Name: Étude de lADN Looping par une seule molécule FRET (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Découvrez la dynamique de bouclage de l'ADN double brin par FRET à molécule unique sans protéines de liaison. Cette méthode quantifie le facteur J et révèle comment la courbure intrinsèque influence la probabilité de bouclage.

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Nous remercions James Waters, Gable Wadsworth et Bo Broadwater pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également quatre évaluateurs anonymes pour leurs commentaires utiles. Nous reconnaissons l&#39;appui financier du Georgia Institute of Technology, le prix du Burroughs Wellcome Fund carrière à l&#39;interface scientifique, et la subvention du réseau de recherche de l&#39;étudiant de la NSF Physique des systèmes vivants.

1. Préparation ADN double brin de l&#39;échantillon <ol><li> Concevoir ADN courbes globalement en répétant une séquence de 10-mer. Par exemple 5&#39;-GTGCCAGCAACAGATAGC, - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 &#39;de l&#39;ADN est une courbe de 186 bp, où X est une base aléatoire supplémentaire et la séquence flanquant la séquence 10-mère sont des séquences de répétition adaptateur. REMARQUE:. Dans cet exemple, deux 10-mères ayant des préférences opposées à la formation nucléosome basé sur une grande échelle étude d&#39;occupation nucléosome par Kaplan et al 15 ont été choisis. Depuis la répétition hélicoïdale de l&#39;ADN bicaténaire est proche de 10 pb, toute déviation nette de l&#39;axe hélicoïdal de la 10-mer s&#39;accumule pour produire une forme d&#39;arc de cercle (figure 3A). Etant donné que la période hélicoïdale est plus proche de 10,5 pb, une base supplémentaire est inséré après tous les deux répétitions de conserver la structure recourbée comme plane que possible. Ces séquences plus courtes de 200 pb peuvent être commandés auprès de companies qui offre gène service de synthèse. Il est commode pour flanquer ces séquences avec des séquences d&#39;adaptation communes pour les étapes ultérieures. Le mode opératoire est schématisé sur la figure 3B. </li><li> Effectuer PCR avec l&#39;amorce 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) et l&#39;amorce 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). NOTE: Primer 2 est marqué avec le Cy3 donneur FRET à l&#39;extrémité 5 &#39;. Une recette typique de la PCR et le protocole de cyclage sont présentés dans les tableaux 1 et 2. </li><li> Faire la PCR Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) et l&#39;amorce 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). NOTE: Primer 3 est marqué avec l&#39;accepteur Cy5 FRET à travers la colonne vertébrale et la biotine-segment de liaison à l&#39;extrémité 5 &#39;. Recette PCR et le protocole de cyclisme sont comme ci-dessus. </li><li> Purifier les produits de la PCR en utilisant un kit de nettoyage de PCR. </li><li> Mélanger le produit marqué au Cy3 et Cy5 le produit marqué dans un tampon pour l&#39;échange de brin (100 mM de NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA) à des concentrations finales de 0,4 et# 181; M et 0,1 uM, respectivement. NOTE: Le Cy3-ADN en excès augmente la concentration du duplex portant à la fois Cy3 et Cy5 en tant que résultat de l&#39;échange de brin. </li><li> brins de change par incubation à 98,5 ° C pendant 2 min, refroidissement progressif à 5 ° C avec un taux de 0,1 ° C / s de la rampe, et en incubant à 5 &#160; ° C pendant 2 heures. </li></ol> 2. Gel d&#39;électrophorèse pour détecter ADN double brin courbure <ol><li> Verser le gel de polyacrylamide en mélangeant 16,17 acrylamide et de solutions de bis-acrylamide à un rapport 29.2:0.8, 5% (p / v) dans 1 x Tris / Borate / EDTA (TBE) tampon à pH 8,0. Note: 10 ml de solution de gel contient: 1.217 ml 40% d&#39;acrylamide, 0,667 ml 2% de bis-acrylamide, 1 ml TBE 10X, 100 L persulfate d&#39;ammonium (APS) 10%, 10 L TEMED, et le reste est dH 2 O. Solidification complète du gel prend environ 30 min. </li><li> Charger le gel de polyacrylamide avec des échantillons d&#39;ADN et de l&#39;échelle d&#39;ADN dans un tampon de charge 1X (5% de glycerol, 0,03% (p / v) de bromophénol blue) et exécuter le gel à 5-8 V / cm à 4 ° C pendant 45 min ou jusqu&#39;à ce que le front de colorant se rapproche de l&#39;extrémité du gel. </li><li> Colorer le gel en utilisant un tampon TBE 1X contenant 0,5 g / ml de bromure d&#39;éthidium pendant 30 min. Identifier les bandes d&#39;ADN sous illumination UV. Comparer les positions des bandes avec le marqueur de taille (100 bp DNA ladder) pour calculer les tailles apparentes des molécules d&#39;ADN. NOTE: Curved ADN se déplacent généralement plus lent que les ADN droites. </li></ol> 3. Préparation de débit cellulaire <ol><li> Percer 6-7 paires de trous le long de deux bords opposés d&#39;une lame de verre (3&#39;&#39; x 1&#39;&#39;) à l&#39;aide d&#39;une perceuse à colonne et des trépans de forage diamantés. Après le perçage, frotter la lame dans l&#39;eau