Détection in situ de autoréactifs T CD4 des cellules dans le cerveau et le cœur à l'aide majeur d'histocompatibilité Dextramers classe II

L'objectif général de cette procédure est de détecter les lymphocytes T autoréactifs avec un haut degré de spécificité à l'aide de multimères Dextramère de classe II du CMH. Dans cette vidéo, les cellules cérébrales sont prélevées à partir du cerveau d'une souris atteinte d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale induite par la protéine protéolipidique de la myéline. Cette étape est réalisée en prélevant d'abord soigneusement les tissus et en préparant les blocs d'AROS.

La deuxième étape consiste à découper le tissu inclus en aros en sections de 200 micromètres d'épaisseur à l'aide d'un viome. Les sections sont ensuite transférées dans des chambres à tissus placées dans une plaque de 24 puits, où elles sont colorées et fixées. L'étape finale consiste à monter les sections de tissu sur des lames de microscope.

En fin de compte, la microscopie confocale est utilisée pour montrer les cellules liées aux trimères de dextramère et à l'anticorps CD quatre. Nous avons conçu cette idée pour la première fois lorsque nous avons démontré que les récepteurs de dextramère de classe MHC deux étaient plus sensibles que les tétramères conventionnels de classe MHC deux pour la détection des cellules T CD quatre autoréactives spécifiques de l'antigène. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la section de tissus frais et leur manipulation sont assez délicates.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de sectionnement, de montage et d'analyse sont difficiles à apprendre en raison de leur délicatesse. En plus de Ting, deux chercheurs postdoctoraux, Chandy et Aaron de mon équipe, ainsi que Christian du laboratoire du Dr. Zoe, démontreront cette procédure. Après l'euthanasie de souris atteintes d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale, ou EAE, extraire le crâne en découpant le crâne de manière circulaire à l’aide de ciseaux courbes, puis retourner soigneusement les os du crâne avec une pince. Prélever le cerveau par dissection émoussée à l’aide d’un scalpel propre.

Séparez le rerum du cervelet. Placez le rerum dans un tube contenant du PBS (solution saline tamponnée au phosphate 1 x) froid et laissez le tube sur de la glace jusqu'au traitement. Placez le rerum dans une cassette histologique jetable à base profonde maintenue sur de la glace.

Versez ensuite de l'agarose fondue à 4 % PBS tamponné à bas point de fusion dans la cassette. Appuyez immédiatement délicatement sur le cerveau avec une pince pour immerger le tissu et laissez la cassette sur de la glace jusqu'à ce que la solidification soit complète. Une fois solidifié, retirez l'agarose excédentaire sur tous les côtés du tissu inclus et exposez légèrement la surface ventrale du cerveau.

Ensuite, appliquer de la colle super glue sur le bloc de tissu Vibram et transférer le tissu inclus contenant les aros sur la surface collée en plaçant la face ventrale exposée du cerveau sur la colle pour une section transversale. Ne pas déplacer le tissu une fois qu'il est positionné sur le bloc. Placer le bloc du vibrotranche contenant le tissu inclus sur de la glace et laisser sécher la colle pendant 15 minutes.

Entre-temps, placer les chambres de tissu préparées dans une plaque de 24 puits, une chambre par puits. Remplir les puits contenant les chambres de tissu avec un millilitre de PBS 1X froid et laisser la plaque sur de la glace. Une fois la colle sèche, abaisser la lame du vibromoteur au niveau de la surface supérieure du tissu.

Régler la vitesse du vibram à 0,22 millimètre par seconde et commencer la sectionnement avec un mouvement vers l'avant afin d'obtenir des sections de 200 micromètres d'épaisseur. À l'aide d'un pinceau souple pour aquarelle, transférer une section cérébrale dans chaque chambre tissulaire. Dans la plaque à 24 puits, maintenir la plaque sur de la glace jusqu'à la fin du sectionnement afin d'éviter la dégradation du tissu.

