Étude de l'ADN Looping par une seule molécule FRET

Cette étude présente une procédure expérimentale détaillée pour mesurer la dynamique de boucle d'ADN double-brin en utilisant une seule molécule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Le protocole décrit également comment extraire la densité de probabilité boucle appelée facteur de J.

L’objectif général de l’expérience suivante est d’étudier comment la dynamique de boucle de l’ADN double brin est affectée par la forme intrinsèque de l’ADN sans l’utilisation de protéines de liaison à l’ADN. Ceci est réalisé en incorporant des molécules de colorant dans des fragments d’ADN double brin de différentes courbures afin que le bouclage de l’ADN puisse être surveillé par résonance de fluorescence, transfert d’énergie ou frette. Les événements de bouclage et de débouclage réversibles des molécules d’ADN uniques peuvent ensuite être observés par microscopie à réflexion interne totale.

Le taux de boucle de l’ADN peut ensuite être extrapolé à partir des trajectoires temporelles de la fluorescence de chaque molécule. En fin de compte, la probabilité de boucle de l’ADN par rapport à la forme intrinsèque du fragment peut être mesurée. Le principal avantage de ce test de bouclage de l’ADN est qu’il ne repose pas sur la protéine de liaison à l’ADN A, ce qui pourrait affecter la cinétique de bouclage de l’ADN A.

Le protocole simple consiste à utiliser une technique appelée résonance de fluorescence, transfert d’énergie et synthèse d’ADN basée sur la PCR. Pour mesurer la probabilité d’apparition de l’ADN, commencez par concevoir des ADN courbés à l’échelle mondiale en répétant une séquence de 10 MER. Par exemple, cette séquence représentative est une paire d’ADN incurvée de 186 bases, où X est une base supplémentaire aléatoire et les séquences flanquant la séquence répétitive de 10 mers sont des séquences adaptatrices.

Ensuite, effectuez une PCR avec les amorces un et deux avec le donneur de frettes SI trois en marquant l’amorce deux à l’extrémité cinq prime. Ensuite, effectuez une PCR avec les amorces trois et quatre avec l’accepteur de frettes, le marquage SCI cinq à travers le squelette et le liant de biotine à l’extrémité cinq de l’amorce trois. Après avoir purifié les produits PCR à l’aide d’un kit de nettoyage PCR, mélangez les produits marqués SCI trois et les produits SCI cinq marqués dans un tampon pour l’échange de brins à des concentrations finales de 0,4 micromolaire et 0,1 micromolaire respectivement.

Ensuite, incubez les brins à 98,5 degrés Celsius pendant deux minutes, en les refroidissant progressivement à cinq degrés Celsius avec une vitesse de rampe de 0,1 degré Celsius par seconde, puis en incubant à cinq degrés Celsius pendant deux heures. Pour remplacer les brins afin de préparer la cellule d’écoulement, utilisez une perceuse à colonne et des forets diamantés pour créer six à sept paires de trous le long des deux bords opposés d’une lame de verre de trois pouces sur un pouce. Lorsque tous les trous ont été percés, frottez la lame sous l’eau courante pour éliminer toute poudre de verre visible.

Placez les lames à la verticale dans un bocal en verre et remplissez-le d’eau distillée. Sonicez le bocal pendant 15 minutes puis transférez les lames dans un bocal en verre dédié au nettoyage à l’acétone. Remplissez le pot d’acétone et sioniquez les lames dans de l’acétone pendant encore 15 minutes.

Ensuite, vaporisez les lames avec de l’éthanol puis de l’eau pour les rincer, puis transférez les lames dans un bocal en polypropylène. Remplissez le pot en polypropylène avec cinq molaires d’hydroxyde de potassium, puis sonicez les lames pendant 15 minutes supplémentaires après le dernier lavage, rincez les lames à l’eau distillée, puis 15 minutes supplémentaires. Sonication puis après nettoyage des lamelles.

De la même manière, versez 80 microlitres de solution PEG fraîchement préparée sur chaque lame, puis abaissez doucement une lamelle sur la cheville. Après 45 minutes, utilisez une pince à épiler pour retirer les lamelles des lames, rincez les lames et les lamelles avec une grande quantité d’eau distillée. Ensuite, séchez-les dans un dessécheur lorsque les lamelles et les lames sont sèches, placez de fines bandes de ruban adhésif double sur la lame pour former des canaux, alignez une lamelle sur les bandes et appuyez fermement sur la lamelle pour former des canaux étanches aux liquides.

Utilisez ensuite de l’époxy pendant cinq minutes pour sceller les bords des canaux afin d’immobiliser les molécules pour la microscopie. Tout d’abord, injectez 15 microlitres de solution de neu tradin dans un canal. Après deux minutes, rincez le canal avec 100 microlitres de tampon T 50, puis injectez 50 microlitres d’échantillon d’ADN dans le canal.