qui coule pour enlever la poudre de verre visible. REMARQUE: Les trous servent entrées et sorties perfusion. Pendant le forage, la lame de refroidissement à l&#39;eau est importante pour empêcher la fissuration. </li><li> Placer les lames en position verticale dans un bocal de verre et de le remplir avec de l&#39;eau. Soniquer pendant 15 minutes et de les transférer dans un autre pot de verre dedicated pour le nettoyage à l&#39;acétone. Remplissez-le avec de l&#39;acétone et de traitement par ultrasons pendant 15 min. Rincer les lames avec de l&#39;éthanol à l&#39;aide d&#39;un flacon pulvérisateur, puis avec de l&#39;eau. Placez-les dans un bocal en polypropylène, le remplir avec 5 M d&#39;hydroxyde de potassium, et de traitement par ultrasons pendant 15 min. Enfin, soniquer les diapositives dans l&#39;eau pendant 15 min. Nettoyer les lamelles (n ° 1, 24 x 40 mm) en utilisant le même protocole. NOTE: diapositives et des lamelles nettoyés peuvent être stockés dans dH 2 O pour une utilisation à long terme. </li><li> Mélanger 1 mg de biotine-PEG-silane (MW 3400) avec 80 mg de la norme MPEG-silane (MW 2000) dans 340 L de 0,1 solution de bicarbonate de sodium M. Bien mélanger et centrifuger le mélange brièvement pour se débarrasser de bulles. REMARQUE: La fonctionnalisation de la surface avec du polyéthylène glycol (PEG) permet de réduire la liaison non spécifique de l&#39;ADN à la surface. </li><li> Mettre 80 L de la solution de PEG à chaque lame et une lamelle couvre-objet abaisser doucement dessus. Attendez 45 min. Séparer la lamelle de la diapositive avec des pincettes, les rincer abondamment avec de l&#39;dH 2 O et laisser tourlet sèche à l&#39;air libre. </li><li> Placez minces bandes de ruban adhésif double face sur la diapositive à former des canaux. Aligner une lamelle dessus et appuyez fermement sur la lamelle contre la glissière pour former des canaux étanches aux liquides. Utilisez cinq minutes époxy pour sceller les bords des canaux. </li></ol> 4. Préparation de Trolox Solution <ol><li> Mettez ~ 30 mg Trolox et 10 ml dH 2 O dans un ballon et utiliser une barre aimant d&#39;agitation pour agiter la solution à l&#39;air libre pendant 18 heures. </li><li> Filtrer la solution à l&#39;aide d&#39;un filtre de 0,2 um et ajuster le pH à 7 par addition de ~ 6 pi de 1 M de base Tris (pH 11). Remarque: le Trolox est un réactif anti-clignotement qui est couramment utilisé dans une seule molécule études 18. L&#39;action de antidécoloration de Trolox vient de son dérivé oxydé qui est présent dans la solution Trolox partiellement dégradé 19. À dissolution rapide Trolox dans le méthanol ou solution Tris pH élevé doit être évitée en raison de l&#39;oxydation inefficace. </li></ol> 5. Single-molImagerie ecule <ol><li> Injecter 15 ul de solution de neutravidine (0,5 mg / ml) dans le canal et attendre pendant 2 minutes avant de rincer avec 100 ul de tampon T50 (10 mM Tris-HCl, 50 mM de NaCl, pH 7,0). </li><li> Injecter 50 ul d&#39;échantillon d&#39;ADN (50 à 100 pM) dans le canal. Attendez 5 minutes et rincer l&#39;ADN non lié à une distance de 100 L de tampon T50. NOTE: les molécules d&#39;ADN vont se lier spécifiquement à la surface à travers l&#39;interaction neutravidine-biotine. </li><li> Remplir les puits avec le tampon de formation d&#39;image qui contient un système de piégeage de l&#39;oxygène 20 (100 mM PCD, PCA 5 mM, 1 mM de Trolox, et NaCl 500 mM). </li><li> Réglez le EMCCD en mode de transfert de trame pour écouter 2 x 2 images regroupées par casiers (256 x 256) à l&#39;ordinateur à 25 images par seconde. </li><li> Mettre de l&#39;huile d&#39;immersion sur l&#39;objectif du microscope, et fixer la cellule d&#39;écoulement sur la platine du microscope en utilisant des clips spécimens. Gros la mise au point en regardant le motif de réflexion de laser sur le mur. Ajustez la mise au point avec l&#39;affichage en direct de la fluorescence imans sur le moniteur. </li><li> Commencer l&#39;acquisition de données avec le laser 532 nm sur. Vérifiez l&#39;affichage en direct et la mise au point si nécessaire. Arrêter l&#39;acquisition des données lorsque la plupart des molécules ont Photo-blanchissement. NOTE: Dans cette installation, un programme de laboratoire écrit C pour contrôler le microscope et afficher des images en direct sur l&#39;écran quand ils sont enregistrés sur le disque dur est utilisé. </li></ol> 6. Traitement de l&#39;image et l&#39;analyse des données REMARQUE: Une série de temps de 256 x 256 images sont traitées par un code MATLAB pour générer une seule molécule traces de temps de Cy3 et Cy5 intensités. Pour jumeler pixels entre le canal et le canal donneur accepteur de l&#39;image split-vue, 6-7 paires de Cy3 et Cy5 taches, chaque paire de la même molécule uniformément dispersés dans le champ de vision, sont récoltés manuellement, et une transformation affine est calculée en utilisant les coordonnées de ces points en tant que points d&#39;ancrage. <ol><li> Utilisation d&#39;un script MATLAB, regarder à