Ensuite, préparez une seconde plaque à 24 puits en ajoutant 300 microlitres d'un cocktail contenant l'IA de la protéine protéolipidique de la myéline S 1-39 à 1-51 dextro et l'anticorps CD4 à trois des puits. Puis ajoutez 300 microlitres du cocktail témoin d'IA du virus de l'encéphalomyélite murine de Tyler 70-86 dextro et de l'anticorps CD4 à un autre ensemble de trois puits. Procédez ensuite à l'étiquetage des puits.

Ensuite, transférez trois chambres à tissus contenant les sections destinées à la coloration avec des dextranases spécifiques dans les trois puits désignés de la plaque 24 puits, en plaçant une chambre par puits. De même, transférez les trois chambres à tissus contenant les sections destinées à la coloration avec des dextranases contrôlées dans ces puits. Placez une chambre par puits, puis couvrez les puits avec un couvercle.

Enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium et placez-la sur une plateforme oscillante réglée sur une rotation douce, pendant 1,5 heure, à l’abri de la lumière et à température ambiante. Après la période d’incubation, lavez les sections de tissu en les transférant dans un nouveau puits contenant un millilitre de solution de lavage PBS 1X froide pendant au moins 10 minutes sur la plateforme oscillante. Répétez le lavage trois fois.

Veillez à ce que les sections de tissu ne s'assèchent pas, car elles pourraient adhérer aux parois de la chambre. Fixez les sections en transférant les chambres de tissu dans un nouveau puits. De la plaque à 24 puits contenant un millilitre de paraformaldéhyde tamponné au PBS 4 % filtré, incubez pendant deux heures sur une plateforme agitée avec des rotations douces.

Après avoir lavé les sections trois fois supplémentaires, placez les sections colorées et fixées sur une lame de microscope propre. À l’aide d’un pinceau doux pour aquarelle, essuyez l’excès d’eau sans toucher la section, puis montez la section à l’aide d’un milieu de montage. Recouvrez d’une lamelle de microscope et laissez sécher les lames à température ambiante toute la nuit.

Dans la chambre noire, utilisez un microscope confocal Nikon A one Eclipse 90 I pour l'analyse de routine et l'acquisition d'images. Pour commencer, ouvrez le logiciel NIS elements AR, puis sélectionnez les canaux tétraéthyl, rumine, isothiocyanate ou trit C et cyan cinq ou SCI cinq dans le panneau. Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission pour les canaux Trit C et SCI cinq apparaissent par défaut.

Attribuez la couleur pseudo-verte au canal Trit Sea et la couleur rouge au canal SCI cinq. Placez la lame à examiner sur la platine du microscope et faites la mise au point manuellement avec un grossissement de 100 fois. Réglez la tension d'entrée (HV) à 110 et l'offset à zéro, puis cliquez sur mise au point et ajustez la tension.

Pour optimiser les lasers, cliquez sur la fonction de balayage par focalisation et balayez la section de haut en bas afin de régler le niveau Z pour l'acquisition d'image. Ensuite, cliquez sur Série de canaux et acquérez l'image de manière séquentielle. Identifiez les cellules T dextro ou positives pour CD4 apparaissant comme des cellules ponctuées jaunes en fonction de la colocalisation des signaux provenant des canaux rouge et vert.

Utilisez un microscope confocal Olympus FV 500 BX 60 pour effectuer facilement le dénombrement quantitatif des cellules T dextro ou positives pour le CD4. Pour commencer, ouvrez le logiciel flu ovu. Sélectionnez les colorants S SI trois et SCI cinq dans le menu déroulant, puis cliquez sur appliquer pour charger les lasers respectifs.

Placer la lame à examiner sur la platine du microscope et la focaliser manuellement en faible grossissement en cliquant sur « focus » pendant que le laser SI trois est allumé, puis focaliser le foyer inflammatoire. Changer l'objectif pour un grossissement de 100 fois. Régler la taille du fichier sur cinq 12 sur cinq 12 dans le menu déroulant, cliquer sur « focus » et ajuster les valeurs de gain et de décalage du PMT afin d'optimiser séparément le laser pour S SI trois et sci cinq, cliquer sur « Z stage », puis cliquer sur « focus » pendant que les deux lasers sont allumés.

