Analyse de l'altération de l'épithélium Produit par

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer les interactions précoces entre l'hôte et l'agent pathogène ainsi que le potentiel d'invasion de TBA.Histolytica. Préparez d'abord les trophozoïtes intacts, les lysats totaux de trophozoïtes ou les trophozoïtes sécrétés. Incubez ensuite les cellules épithéliales de l'hôte avec des concentrations appropriées des différents trophozoïtes.

À présent, en utilisant l'immunofluorescence AM, analysez les cultures épithéliales traitées pour détecter des protéines spécifiques d'ABA histolytica interagissant avec les jonctions serrées des cellules épithéliales, et mesurez également les altérations de la barrière paracellulaire par résistance électrique transepithéliale. L'ensemble des résultats peut démontrer le désassemblage des jonctions serrées induit par TBA histolytica, et permet également d'identifier la participation des complexes spécifiques dans ce processus. Les avantages principaux de cette technique résident dans l'utilisation de différents produits du parasite pour évaluer la translocation des facteurs Eva histo dans l'épithélium hôte, ainsi que pour démontrer l'implication de ces Eva.

Ses facteurs sur l'ouverture des jonctions des cellules entières à des stades très précoces de l'infection. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la virulence amibienne, telles que la compréhension des interactions moléculaires entre les cellules épithéliales et le parasite *diva isli*. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés car elles ne connaissent pas les durées d'incubation appropriées, la proportion adéquate des deux types cellulaires pour la co-incubation, ni la manière d'obtenir les différents produits ELI et de mesurer la résistance transepithéliale (TER).

Les implications de cette technique s'étendent à notre traitement des infections, car des facteurs viraux tels que le complexe E-H-C-P-A-D-H 112 pourraient être exploités comme cibles dans de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette méthode in vitro peut fournir des informations sur la participation du facteur viral Anica à l'interaction au site d'entrée initial. Elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que des modèles d'infection in vivo chez la souris, le hamster, le cobaye, ainsi que sur des biopsies intestinales humaines. Culture.

Les cellules MDCK dans 10 millilitres de milieu DMEM complémenté à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius. Faire croître authentiquement une fois 10 à la puissance 5 trophozoïtes d'Entamoeba histolytica dans 15 millilitres de milieu TYIS 33, à 37 degrés Celsius. Pour détacher les trophozoïtes, refroidir le tube pendant cinq à dix minutes dans un bain de glace et d'eau.

Transférez ensuite la culture de manière aseptique dans un tube conique et centrifugez à 360 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Décantez soigneusement le surnageant. Ajoutez du PBS glacé au culot et retournez le tube plusieurs fois pour disperser les cellules après la centrifugation.

Déterminez le nombre de trophozoïtes à l’aide d’un hémocytomètre pour lyser les trophozoïtes, puis congélez-les rapidement à l’azote liquide pendant une minute, décongelez-les à quatre degrés Celsius et vortexez vigoureusement. Activez maintenant les protéases présentes dans les lysats avec du bêta-mercaptoéthanol à 0,02 %. Diluez neuf fois 10 à la puissance six trophozoïtes dans trois millilitres de PBS glacé, puis transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres.

Placez maintenant la suspension de trophozoïtes à un angle horizontal incliné de cinq degrés dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant deux heures afin de recueillir les produits sécrétés, puis centrifugez le tube à 360 ×g pendant 10 minutes. Utilisez une seringue jetable et stérile pour prélever soigneusement le surnageant, en évitant toute contamination des échantillons par les trophozoïtes du culot. Ensuite, pour éliminer toute cellule transférée, faites passer le surnageant à travers une membrane en acétate de cellulose de 0,22 micron.

Activez maintenant les protéases avec du bêta-mercaptoéthanol à 0,02 % pour la culture en immunofluorescence. Les cellules MDCK sur des lamelles de verre stériles placées dans une boîte de culture cellulaire multipuits de 24 puits. Examinez les cellules au microscope inversé jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 100 %.

Ajoutez les différentes conditions de trophozoïtes diluées dans un millilitre de PBS chaud. Incluez les conditions témoins de cellules MDCK avec du PBS et sans E. histolytica, ainsi que les cellules MDCK avec les différentes conditions de trophozoïtes, mais sans incubation avec les anticorps primaires. Placez la plaque de culture dans l'incubateur pendant deux ou 30 minutes.

Ensuite, lavez les cellules épithéliales cinq fois avec du PBS froid afin d'éliminer les molécules non liées ou les trophozoïtes. Fixez et percez les cellules avec un millilitre d'éthanol à 96 % pendant plusieurs minutes à moins 20 degrés Celsius dans une chambre humide. Retirez délicatement les lamelles des puits.