travers tous les temps seule molécule traces tchapeau montrent de multiples transitions entre les signaux faibles et élevées de FRET. Identifier les États boucle et non bouclé. REMARQUE: Le signal de FRET est définie comme l&#39;intensité Cy5 (I a) divisé par la somme des intensités Cy3 et Cy5 (I a + I d). État boucle a une valeur élevée de FRET en état non bouclé a une valeur faible de FRET. L&#39;histogramme de signaux FRET partir d&#39;une seule molécule est bimodale distribué en raison du bouclage et débouclage réversible. </li><li> Trouver le seuil qui sépare les deux distributions en déterminant l&#39;intersection entre les deux courbes de Gauss de rangement. </li><li> Calculer l&#39;efficacité de FRET comme <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq7.jpg" /> et assigner les États en boucle avec des valeurs élevées de FRET et les Etats non tricotées avec de faibles valeurs de FRET. </li><li> Utilisation d&#39;un script MATLAB, analyser le nombre cumulatif de molécules (N (t)) qui en boucle (ouatteint l&#39;état haut FRET) à différents laps de temps depuis le début de l&#39;acquisition de données. NOTE: Depuis une molécule ADN double brin peut commencer à n&#39;importe quel conformation de l&#39;état non bouclé au début de l&#39;acquisition de données, le taux d&#39;accroissement de la population en boucle reflète le taux moyen boucle moyenne sur conformations initiales. Extraire la boucle de vitesse k boucle en ajustant N (t) avec une fonction exponentielle: <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq1.jpg" /> Si l&#39;augmentation biphasique, il peut être muni d&#39;une double fonction exponentielle: <img fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51667/eq2.jpg" /> Dans ce cas, k boucle est obtenu à partir: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51667/eq3.jpg" /> NOTE: En théorie, la probabilité de survie que d&#39;un polymère n&#39;a pas bouclé au temps t n&#39;est pas une fonction exponentielle simple ou double 12. FITT exponentielleING est utilisé comme un moyen pratique d&#39;extraire le temps de doublement moyen. </li></ol> 7. Détermination du facteur J NOTE: Le facteur J représente la façon concentrée une extrémité d&#39;un ADN double brin est de l&#39;ordre de l&#39;autre extrémité. Elle peut être déterminée par interpolation de la concentration d&#39;un segment d&#39;extrémité de l&#39;ADN qui produirait la même vitesse de réaction avec l&#39;autre segment d&#39;extrémité comme mesuré le taux de bouclage. Expérimentalement, un segment d&#39;extrémité est immobilisée sur la surface, et l&#39;autre segment d&#39;extrémité est introduit à une certaine concentration c. Si le taux de recuit mesurée entre les deux extrémités est recuit k, alors le facteur de J 21 est donnée par <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq4.jpg" /> . La constante de vitesse de recuit (recuit k = k recuit / C) est indépendant de la concentration de la sonde. <ol><li> Débit 20 pi de 30-50 pM biotine-Cy5 oligo (Primer 3) into un canal neutravidine revêtu. Rincer le canal avec 100 pi de T50 à laver oligos non liés. </li><li> Préparer le tampon de formation d&#39;image tel que décrit dans la partie 5 avec l&#39;addition d&#39;oligo Cy3 (amorce 2) à une concentration finale de 50 nM. Couler ce tampon d&#39;imagerie dans le canal. </li><li> Tout en gardant le laser 532 nm, tournez brièvement le laser 640 nm à identifier les emplacements des oligos Cy5 liés à la surface. Éteignez le laser 640 nm et commencer à surveiller le signal de FRET. REMARQUE: Lors de l&#39;hybridation d&#39;un oligo Cy3 à un Cy5 oligo lié à la surface, Cy5 fluorescence se posera de FRET. </li><li> Utilisation d&#39;un script MATLAB, analyser le nombre de molécules qui commencent dans l&#39;état non lié (faible intensité de Cy5), mais se transforment plus tard en l&#39;état (haute intensité de Cy5) recuit en fonction du temps à partir des traces d&#39;intensité Cy5. </li><li> Tracer ce nombre de molécules en fonction du temps recuits. Monter cette courbe avec une fonction exponentielle simple ( <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq5.jpg"/&gt;) Pour obtenir le taux de recuit (k recuit). </li><li> Répéter cette expérimentation à différentes concentrations Cy3 oligo (60, 100, et 180 nM) pour confirmer la linéarité entre le taux d&#39;hybridation et la concentration des réactifs. Extraire la constante de vitesse de recuit de second ordre (k recuit ) À partir de la pente. </li><li> Calculer le facteur de J de <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq6.jpg" /> , Où k est le taux boucle en boucle mesurée dans les mêmes conditions de tampon. </li></ol>

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<li>Mills, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+evidence+that+single-stranded+regions+of+1+or+more+nucleotides+dramatically+increase+the+flexibility+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA.</a> Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt.

