathogènes et les hôtes. Pour commencer, grattez les cellules T HEK 2 93 marquées SLAC, exprimant la protéine d’intérêt marquée à la GFP ou le contrôle GFP de la boîte de culture cellulaire dans du PBS glacé, puis centrifugez la suspension cellulaire à 220 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, lavez les cellules trois fois supplémentaires dans 10 millilitres de PBS glacé, remettez en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de tampon de lyse cellulaire contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéase fraîchement ajouté trois à une concentration X et ajouter cinq microlitres de cocktail d’ARN par millilitre de tampon de lyse, incuber sur glace pendant cinq minutes. Ensuite, centrifugez le lysat cellulaire à 13 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et conservez le surnageant sous forme de lysat cellulaire soluble.

Mesurez la concentration en protéines du lysat cellulaire à l’aide d’un dosage BCA. Ensuite, normalisez la concentration en protéines dans chaque lysat d’échantillon dans un volume final de 500 microlitres à l’aide du tampon de lyse contenant des inhibiteurs de protéase. Ajoutez 500 microlitres de tampon de dilution contenant un cocktail d’inhibiteur de protéase trois à chacun des lysats cellulaires normalisés pour ajuster le volume total à un millilitre.

Conservez les lysats sur de la glace pendant la préparation des billes anti-GFP et conservez une aliquote de 50 microlitres de chaque échantillon à utiliser pour l’entrée de l’échantillon. Vortex la boue de billes pour remettre les billes en suspension. Ensuite, utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres avec la coupure d’extrémité pour transférer 25 microlitres de billes par échantillon dans un tube frais.

Pour chaque 25 microlitres de boue de billes, ajoutez 20 volumes de tampon de dilution à laver, centrifugez les billes à 2 700 fois G pendant cinq minutes. Lavez les billes plusieurs fois avec 20 volumes de tampon de dilution. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de dilution pour 25 microlitres de boue de billes.

Ensuite, utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres avec la coupure d’extrémité pour transférer 85 microlitres de la suspension de billes en suspension dans chacun des lysats d’échantillon étiquetés SLAC. Incuber les échantillons avec des billes sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant deux heures après l’incubation des échantillons avec les billes, centrifuger les échantillons à 2 700 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Conserver 50 microlitres de surnageant comme échantillon non lié et jeter le reste du surnageant.

Remettre les billes en suspension dans chaque tube dans un millilitre de tampon de dilution, puis centrifuger à 2 700 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Répétez cette étape de lavage deux fois pour éluer la protéine des billes. Ajoutez 50 microlitres de deux tampons de chargement XSDS à chaque échantillon et chauffez à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Une fois le chauffage terminé, centrifugez chaque échantillon à 2 700 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant dans des tubes prélubrifiés et stockez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à être soumis à l’analyse MS. Mélangez ensuite des volumes égaux de précipités aminés de contrôle et d’échantillon et soumettez l’échantillon combiné à une installation de spectrométrie de masse pour une analyse lc ms MS.

Avant d’analyser les données de spectrométrie de masse, copiez les données brutes dans une nouvelle feuille de calcul. Ensuite, dans cette feuille de calcul, supprimez toutes les colonnes, à l’exception des colonnes contenant le numéro d’accession, le nombre de peptides uniques, les ratios comparateurs, la variabilité des ratios et la description de la protéine. Utilisez la fonction de tri Excel pour classer les données par nombre de peptides et supprimer les entrées pour les protéines dépourvues de plus d’un peptide.

Ensuite, triez par rapport et retirez les protéines qui n’ont pas de rapport SLAC. Ensuite, convertissez les ratios slac en valeurs logarithmiques. L’utilisation de la formule est égale à des parenthèses logarithmiques, un rapport SLAC de deux et des parenthèses où le rapport SLAC est substitué à l’identificateur de cellule.

Créez ensuite une nouvelle colonne dans le fichier Excel et calculez les ratios Log two SLAC pour toutes les colonnes de simulation d’échantillon pour la conversion d’un ratio d’échantillon fictif en ratio de simulation d’échantillon. Utilisez la formule est égal à un divisé par le rapport. Ouvrez le prisme du GraphPad.

