Glutamine Flux Imaging Utilisation de capteurs génétiquement codés

L'objectif général de cette procédure est d'observer le transport du glutamine via un transporteur exprimé de façon hétérologue dans des cellules vivantes, en utilisant des capteurs basés sur le transfert d'énergie par résonance de Förster, ou FRET. Ceci est réalisé en transfectant d'abord des cellules HEK 293 avec un capteur de glutamine et un transporteur. Le capteur est constitué d'un donneur FRET inséré dans une protéine bactérienne de liaison au glutamine et d'un accepteur FRET situé à l'extrémité C-terminale de cette protéine de liaison.

La deuxième étape consiste à mettre en place un système de perfusion et à observer les cellules en temps réel à l’aide d’un microscope fluorescent inversé. L’étape finale consiste à analyser les images et à visualiser la dynamique de la glutamine. En définitive, l’activité des transporteurs dans une cellule unique peut être détectée à l’aide de ces capteurs FRET.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les mesures fondées sur la chromatographie, est qu'elle permet d'obtenir une résolution spatiale et temporelle nettement plus élevée. Cette technique comprend trois étapes : la transfection des cellules avec des protéines capteurs, l'imagerie en temps réel et l'analyse post-expérimentale. Sept cellules sont utilisées dans cette expérience en raison de leur faible activité endogène de transport de la glutamine.

Ensemencer les cellules à environ 70 à 80 % de confluence dans du DMEM complété avec 10 % de sérum de veau cosmique ou CCS et 100 unités par millilitre de pénicilline-streptomycine, dans un plat en verre à huit puits. Incuber à 37 degrés Celsius, 5 % de CO₂, humidité à 100 % pendant 24 heures.

Après 24 heures, remplacer le milieu de croissance par du DMEM contenant 10 % de CCS, sans antibiotiques, et faire pousser toute la nuit à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2 et humidité à 100 % le jour de la transfection. Ajouter 0,4 microgramme de chaque ADN plasmidique codant pour le capteur de glutamine et pour l'échangeur obligatoire d'acides aminés marqué m-cherry A SCT deux à 50 microlitres de milieu sans sérum.

Ajouter un microlitre de réactif de transfection à 50 microlitres de milieu sans sérum, mélanger doucement et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, mélanger la solution contenant l'ADN avec le réactif de transfection dilué et incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Après 20 minutes, ajouter délicatement le mélange de réactif de transfection sur les cellules en co-culture et mélanger doucement en balançant la chambre.

Incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, 5 % CO2 et 100 % d'humidité. Remplacer le milieu par du DMEM complémenté de 10 % CCS et de 100 unités de pénicilline-streptomycine. Remettre les cellules dans l'incubateur avant de commencer la perfusion.

Préparez les tampons de perfusion A à F selon les recettes décrites dans le manuscrit accompagnant. Fixez des robinets de fermeture à des seringues de 50 millilitres. Fermez les robinets et remplissez les seringues avec les solutions de perfusion.

Ouvrez brièvement le robinet pour remplir l’espace libre du robinet avec le tampon. Ensuite, allumez la gravité à huit canaux. Alimentez le système de perfusion à l’aide d’un stylet de perfusion et sélectionnez le mode manuel.

Dans l'option de fonction sélectionnée, placez un récipient de déchets sous le stylet de perfusion. Pour la réussite de cette expérience, il est important de configurer la perfusion de manière à minimiser la dérive et le transfert de solution.

Activez manuellement les ports en appuyant sur les numéros correspondants et remplissez les tubulures avec de l'eau. À l'aide d'une seringue de 10 millilitres, fermez les ports, placez les seringues contenant les tampons A à F sur les ports un à six du système de perfusion, puis ouvrez les robinets. Après cela.

Rouvrir les ports pour remplacer l'eau dans les tubulures par les tampons. Le débit doit être d'environ 0,8 millilitre par minute. Appuyer une fois sur annuler sur le contrôleur de perfusion pour revenir au menu de sélection de fonction.

Passer à l'option du programme d'édition, puis saisir le protocole de perfusion indiqué dans ce tableau. Enregistrer le programme de perfusion. Les cellules sont observées 48 à 72 heures après la transfection.