Un test simple molécule unique basé sur le FRET a été utilisé pour étudier la cinétique de bouclage des ADN de différentes formes intrinsèques. ADN courbes peuvent être préparés par la répétition d&#39;une séquence 10-mère en phase avec la période d&#39;hélice de 10,5 pb, et leurs courbures peuvent être estimées en utilisant PAGE. Ces dsDNAs sont conçus avec des extrémités cohésives pour permettre la stabilisation de la boucle transitoire. Nous avons extrait le taux de bouclage de l&#39;augmentation exponentielle du nom...

Comprendre les propriétés mécaniques des ADN double brin est d&#39;une importance fondamentale dans les sciences fondamentales et les applications d&#39;ingénierie. La structure de l&#39;ADN bicaténaire est plus compliqué que d&#39;une échelle hélicoïdale droite parce angles roulis, d&#39;inclinaison et de torsion entre les paires de base successives peuvent varier en fonction de la séquence. Fluctuations thermiques peuvent provoquer des ADN double brin à subir divers modes de fluctuations conformationnelles telles que la flexion, de torsion et d&#39;étirement. Transitions comme la fonte et de déformation peuvent également se produire dans des conditions extrêmes. Parmi ces propositions, ADNds flexion a l&#39;impact le plus notable biologique 1. ADNdb flexion est associée à la répression ou l&#39;activation de gènes en amenant deux sites distants proches les uns des autres. Il joue également un rôle important dans l&#39;emballage de l&#39;ADN à l&#39;intérieur du noyau de la cellule ou une capside virale. Déformation en flexion de l&#39;ADN bicaténaire peut être visualisée expérimentalement par microscopie à haute résolution (AFM 2 et 3 TEM), et la ThermodynAmics et cinétique peuvent être étudiés par des analyses en boucle, qui relient des sites chimiquement juxtaposés de l&#39;ADN double brin. Un tel dosage est une ligase dépendante cyclisation 4. Dans ce dosage, les molécules ADN double brin avec des extrémités collantes &quot;cohésives&quot; () sont circularisées ou dimérisés par l&#39;ADN ligase. En comparant les taux de cercle et la formation de dimère, on peut obtenir une concentration molaire efficace d&#39;une extrémité de l&#39;ADN dans le voisinage de l&#39;autre extrémité, qui est connu comme le facteur de J. Ce facteur de J est dimensionnellement équivalente à la densité de probabilité de trouver une extrémité de l&#39;ADN à une courte distance de l&#39;autre extrémité, et reflète ainsi la flexibilité de l&#39;ADN. Mesurer le facteur de J en fonction de la longueur de l&#39;ADN révèle de nombreuses caractéristiques de la mécanique d&#39;ADN dont la longueur de persistance 4,5. La chaîne de ver (WLC) modèle a été largement considéré comme le modèle de polymère canonique pour la mécanique ADN double brin sur la base de son succès dans explicationining les courbes force-extension obtenus dans l&#39;ADN tirant expériences 6 et prédire correctement les facteurs de J dsDNAs plus de 200 pb 7. Cependant, en utilisant l&#39;essai de cyclisation de molécules d&#39;ADNdb aussi courtes que 100 bp, et Cloutier Widom mesuré les facteurs J pour être de plusieurs ordres de grandeur plus élevés que la prédiction du modèle WLC 8. Un an plus tard, Du et al. produite facteurs J en accord avec le modèle WLC en utilisant le test de cyclisation avec des concentrations plus faibles de ligase et attribué le résultat anormal dans le groupe Widom à des concentrations élevées ligase utilisé 9. Cette controverse illustre l&#39;influence inévitable de l&#39;ADN ligase sur la cinétique de cyclisation en utilisant le test classique 9. En outre, l&#39;ADN ligase peut également affecter la structure de l&#39;ADN et de la rigidité à travers non spécifique 10,11 liaison. Pour éliminer les problèmes techniques de tests de bouclage protéine dépendante, nous avons récemment démontré une prottest de bouclage ein, à base de Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 12. Dans ce procédé, des conformations en boucle sont détectées par FRET entre le donneur et l&#39;accepteur attaché à proximité des extrémités cohésives d&#39;une molécule d&#39;ADN. Un total de microscope de fluorescence par réflexion interne du type à objectif (TIRFM) est utilisé pour enregistrer des trajectoires en boucle réversible et débouclage événements à partir de molécules d&#39;ADN simple surface immobilisé pendant une période de temps prolongée. Cette méthode comporte l&#39;assemblage de molécules d&#39;ADN à base de PCR pour générer des molécules d&#39;ADN libre mésappariement, ce qui est une amélioration cruciale sur une méthode similaire par Vafabakhsh Ha et 13. L&#39;aspect unique molécule de ce protocole permet la mesure des distributions en plus de Ensemble moyennes tandis que l&#39;aspect FRET permet de mesurer la dynamique de l&#39;ADN de boucle à plusieurs reprises de la même molécule, même dans des conditions qui peuvent nuire à l&#39;activité de ligase. La configuration de TIRFM est illustré à la figure 1. Une coutumeStade-éprouvette conçu est placé sur un corps de microscope Olympus IX61. 