Réglez l'épaisseur de la platine Z en cliquant sur les flèches vers le haut et vers le bas. Réglez l'intervalle Z à deux micromètres. Cliquez sur arrêter et choisir.

Recherchez 1, 2, 3. Cliquez ensuite sur X, y, Z et commencez l'acquisition d'images en série Z pour la zone sélectionnée dans le foyer inflammatoire ; enregistrez les images en série Z sous forme de fichiers VI. Pour enregistrer les fichiers d'image, sélectionnez l'image parmi la série d'images Z, puis enregistrez-la au format TIFF.

Enregistrez toujours les images TIFF multipages. Premièrement, pour protéger les données, l'étape suivante consiste à examiner trois sections appariées qui ont été colorées avec les deux jeux de ciseaux à dex. Commencez par acquérir les images en série Z en numérisant les lames selon un mouvement horizontal vertical vers le haut, puis horizontal vertical vers le bas, de manière à éviter la répétition de séries Z dans le même plan de mise au point.

Une fois les images en série Z acquises, nommez les fichiers en identifiant les numéros des lames, le nom des sections et le nombre d'images en série Z prises. Utilisez le logiciel ImageJ pour compter les cellules T CD4 positives et dextro-positives par rapport au nombre total de cellules T CD4 positives. Sélectionnez le type de compteur dans ImageJ, cochez « Afficher tout » et commencez le comptage en cliquant au centre de chaque cellule, puis poursuivez le comptage sur différentes images en série Z à l’aide des flèches latérales.

Après avoir dénombré toutes les cellules T CD4, choisissez un autre type de compteur et dénombrez les cellules T CD4 positives et dextro-positives. Cliquez sur l'onglet Résultats pour obtenir le nombre total de cellules comptées à l’aide des deux compteurs différents. La détection des cellules T CD4 spécifiques de la protéine protéolipidique de la myéline ou PLP a été réalisée à l’aide de coupes cérébrales fraîchement préparées provenant de souris EAE, teintes avec des mélanges contenant des dextres anti-CD4 et PLP 139 à 151 ou des dextres témoins TMEV 70 à 86, puis observées par microscopie à balayage laser (LSCM).

L'analyse de coupes cérébrales doublement marquées montre des cellules positives pour les dimères PLP 1 39 à 1 51 marqués en rouge et des cellules positives pour l'anticorps CD quatre en vert, tandis que les cellules doublement positives apparaissent en jaune. Les cellules doublement marquées présentaient des points ponctués autour de la périphérie. Une telle caractéristique était absente dans les sections marquées avec le TMEV 70 à 86 utilisé comme témoin.

La détection des cellules T CD4 spécifiques de la myosine cardiaque à l’aide de détecteurs Dex par coloration in situ avec la chaîne lourde alpha de la myosine cardiaque, MYHC 334-352 Dextramère, a également été réalisée. L’analyse de ces images par microscopie à balayage laser (LSCM) a révélé la présence de cellules positives pour les Dextramères MYHC 334-352 en rouge, de cellules positives pour CD4 en vert, et de cellules marquées à la fois par le Dextramère et CD4 apparaissant comme des cellules ponctuées jaunes. La coloration de fond observée avec les Dextramères contrôle ARN 43-56 était négligeable. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ huit à dix heures, contre trois jours avec les autres protocoles publiés, à condition d’être exécutée correctement.

Lors de l'utilisation de ce protocole, il est important de se rappeler de préparer les réactifs à l'avance et de suivre les étapes de manière systématique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de sectionner et de colorer les tissus afin de dénombrer les cellules T CD4 réactives à la protéine C-réactive dans les tissus cibles.