Multi-étape de préparation technique pour récupérer plusieurs classes de composés de métabolites pour approfondie et analyse métabolomique informatif

L’objectif global de cette procédure est de démontrer un moyen efficace de fractionner les métabolites dans des fluides biologiques complexes afin d’obtenir des échantillons simplifiés pour une meilleure couverture du métabolome. Pour ce faire, chaque échantillon est d’abord enrichi d’étalons internes afin de surveiller la reproductibilité de la préparation de l’échantillon et des conditions de l’instrument. La deuxième étape consiste à ajouter du méthanol glacé à chaque échantillon pour précipiter les protéines qui pourraient autrement interférer avec la chromatographie et l’analyse ultérieures par spectrométrie de masse.

Ensuite, l’étape d’extraction du liquide liquide sépare les métabolites hydrophiles des métabolites hydrophobes. La dernière étape est l’extraction en phase solide pour fractionner davantage les métabolites lipidiques en phospholipides, acides gras et lipides neutres. En fin de compte, cette méthode combinée en plusieurs étapes est utilisée pour montrer une séparation efficace, une excellente reproductibilité et une meilleure couverture du métabolome plasmatique.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme une simple extraction au méthanol, est que nous obtenons une meilleure couverture en métabolites, en particulier des lipides, ce qui est important lors de la réalisation d’études de profilage métabolomique ou lorsque les lipides présentent un intérêt particulier. Avant la précipitation des protéines, préparez les échantillons et décongelez-les d’abord à température ambiante. Ensuite, ajoutez aux échantillons des étalons internes ISTD qui ont été préparés au préalable.

Toutes les concentrations étalons ont été ajustées au besoin en fonction de la sensibilité des instruments MS et HPLC utilisés. Pour l’analyse, ajoutez 10 microlitres à chaque échantillon. Chacune des solutions étalons hydrophiles et hydrophobes enrichit chaque échantillon de 10 microlitres d’une solution de contrôle positif x deux x ou quatre fois.

Une fois que tous les échantillons ont été enrichis d’étalons internes et de solutions de contrôle positif, agitez chaque échantillon pendant 10 secondes. Pour commencer la précipitation des protéines, ajoutez 400 microlitres de méthanol glacé à chaque échantillon. Vortex pendant 10 secondes par tube centrifugeuse à zéro degré Celsius pendant 15 minutes à 18 000 fois.

G, Une pastille de protéine doit se former au fond du tube. Après centrifugation, transférez tout le surnageant dans un nouveau tube de culture en verre, puis séchez-le sous azote. Ce résidu séché subira plus tard une extraction liquide liquide.

Pour l’analyse de la fraction de pastilles de protéines, ajoutez un millilitre d’éther de coléoptère méthyle ou de MTBE au vortex de pastilles de protéines blanc ou blanc cassé pendant 30 secondes par tube et centrifugez à zéro degré Celsius pendant 15 minutes à 18 000 fois. G décantez la couche de MTBE dans un nouveau tube de culture en verre. Étant donné que la taille de la pastille varie d’un échantillon à l’autre, il est important d’aspirer systématiquement la même quantité de MTBE pour tous les échantillons.

Par exemple, si seulement 900 microlitres peuvent être décantés pour l’échantillon contenant le moins de surnageant, décantez 900 microlitres. Pour tous les échantillons, ajoutez un autre millilitre de MTBE dans le vortex de pastilles de protéines pendant 30 secondes, puis centrifugez à zéro degré Celsius ou 15 minutes. Ajouter 18 000 fois G comme précédemment, aspirer la couche de MTBE et l’ajouter aux tubes de culture en verre préparés précédemment.

Sécher les échantillons par flux d’azote et les remettre en suspension dans 200 microlitres de méthanol chloroforme individuel. Transférez chaque échantillon dans un tube à centrifuger et centrifugez-le à zéro degré Celsius pendant 15 minutes à 18 000 fois G.Après cela, utilisez des pipettes en verre pour transférer le surnageant dans des flacons à bouchon à vis d’échantillonneur automatique. Pour commencer cette procédure, à l’aide d’une pipette en verre, ajoutez trois millilitres de MTBE au résidu de méthanol séché préparé plus tôt et faites tourbillonner pendant 30 secondes.

Après cela, ajoutez 750 microlitres d’eau dans chaque tube et vortex pendant 10 secondes. Centrifuger à environ 200 fois G pendant 10 minutes à température ambiante, deux couches distinctes sont visibles Après la centrifugation, aspirer soigneusement 2,5 millilitres de la couche supérieure de MTBE sans pipeter la couche aqueuse en dessous et transférer dans une culture en verre propre. Deux. Ajoutez trois millilitres de MTBE à la partie aqueuse restante de chaque échantillon.

Et vortex 10 secondes par tube centrifugeuse à environ 200 fois G pendant 10 minutes. À température ambiante, aspirez trois millilitres de MTBE sans obtenir d’eau et combinez-le avec le tube de MTBE précédent. Cette fraction de MTBE subira une extraction en phase solide plus tard.