532 nm et 640 nm lasers sont introduits à partir du côté et sont réfléchies par les miroirs elliptiques minuscules 14 dans l&#39;objectif d&#39;atteindre une grande NA angle d&#39;incidence critique à l&#39;interface lamelle couvre-objet dans l&#39;eau. Nous notons que plus répandue TIR par-objectif en utilisant des miroirs dichroïques ou configurations de TIR sur la base de prisme peut également être utilisé pour cette application de FRET. L&#39;image de fluorescence formée par le microscope est divisée en images de donneur et d&#39;accepteur par un miroir dichroïque. Ils sont ensuite convertis à la sur les deux moitiés d&#39;un EMCCD. Filtres d&#39;émission passe-longue supplémentaires sont utilisés pour réduire le signal de fond. Contrôle de la température est essentielle pour acquérir des données cinétiques reproductibles. Pour le contrôle de la température, l&#39;objectif est séparée de la pièce de nez du corps de microscope pour minimiser le transfert de chaleur, et de l&#39;eau à partir d&#39;une température contrôlée refroidisseur / réchauffeur est mis en circulation par l&#39;intermédiaire d&#39;un collier en laiton qui s&#39;adapte étroitement deautour du métal intérieur sous la veste objectif. Cette configuration est en mesure de réaliser robuste contrôle de la température à la surface de la lamelle couvre entre 15 et 50 ° C (Figure 2). Dans ce travail, la température de l&#39;échantillon a été maintenue à 24 ° C. Le protocole ci-dessous présente la procédure étape par étape pour la construction d&#39;ADN, de l&#39;estimation de la forme de l&#39;ADN, molécule expérience unique, et la détermination du facteur J.

<table><tbody><tr><td>Small DNA FRAG Extract Kit-100PR</td><td>VWR</td><td>97060-558</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide 40 % solution 500 ml</td><td>VWR</td><td>97064-522</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide 2 % (p/v) solution 500 ml</td><td>VWR</td><td>97063-948</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Échelle d’ADN, 100-1 000 bp</td><td>Fermentas</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Mini Vertical PAGE System</td><td>VWR</td><td>89032-300</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue 0.2 &mu ; m CS50</td><td>VWR</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813-1G</td><td>trempe à l’état triplet</td></tr><tr><td>Acide protocatéchuique (PCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08992-50MG</td><td>système de piégeage de l’oxygène</td></tr><tr><td>Protocatéchuate 3,4-dioxygénase (PCD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td>système de piégeage de l’oxygène</td></tr><tr><td>mPEG-silane, MW 2,000 1 g</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Biotine-PEG-Silane, MW 3 400</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Avidine, NeutrAvidin Protéine de liaison à la biotine</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start High-Fidelity DNA polymérase</td><td>New England Biolabs</td><td>F-540L</td><td></td></tr><tr><td>Gel/PCR Kit d’extraction de fragments d’ADN</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47020</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope en verre ordinaire de qualité supérieure</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR micro cover glass, rectangulaire, n° 1</td><td>VWR</td><td>48404-456</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp 1006S Refroidisseur/chauffage à recirculation</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Contrôle de la température</td></tr><tr><td>Collier de refroidissement objectif</td><td>Bioptechs</td><td>150303</td><td>contrôle de la température</td></tr><tr><td>KMI53 Biologique Elatine de mesure micrométrique</td><td>Semprex</td><td>KMI53</td><td></td></tr><tr><td>Laser DPSS haute performance 532 nm 50 mW</td><td>Edmund optics</td><td>NT66-968</td><td>Cy3 excitation</td></tr><tr><td>CUBE Fibre Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fibre, Connecteur FC/APC</td><td>Cohérent</td><td>1139604</td><td>Cy5</td></tr><tr><td>excitation 