Lavez les puits de la boîte à fond en verre deux fois avec le tampon de perfusion A en prenant soin de ne pas détacher les cellules. Placez la boîte à fond en verre sur la platine du microscope à fluorescence. Connectez le système de perfusion à la chambre.

Si une chambre ouverte est utilisée, installez une autre pompe qui retire la solution de perfusion de la chambre. Ouvrez le logiciel d'acquisition d'images en mode « slide book ». Démarrez un nouveau slide à l'aide de la fonction de mise au point, puis recherchez les cellules coexprimant le capteur et A SCT two M cherry en utilisant les jeux de filtres appropriés.

Réglez le gain en cliquant sur l'onglet caméra et en faisant glisser la barre de réglage située sous le gain. Réglez également le filtre de densité neutre à l'aide du menu déroulant dédié. Cliquez sur la capture d'image, puis dans la fenêtre d'acquisition, spécifiez les filtres à utiliser.

Les images seront acquises en trois canaux : excitation du donneur, émission du donneur, excitation du donneur, émission de l'accepteur, et excitation de l'accepteur, émission de l'accepteur. Cliquez sur le bouton de test pour ajuster le temps d'exposition en saisissant le temps d'exposition souhaité dans la case. À côté des paramètres de filtre, les trois canaux doivent être exposés pendant la même durée.

Dessinez une région d’intérêt à l’aide de l’outil de régions. Sélectionnez « acquisition en laps de temps » dans la zone de type d’acquisition. Ensuite, précisez l’intervalle et les points temporels pour l’expérience.

Ensuite, dessinez une région dans une zone ne contenant aucune cellule fluorescente, qui sera utilisée pour la soustraction du fond. Cliquez avec le bouton droit sur la région dessinée, puis définissez-la comme fond. Idéalement, les cellules qui n'expriment pas les capteurs doivent être utilisées comme région de fond afin de prendre en compte à la fois l'autofluorescence et la fluorescence de fond détectée par la caméra.

Sélectionnez le programme souhaité dans l'option de sélection de fonction « exécuter des programmes », basculez vers le programme enregistré, puis appuyez sur Entrée sur le contrôleur de perfusion. Le programme est désormais chargé, et l'appui sur une touche quelconque lancera la perfusion afin de s'assurer que la perfusion et l'expérience d'imagerie démarrent simultanément. Cliquez sur le bouton Démarrer dans la fenêtre d'acquisition au même moment où vous appuyez sur une touche du contrôleur de perfusion.

Des expériences typiques de suivi temporel sont montrées ici, utilisant des cellules coexprimant le transporteur a s CT deux et des capteurs FRET de glutamine ayant des affinités de huit millimolaire et 100 micromolaire. L'entrée de glutamine est détectée par le changement du rapport d'intensité de fluorescence entre le donneur mtfp un et l'accepteur Venus. L'entrée de glutamine en présence d'alanine est également démontrée comme substrat.

Les spécificités des transporteurs peuvent également être étudiées à l'aide des capteurs. Ici, les cellules ont été préchargées avec de la glutamine, puis divers acides aminés ont été ajoutés au milieu de perfusion extracellulaire. Huit, comme prévu, A ct deux substrats ont induit un flux de glutamine, tandis que les acides aminés n'étant pas des substrats n'ont pas eu d'effet.

L'absence de changement d'efficacité de transfert d'énergie par résonance (FRET) après l'ajout d'un substrat peut être due à plusieurs raisons, telles qu'une faible capacité d'absorption du substrat testé, comme observé dans les cellules exprimant le capteur de huit millimolaire ou le capteur de 100 micromolaire. Mais cela ne permet pas de confirmer que le changement d'efficacité de FRET est dû à une variation réelle du substrat et non à des modifications d'autres paramètres, en l'absence d'expression du transporteur a s CT deux. Le même protocole de perfusion est réalisé en utilisant des cellules exprimant un capteur censé être saturé dans les conditions expérimentales.

Dans cet exemple, l'affinité du capteur est de 1,5 micromolaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'imaginer les dynamiques des métabolites à l'aide de capteurs FRET. N'oubliez pas que la culture cellulaire doit être manipulée de façon appropriée conformément aux procédures opérationnelles normalisées afin de minimiser le risque d'exposition.