Après cinq minutes, rincez l’ADN non lié avec 100 microlitres de tampon T 50, puis remplissez le canal avec un tampon d’imagerie qui contient le système de piégeage de l’oxygène. Placez maintenant de l’huile d’immersion sur l’objectif du microscope, puis utilisez des clips d’échantillon pour fixer la cellule d’écoulement sur la platine du microscope. Allumez le laser de 532 nanomètres.

Utilisez la vue en direct des images fluorescentes sur le moniteur pour affiner. Ajustez la mise au point. Commencez l’acquisition de données avec le laser de 532 nanomètres allumé.

Arrêtez l’acquisition de données lorsque la plupart des molécules ont été photoblanchies pour traiter et analyser les images, utilisez un script MATLAB pour examiner toutes les traces temporelles d’une seule molécule qui montrent de multiples transitions entre les signaux de frettes aigus et graves. Identifiez les états en boucle et sans boucle, puis déterminez le seuil qui sépare les deux distributions en déterminant l’intersection entre les deux courbes gaussiennes ajustées. Ensuite, calculez l’efficacité du front F en divisant l’intensité de la science-fiction par la somme des trois de l’ICS et des intensités de science-fiction.

Attribution des états de boucle avec des valeurs de frette élevées et des états de déboucrage avec des valeurs de frette faibles. Ensuite, à l’aide d’un script MATLAB, analysez le nombre cumulé de molécules ou de NFT qui ont bouclé, c’est-à-dire qui ont atteint l’état de frette élevée à différents laps de temps. Depuis le début de l’acquisition de données, le taux de bouclage K sub boucle peut ensuite être extrait en ajustant le NFT avec une fonction exponentielle.

Si le NFT augmente bi, il peut être équipé d’une double fonction exponentielle comme illustré dans l’équation. Dans ce cas, la sous-boucle K est obtenue à partir de cette équation pour déterminer l’écoulement du facteur J. 20 microlitres de 30 à 50 picaMolar biotine sci cinq oligo ou amorce trois dans l’un des canaux revêtus de travain de noix comme nous venons de le démontrer.

Ensuite, rincez le canal avec 100 microlitres de T 50 pour éliminer les oligos non liés, puis versez dans la chambre un tampon d’imagerie fraîchement préparé complété par trois oligonucléotides PS. Gardez le laser de 532 nanomètres allumé, puis allumez brièvement le laser de 640 nanomètres pour identifier les emplacements de tous les oligos de science-fiction liés à la surface. Éteignez ensuite le laser de 640 nanomètres et commencez à surveiller le signal de frette.

Utilisez un script MATLAB pour analyser le nombre de molécules qui commencent à l’état non lié. C’est-à-dire avec une faible intensité de sci cinq, mais qui se transforme plus tard en état IL. C’est-à-dire qu’avec une intensité de science-fiction élevée, en fonction du temps, à partir des traces d’intensité de science-fiction, tracez ce nombre de molécules d’ane en fonction du temps, en ajustant la courbe avec une seule fonction exponentielle pour obtenir le taux d’élénence.

K sub anil, répétez l’expérience à différentes concentrations d’oligo-oligonucléotides SI pour confirmer la linéarité entre la vitesse d’agenouillement et la concentration du réactif. Extrayez le deuxième ordre une constante de vitesse à genoux K prime indice tout de la pente. Enfin, calculez le facteur J où K sub loop est le taux de bouclage mesuré dans les mêmes conditions tampons pour tester l’effet de la courbure intrinsèque de l’ADN double brin sur le bouclage.

Dans cette expérience, une paire de bases 186 droite et une paire de bases incurvée. L’ADN double brin a été construit par rapport à l’ADN simple. Il a été déterminé que l’ADN incurvé produisait plus d’événements de frettes élevées au cours de la même période.

L’ADN incurvé a également bouclé quatre fois plus fréquemment que l’ADN droit au cours de la même période d’acquisition, démontrant que la courbure intrinsèque de l’ADN peut affecter de manière significative la dynamique de la boucle. Dans cette dernière étape d’analyse, le facteur J a été calculé en divisant le taux de boucle par le premier ordre, une constante de vitesse d’agenouillement, et a été déterminé à 61 plus ou moins trois anomolaires pour l’ADN droit et à 265 plus ou moins 48 nanomolaires pour l’ADN de la courbe, en accord avec les résultats précédents. À la suite de cette procédure, les effets du facteur d’accident sur la mobilité en boucle, tels que la température, la déformation et la viscosité, peuvent être étudiés.

Ce protocole sera utile non seulement pour étudier la physique des polymères de l’ADN, mais aussi pour démontrer la puissance de la fluorescence d’une molécule unique aux étudiants débutants en recherche ou à un public profane.