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>FF650-Di01-25x36</td><td>splitting dichroic</td></tr><tr><td>Combinateur de faisceau LaserMUX, réfléchit 514.5, 532 et Lasers 543,5 nm, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>LM01-552-25</td><td>combinant dichroïque</td></tr><tr><td>Filtre de fluorescence Brightline 593/40</td><td>Semrock</td><td>FF01-593/40-25</td><td>Filtre d’émission Cy3</td></tr><tr><td>635 nm EdgeBasic LWP Filtre passe-long, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>BLP01-635R-25</td><td>Filtre d’émission Cy5</td></tr><tr><td>EMCCD iXon+</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>IX51 cadre de microscope inversé</td><td>Objectif Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UApo N 100X/1.49 Huile TIRF</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huile d’immersion type-F pour microscopie à fluorescence</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>2 mm Diamètre 45&deg ; Lentille à tige recouverte d’aluminium&nbsp ;</td><td>Edmund optics</td><td>54-092</td><td>miroir miniature</td></tr><tr><td>1/4" Translation Stage de translation monoaxe de voyage</td><td>Thorlabs</td><td>MS-1</td><td>traduction de miroir miniature</td></tr> <tr><td>& Oslash ; Doublet achromatique 1", ARC : 400-700 nm, f=200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A</td><td>lentille de mise au point</td></tr><tr><td>Fente mécanique réglable</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td></td></tr><tr><td>Miroir diélectrique</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash ; Doublet achromatique 1", f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A</td><td></td></tr><tr><td>Lentille relais Monture d’objectif pour & Oslash ; Optique 1"</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td></td></tr><tr><td>Monture de filtre dichroïque</td><td>Thorlabs</td><td>FFM1</td><td></td></tr><tr><td>Plate-forme cubique à cage fixe</td><td>Thorlabs</td><td>B3C</td><td></td></tr><tr><td>Monture cinématique pour & Oslash ; 1" Optique</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>N-BK7 Lentille plan-convexe, & Oslash ; 1", f = 40 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-A</td> lentille <td>collimative</td></tr><tr><td>N-BK7 Lentille plan-convexe, & Oslash ; 6,0 mm, f = 15 mm</td><td>Lentille télescopique</td><td>Thorlabs</td><td>LA1222-A</td></tr><tr><td>N-BK7 Lentille plan-convexe, & Oslash ; 6,0 mm, f = 150 mm</td><td>Lentille du télescope</td> <td>Thorlabs</td><td>LA1433-A</td></tr></tbody></table>

Étude de l&#39;adn looping par une seule molécule fret

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

La flexion de l&#39;ADN double brin (ADNdb) est associée à de nombreux processus biologiques importants tels que la reconnaissance protéine-ADN et ADN emballage dans des nucléosomes. Thermodynamique de l&#39;ADN double brin de flexion a été étudiée par une méthode dite de cyclisation qui repose sur l&#39;ADN ligase pour joindre de manière covalente des extrémités cohésives courtes d&#39;un ADN double brin. Cependant, l&#39;efficacité de la ligature peut être affectée par de nombreux facteurs qui ne sont pas liés à ADN double brin boucle comme la structure de l&#39;ADN entourant les extrémités collantes jointes, et ligase peut également affecter le taux de boucle apparente à travers des mécanismes tels que la liaison non spécifique. Ici, nous montrons comment mesurer dsADN cinétique de boucle sans ligase en détectant transitoire formation de boucle d&#39;ADN par FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). les molécules d&#39;ADNdb sont construites en utilisant un protocole simple basé sur la PCR avec une paire de FRET et une séquence de liaison à la biotine. La densité de probabilité de boucle connue comme le facteur J est extrait à partir de la vitesse en boucle et le taux d&#39;hybridation entre deux déconnexionextrémités cohésives TED. En testant deux dsDNAs avec des courbures différentes intrinsèques, on montre que le facteur de J est sensible à la forme intrinsèque de l&#39;ADN double brin.

molécules d&#39;ADN utilisées pour l&#39;étude de bouclage sont constitués d&#39;une région duplex de longueur et séquence variable et des surplombs simple brin qui sont complémentaires les unes aux autres. Les saillies, qui sont à base de temps 7, peuvent s&#39;hybrider à l&#39;autre pour capter l&#39;état de boucle. Chaque surplomb contient soit Cy3 ou Cy5 qui est lié à l&#39;ossature de l&#39;ADN grâce à la chimie amidite. Le Cy5-faux est également lié à la biotine-TEG (15 atome Tetra-éthylène glycol entretoise) pour...