Retirer l'excès de liquide sur le bord à l'aide de papier filtre et plonger la lame avec les cellules orientées vers le bas dans une solution de blocage contenant 0,5 % de BSA. Incuber les échantillons pendant une heure à température ambiante. Pendant ce temps, préparer un mélange d'anticorps primaires dans du PBS.

Soulevez les lamelles à partir de la solution de blocage. Séchez tout excès de liquide sur du papier filtre. Transférez les cellules dans la solution d'anticorps et incubez les échantillons toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Lavez les cellules cinq fois avec un millilitre de PBS afin d'éliminer les molécules non liées. Préparez maintenant un mélange des deux anticorps secondaires fluorescents dans du PBS. Incubez les échantillons dans les anticorps secondaires pendant une heure à température ambiante à l'abri de la lumière pour la coloration nucléaire.

Incuber les cellules pendant trois minutes avec 200 microlitres d'une solution de dappy 0,05 millimolaire à température ambiante à l'abri de la lumière. Analyser ensuite les préparations par microscopie confocale à l'aide de coupes Zack et de plans XZ dans les expériences de co-incubation. À l'aide d'inhibiteurs de protéase ou d'un anticorps spécifique, incuber chaque condition expérimentale pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius avec des inhibiteurs de protéase ou un anticorps monoclonal en culture.

Sur des cellules MDCK cultivées sur des inserts perméables stériles dans le compartiment supérieur, déposer 100 microlitres de la suspension cellulaire et, dans le compartiment inférieur, ajouter 600 microlitres de milieu DMEM supplémenté. Placer les inserts préparés dans l’incubateur sur un microscope inversé. Vérifier que les cellules sont confluentes à 100 %.

Recueillir et rassembler le milieu du compartiment supérieur de chaque transwell dans 50 microlitres de ce mélange de milieu. Ajouter 50 microlitres de suspension de trophozoïtes ou de contrôle au PBS. Transférer ensuite les mélanges dans la chambre supérieure de chaque transwell contenant les cellules MDCK.

Plongez immédiatement les deux électrodes du STX dans chaque transwell pour mesurer la résistance électrique transepithéliale. Veillez à ce que l'électrode la plus longue touche le fond de la chambre inférieure et que l'électrode la plus courte soit recouverte de milieu dans le compartiment supérieur. Les E. histolytica ont été cultivés dans des conditions d'anaérobiose et récoltés en phase de croissance tardive logarithmique à préstationnaire.

Ici, le marqueur des jonctions serrées ZO-1 a été utilisé pour visualiser les contacts cellulaires des cellules épithéliales stabilisés par des jonctions serrées et d’ancrage. Une immunofluorescence avec l’anticorps monoclonal a été utilisée pour étudier l’interaction du complexe d’origine amibienne avec la surface épithéliale ; l’application de trophozoïtes, de lysats totaux ou de produits sécrétés sur la monocouche épithéliale a entraîné une colocalisation du complexe avec la jonction serrée. Après 30 minutes, une coloration discontinue de ZO-1 est apparue aux limites cellulaires, accompagnée d’une internalisation dans des vésicules.

Ce trouble était particulièrement marqué au niveau des contacts entre les cellules MDCK et les trophozoïtes et les trophozoïtes. L'analyse par microscopie confocale laser de lysats totaux a indiqué que le complexe de virulence pénétrait vers l'espace intercellulaire. Une colocalisation avec la coloration du parasite au niveau du contact où la jonction ZO-1 est perturbée, perturbe la fonction de barrière épithéliale et entraîne une chute de 90 % de la résistance électrique transepithéliale.

La préincubation des trophozoïtes avec un anticorps dirigé contre le complexe ou avec des inhibiteurs de protéase a entraîné une protection contre la chute de la résistance transepithéliale (TER). Ces données suggèrent conjointement que l'activité protéolytique et les propriétés adhésives sont des facteurs de virulence importants de ce complexe lors de l'invasion par E. histolytica. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser les mécanismes par lesquels les facteurs de virulence d’E. histolytica ouvrent les jonctions serrées lors des premiers stades de l'infection. Une fois maîtrisée, cette analyse des lésions épithéliales peut être réalisée en trois heures, dès que les produits lyés et les cultures cellulaires sont prêts.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de respecter scrupuleusement les durées d'interaction exactes pour les ions selon cette méthode. D'autres approches, telles que les dosages par immunoprécipitation, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme d'éventuelles associations entre les facteurs de virulence d'Entamoeba histolytica et les protéines épithéliales après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des interactions hôte-pathogène pour explorer la pathogenèse de l'AMS chez la souris hamster, le cobaye et les tissus humains.