Concentrer la couche aqueuse restante par séchage sous azote. Remettez le résidu en suspension dans 100 microlitres d’un et ajoutez 400 microlitres de méthanol glacé à chaque vortex de tube, puis transférez-le dans un micro-tube de centrifugation. Laisser à moins 80 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes pour permettre aux protéines restantes de précipiter dans le méthanol.

Ensuite, centrifugez à zéro degré Celsius pendant 15 minutes à 18 000 fois G, il doit y avoir un précipité sur le côté du tube après la centrifugation, aspirez 450 microlitres de surnageant sans aspirer le précipité et transférez-le dans un micro-tube de centrifugation propre. Sécher complètement dans un concentrateur centrifuge sous vide à une température ne dépassant pas 45 degrés Celsius pendant environ une à deux heures. Remettre en suspension le surnageant séché dans 200 microlitres d’eau acétylnitrile à 5 % et vortex.

Transférez brièvement les échantillons dans des autos, un échantillonneur, des flacons et congelez-les à moins 80 degrés Celsius. Pour commencer la procédure d’extraction en phase solide, sécher la fraction de MTBE obtenue précédemment sous un bon écoulement d’azote à 35 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Lorsque les fractions de MTBE sont complètement sèches, arrêtez l’écoulement de l’azote et remettez rapidement en suspension chaque échantillon dans un millilitre de chloroforme à l’aide d’une pipette vortex en verre.

Lavez brièvement et conditionnez deux fois la cartouche d’extraction en phase solide ou SPE avec 400 microlitres d’hexane. Jetez les déchets et remplacez-les par un nouveau tube de collecte en verre. Ajoutez l’échantillon à la colonne SPE, appliquez le vide et collectez le flux.

À l’aide d’une pipette en verre, ajoutez un millilitre d’alcool isopropylique chloroforme à deux pour un dans la colonne SPE et recueillez le flux dans les mêmes tubes en verre. Il s’agit de la fraction neutre. Faites sécher la fraction neutre sous azote pendant 10 à 15 minutes.

Pour minimiser l’oxydation à l’aide d’une pipette en verre, ajoutez un millilitre d’acide acétique à 5 % dans de l’éther éthylique dans la colonne SPE et recueillez le flux. Il s’agit de la fraction des acides gras. Séchez la fraction d’acides gras sous azote pendant 10 à 15 minutes pour minimiser l’oxydation à l’aide d’embouts en plastique.

Ajoutez 800 microlitres de méthanol dans la cartouche SPE et collectez le flux à travers Dans des tubes coniques en plastique de 15 millilitres, c’est la fraction phospholipidique. Transférez la fraction phospholipidique dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre, séchez les échantillons avec un concentrateur centrifuge sous vide à 45 degrés Celsius pendant environ une à 1,5 heure. Enfin, suspendez chacun des échantillons des trois fractions dans 200 microlitres de transfert de méthanol à 100 % vers les voitures, l’échantillonneur, les flacons, et stockez-les dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius.

L’efficacité de la méthode M-T-B-E-S-P-E dans l’extraction des étalons lipidiques et des métabolites endogènes est démontrée dans l’ensemble, une meilleure extraction et une meilleure couverture des métabolites ont été obtenues par rapport à d’autres méthodes telles que l’extraction au méthanol ou l’extraction au MTBE uniquement lorsque le nombre de caractéristiques a été comparé à l’aide d’un logiciel qualitatif et quantitatif. Après l’analyse lc MS, la comparaison des fractions M-T-B-E-S-P-E a montré un chevauchement minimal entre les trois fractions après SPE, ce qui démontre l’efficacité de la séparation des métabolites hydrophobes dans leurs classes chimiques respectives pour une identification plus fiable des métabolites. De plus, la récupération des étalons internes en fractions à l’aide de la méthode M-T-B-E-S-P-E, NR 12 A DÉMONTRÉ QUE LES ÉTALONS INTERNES ÉTAIENT MENTIONNÉS DANS LA FRACTION LIÉE À LEUR CLASSE CHIMIQUE.

Pour évaluer la reproductibilité chromatographique des données, la préparation de l’échantillon a été effectuée sur trois échantillons de plasma de CQ distincts, et chaque échantillon a été injecté en trois exemplaires sur l’instrument LCM MSS. Le chevauchement constant démontre la reproductibilité de l’instrument et de la préparation des échantillons. L’augmentation du bruit chimique observée pour le mode d’ionisation négative de la fraction d’acides gras peut être due à des contaminants dans les solvants LCM S.

Par conséquent, seuls les métabolites auxquels il était fait allusion avant neuf minutes ont été analysés. N’oubliez pas que travailler avec du chloroforme, du MTBE, de l’éther éthylique et même les réactifs les plus courants utilisés dans cette méthode peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’une blouse de laboratoire, de gants et d’une protection oculaire et la préparation des échantillons dans une hotte doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.