Cette étude présente une procédure expérimentale détaillée pour mesurer la dynamique de boucle d&#39;ADN double-brin en utilisant une seule molécule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Le protocole décrit également comment extraire la densité de probabilité boucle appelée facteur de J.

Étude de l&#39;ADN Looping par une seule molécule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’étudier comment la dynamique de boucle de l’ADN double brin est affectée par la forme intrinsèque de l’ADN sans l’utilisation de protéines de liaison à l’ADN. Ceci est réalisé en incorporant des molécules de colorant dans des fragments d’ADN double brin de différentes courbures afin que le bouclage de l’ADN puisse être surveillé par résonance de fluorescence, transfert d’énergie ou frette. Les événements de bouclage et de débouclage réversibles des molécules d’ADN uniques peuvent ensuite être observés par microscopie à réflexion interne totale.Le taux de boucle de l’ADN peut ensuite être extrapolé à partir des trajectoires temporelles de la fluorescence de chaque molécule. En fin de compte, la probabilité de boucle de l’ADN par rapport à la forme intrinsèque du fragment peut être mesurée. Le principal avantage de ce test de bouclage de l’ADN est qu’il ne repose pas sur la protéine de liaison à l’ADN A, ce qui pourrait affecter la cinétique de bouclage de l’ADN A.Le protocole simple consiste à utiliser une technique appelée résonance de fluorescence, transfert d’énergie et synthèse d’ADN basée sur la PCR. Pour mesurer la probabilité d’apparition de l’ADN, commencez par concevoir des ADN courbés à l’échelle mondiale en répétant une séquence de 10 MER. Par exemple, cette séquence représentative est une paire d’ADN incurvée de 186 bases, où X est une base supplémentaire aléatoire et les séquences flanquant la séquence répétitive de 10 mers sont des séquences adaptatrices.Ensuite, effectuez une PCR avec les amorces un et deux avec le donneur de frettes SI trois en marquant l’amorce deux à l’extrémité cinq prime. Ensuite, effectuez une PCR avec les amorces trois et quatre avec l’accepteur de frettes, le marquage SCI cinq à travers le squelette et le liant de biotine à l’extrémité cinq de l’amorce trois. Après avoir purifié les produits PCR à l’aide d’un kit de nettoyage PCR, mélangez les produits marqués SCI trois et les produits SCI cinq marqués dans un tampon pour l’échange de brins à des concentrations finales de 0,4 micromolaire et 0,1 micromolaire respectivement.Ensuite, incubez les brins à 98,5 degrés Celsius pendant deux minutes, en les refroidissant progressivement à cinq degrés Celsius avec une vitesse de rampe de 0,1 degré Celsius par seconde, puis en incubant à cinq degrés Celsius pendant deux heures. Pour remplacer les brins afin de préparer la cellule d’écoulement, utilisez une perceuse à colonne et des forets diamantés pour créer six à sept paires de trous le long des deux bords opposés d’une lame de verre de trois pouces sur un pouce. Lorsque tous les trous ont été percés, frottez la lame sous l’eau courante pour éliminer toute poudre de verre visible.Placez les lames à la verticale dans un bocal en verre et remplissez-le d’eau distillée. Sonicez le bocal pendant 15 minutes puis transférez les lames dans un bocal en verre dédié au nettoyage à l’acétone. Remplissez le pot d’acétone et sioniquez les lames dans de l’acétone pendant encore 15 minutes.Ensuite, vaporisez les lames avec de l’éthanol puis de l’eau pour les rincer, puis transférez les lames dans un bocal en polypropylène. Remplissez le pot en polypropylène avec cinq molaires d’hydroxyde de potassium, puis sonicez les lames pendant 15 minutes supplémentaires après le dernier lavage, rincez les lames à l’eau distillée, puis 15 minutes supplémentaires. Sonication puis après nettoyage des lamelles.De la même manière, versez 80 microlitres de solution PEG fraîchement préparée sur chaque lame, puis abaissez doucement une lamelle sur la cheville. Après 45 minutes, utilisez une pince à épiler pour retirer les lamelles des lames, rincez les lames et les lamelles avec une grande quantité d’eau distillée. Ensuite, séchez-les dans un dessécheur lorsque les lamelles et les lames sont sèches, placez de fines bandes de ruban adhésif double sur la lame pour former des canaux, alignez une lamelle sur les bandes et appuyez fermement sur la lamelle pour former des canaux étanches aux liquides.Utilisez ensuite de l’époxy pendant cinq minutes pour sceller les bords des canaux afin d’immobiliser les molécules pour la microscopie. Tout d’abord, injectez 15 microlitres de solution de neu tradin dans un canal. Après deux minutes, rincez le canal avec 100 microlitres de tampon T 50, puis injectez 50 microlitres d’échantillon d’ADN dans