Sélectionnez une nouvelle table de données et un nouveau graphique Sélectionnez une colonne dans la liste sur le côté gauche de la fenêtre et sélectionnez Entrez les données d’importation. Entrez les valeurs de réplica empilées dans les options de colonnes. Appuyez sur créer.

Sélectionnez et copiez ensuite une colonne de ratio SLAC fictif de log two sample donnée de la feuille de calcul Excel dans le nouveau fichier prism. Ensuite, cliquez sur le menu déroulant et sélectionnez une nouvelle analyse. Sous Analyse de colonne, sélectionnez Distribution de fréquences.

Conservez les options par défaut et cliquez sur OK. Dans le dossier des résultats, une nouvelle section d’histogramme aura été générée. Sélectionnez la section Distribution de fréquences, puis cliquez sur le menu déroulant Insertion et sélectionnez Nouvel ajustement de la courbe de régression non linéaire XY de l’analyse.

Cliquez sur Distribution gaussienne et cliquez sur OK. Dans la fenêtre de résultats qui s’affiche, la moyenne et l’écart-type sont indiqués. Générez un seuil en ajoutant 1,96 écart-type au retour moyen dans le fichier Excel.

Créez un nouvel onglet appelé Catégorie d’accession A d’étiquette combinée et copiez tous les numéros d’acquisition de chacun des tests individuels dans cette colonne unique. Ensuite, sélectionnez l’onglet Données, puis l’option Supprimer les doublons. Créez ensuite des colonnes pour les ratios SLAC et la variabilité des rapports de chaque expérience, ainsi que pour la colonne de description du nom de la protéine.

Dans l’onglet description, utilisez la formule RECHERCHEV pour recueillir la description de chaque numéro d’acquisition. Faites glisser la formule vers le bas de la colonne pour remplir la description de la protéine, puis utilisez cette formule pour obtenir les données de rapport et de variabilité des expériences individuelles. Pour mettre en évidence les protéines en interaction dans l’ensemble de données combinées, notez la valeur seuil d’une expérience particulière.

Sélectionnez la colonne ratio et cliquez sur l’onglet Accueil. Suivi de la mise en forme conditionnelle, mettez en surbrillance les cellules règles plus de règles, puis sélectionnez le style Le format classique vend uniquement ceux dont la valeur de vente est supérieure ou égale à. Dans la zone, saisissez la valeur de l’écart type de 1,96 et cliquez sur OK.

Évaluez la variabilité du rapport pour chaque interaction positive. Si la soustraction du pourcentage de variabilité fait chuter un résultat en dessous de la valeur seuil. Cela doit être traité avec prudence.

Répétez cette opération pour chacune des colonnes de résultats et comparez les expériences mises en évidence : les protéines identifiées dans deux expériences ou plus représentent une interaction à haut niveau de confiance. L’analyse par transfert Western a confirmé la purification de la protéine d’intérêt marquée à la GFP. L’absence d’une bande DH lacunaire dans les échantillons liés indique que les protéines non interagissant ont été appauvries des échantillons par l’étape d’immunoprécipitation, tandis que la présence d’une bande EIF 4G dans ces échantillons indique que les partenaires de liaison en interaction connus ont été conservés.

Plusieurs des quatre protéines de liaison A identifiées ont été conservées entre les deux isoformes. Les protéines qui interagissent avec EIF quatre A sont identifiées par un rapport LAC élevé, tandis que les protéines non spécifiquement liées dans cette expérience ont des rapports inférieurs à 0,96. Dans ce diagramme du complexe de facteurs d’initiation, les quatre protéines de liaison EIF A qui ont été identifiées dans l’expérience de précipitation des acides aminés SLAC sont ombrées en rouge à blanc.

Selon le rapport SLAC log deux, la couverture élevée des partenaires de liaison directs et indirects des complexes EIF quatre A un et deux illustre l’efficacité de cette approche pour identifier les interactions protéiques En tentant cette procédure, il est important de se rappeler que si certaines variations dans les niveaux de protéines peuvent être compensées au stade de l’analyse des données, Il est préférable d’éviter cela en assurant une normalisation précise des niveaux d’apport en protéines et en évitant de perdre des billes d’AROS pendant les étapes de lavage.