le canal.Après cinq minutes, rincez l’ADN non lié avec 100 microlitres de tampon T 50, puis remplissez le canal avec un tampon d’imagerie qui contient le système de piégeage de l’oxygène. Placez maintenant de l’huile d’immersion sur l’objectif du microscope, puis utilisez des clips d’échantillon pour fixer la cellule d’écoulement sur la platine du microscope. Allumez le laser de 532 nanomètres.Utilisez la vue en direct des images fluorescentes sur le moniteur pour affiner. Ajustez la mise au point. Commencez l’acquisition de données avec le laser de 532 nanomètres allumé.Arrêtez l’acquisition de données lorsque la plupart des molécules ont été photoblanchies pour traiter et analyser les images, utilisez un script MATLAB pour examiner toutes les traces temporelles d’une seule molécule qui montrent de multiples transitions entre les signaux de frettes aigus et graves. Identifiez les états en boucle et sans boucle, puis déterminez le seuil qui sépare les deux distributions en déterminant l’intersection entre les deux courbes gaussiennes ajustées. Ensuite, calculez l’efficacité du front F en divisant l’intensité de la science-fiction par la somme des trois de l’ICS et des intensités de science-fiction.Attribution des états de boucle avec des valeurs de frette élevées et des états de déboucrage avec des valeurs de frette faibles. Ensuite, à l’aide d’un script MATLAB, analysez le nombre cumulé de molécules ou de NFT qui ont bouclé, c’est-à-dire qui ont atteint l’état de frette élevée à différents laps de temps. Depuis le début de l’acquisition de données, le taux de bouclage K sub boucle peut ensuite être extrait en ajustant le NFT avec une fonction exponentielle.Si le NFT augmente bi, il peut être équipé d’une double fonction exponentielle comme illustré dans l’équation. Dans ce cas, la sous-boucle K est obtenue à partir de cette équation pour déterminer l’écoulement du facteur J. 20 microlitres de 30 à 50 picaMolar biotine sci cinq oligo ou amorce trois dans l’un des canaux revêtus de travain de noix comme nous venons de le démontrer.Ensuite, rincez le canal avec 100 microlitres de T 50 pour éliminer les oligos non liés, puis versez dans la chambre un tampon d’imagerie fraîchement préparé complété par trois oligonucléotides PS. Gardez le laser de 532 nanomètres allumé, puis allumez brièvement le laser de 640 nanomètres pour identifier les emplacements de tous les oligos de science-fiction liés à la surface. Éteignez ensuite le laser de 640 nanomètres et commencez à surveiller le signal de frette.Utilisez un script MATLAB pour analyser le nombre de molécules qui commencent à l’état non lié. C’est-à-dire avec une faible intensité de sci cinq, mais qui se transforme plus tard en état IL. C’est-à-dire qu’avec une intensité de science-fiction élevée, en fonction du temps, à partir des traces d’intensité de science-fiction, tracez ce nombre de molécules d’ane en fonction du temps, en ajustant la courbe avec une seule fonction exponentielle pour obtenir le taux d’élénence.K sub anil, répétez l’expérience à différentes concentrations d’oligo-oligonucléotides SI pour confirmer la linéarité entre la vitesse d’agenouillement et la concentration du réactif. Extrayez le deuxième ordre une constante de vitesse à genoux K prime indice tout de la pente. Enfin, calculez le facteur J où K sub loop est le taux de bouclage mesuré dans les mêmes conditions tampons pour tester l’effet de la courbure intrinsèque de l’ADN double brin sur le bouclage.Dans cette expérience, une paire de bases 186 droite et une paire de bases incurvée. L’ADN double brin a été construit par rapport à l’ADN simple. Il a été déterminé que l’ADN incurvé produisait plus d’événements de frettes élevées au cours de la même période.L’ADN incurvé a également bouclé quatre fois plus fréquemment que l’ADN droit au cours de la même période d’acquisition, démontrant que la courbure intrinsèque de l’ADN peut affecter de manière significative la dynamique de la boucle. Dans cette dernière étape d’analyse, le facteur J a été calculé en divisant le taux de boucle par le premier ordre, une constante de vitesse d’agenouillement, et a été déterminé à 61 plus ou moins trois anomolaires pour l’ADN droit et à 265 plus ou moins 48 nanomolaires pour l’ADN de la courbe, en accord avec les résultats précédents. À la suite de cette procédure, les effets du facteur d’accident sur la mobilité en boucle, tels que la température, la déformation et la viscosité, peuvent être étudiés.Ce protocole sera utile non seulement pour étudier la physique des polymères de l’ADN, mais aussi pour démontrer la puissance de la fluorescence d’une molécule unique aux étudiants débutants en recherche ou à un public profane.

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