Éléments techniques fondamentales de cryofracture / Gel-gravure dans biologique Electron Microscopy

L'objectif de l'expérience suivante est de produire un spécimen en carbone platine, sous forme de réplique, de matériaux biologiques ou autres, destiné à être examiné par microscopie électronique en transmission. Pour y parvenir, les échantillons préparés sous forme de répliques simples et doubles sont soumis à des taux de congélation ultrarapides afin de limiter la formation de cristaux de glace. Ensuite, l'échantillon congelé est fracturé par manipulation à distance à des températures cryogéniques, proches de celle de l'azote liquide, sous vide élevé, ce qui scinde la membrane au niveau de la bicouche lipidique, produisant une face extracellulaire et une face adjacente à l'aspect cytoplasmique.

Étape facultative supplémentaire. Les caractéristiques sous-jacentes peuvent être révélées lorsque l'eau est gravée à partir de la surface de l'échantillon fracturé en positionnant le bras du microtome réfrigérant au-dessus du plateau de l'échantillon afin de créer un gradient de température, ce qui provoque la sublimation de l'eau à partir de la surface. Ensuite, une réplique est générée par évaporation de carbone et de platine sur la surface fracturée.

L'échantillon d'origine est digéré à partir du duplicata, qui est récupéré sur une grille destinée à la microscopie électronique en transmission. Finalement, la fracture congélation-décorticage congélation est utilisée pour révéler les détails structuraux tridimensionnels des membranes cellulaires, des réseaux moléculaires et des nanomatériaux lors de l'examen en microscopie électronique en transmission. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'examen de sections ultrafines, est que les objets d'intérêt peuvent être observés en trois dimensions avec une résolution microscopique électronique.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie cellulaire et moléculaire ainsi que de la nanotechnologie, telles que les caractéristiques dimensionnelles et structurales des membranes cellulaires et l'organisation des réseaux moléculaires et de nanomatériaux. J'ai eu l'idée de cette méthode lorsque j'ai réalisé que des études similaires avaient déjà été menées sur des protistes eucaryotes, conduisant à des découvertes importantes, mais qu'un intérêt limité avait été porté à des thèmes connexes en santé humaine. Commencez cette procédure par la préparation des échantillons biologiques pour la fracture et le clivage par congélation, comme décrit dans le protocole écrit.

Sélectionnez des supports d'échantillons en or ou en cuivre de taille et de forme appropriées pour l'échantillon en cours de traitement, à l'aide de pinces de qualité fine et/ou d'aiguilles de seringue de petit calibre. Placez de petits fragments de l'échantillon sur le dessus d'un support métallique. Réduisez la teneur en liquide de l'échantillon à une consistance collante, légèrement semblable à de la colle, en aspirant le liquide sur le bord du support à l'aide de papier filtre pour les répliques simples.

Utilisez des aiguilles de seringue de petit calibre pour créer un monticule de tissu sur le support destiné aux doubles répliques. Retournez un autre support, positionnez-le exactement au-dessus du premier et déposez-le délicatement sur la surface de l'échantillon, formant ainsi un sandwich.

Ne pas appuyer sur l'échantillon pour le faire sortir entre les deux supports. Ensuite, remplir deux récipients doubles isolés avec de l'azote liquide. Le premier récipient accueille un support métallique contenant un petit puits, utilisé pour liquéfier un petit volume de gaz de propane provenant d'une bouteille commercialement disponible.

Le deuxième récipient est un récipient de stockage compartimenté destiné à conserver brièvement des échantillons congelés sous azote liquide. Utiliser le propane uniquement dans une hotte chimique certifiée à cet usage. Prendre soin d'éviter toute source d'ignition accessoire, de porter des vêtements protecteurs contre les basses températures et d'assurer une ventilation adéquate, car le propane est explosif.

Peut provoquer des lésions par congélation au contact et est un agent asphyxiant. En utilisant la buse du cylindre positionnée dans le propane, ouvrez bien la vanne du cylindre et laissez le gaz s'écouler dans le puits du premier récipient, où il se liquéfiera aussi rapidement que possible. Saisissez le porte-échantillon avec des pinces fines et plongez-le dans le gaz liquéfié du premier récipient pendant plusieurs secondes.

Ensuite, transférez rapidement vers le deuxième récipient contenant de l'azote liquide. Une fois que les échantillons sont congelés, conservez-les dans l'azote liquide jusqu'au moment de leur transfert vers l'appareil de fracture par congélation. Chargez les supports en or pour échantillons dans un porte-échantillons double pour répliques de type classeur ou un dispositif de serrage sous azote liquide, et maintenez-les ainsi jusqu'au moment de les positionner dans la chambre à échantillons.

Lorsque la chambre a atteint un haut vide et que le plateau a atteint la température de l'azote liquide, arrêtez la pompe, ouvrez la chambre et placez rapidement les porte-échantillons montés sur la table d'échantillonnage. Ensuite, remettez en marche la pompe pour rétablir le haut vide et utilisez les commandes électroniques de température du plateau et du bras pour régler la température de la table d'échantillonnage à moins 100 degrés Celsius. Dirigez également de l'azote liquide vers le bras du microtome afin de le porter à la température de l'azote liquide.

Une fois le vide élevé atteint, réglez la température de la chambre sur moins 100 degrés Celsius et, à l’aide du bras du microtome refroidi à la température de l’azote liquide, ouvrez à distance le porte-échantillon à double réplique, ce qui provoque la fracture des échantillons sur leurs supports. En option, comme étape supplémentaire, les échantillons peuvent être gravés afin de révéler les structures sous-jacentes après fracture. Pour réaliser le gravage, utilisez une lame de rasoir maintenue dans une pince fixée au bras du microtome afin de raser la surface des échantillons. Placez ensuite le bras froid du microtome au-dessus des surfaces fracturées pendant une à plusieurs minutes afin de sublimer l’eau, ce qui permet de révéler les véritables surfaces cellulaires, la matrice extracellulaire et/ou les assemblages moléculaires.

Ensuite, activez le canon à électrons ou à résistance de platine-carbone et laissez-le déposer une fine couche de platine-carbone sur la surface fracturée selon un angle compris entre 30 et 45 degrés. Cette étape nécessite généralement environ 15 à 20 secondes. Activez ensuite le canon à électrons ou à résistance de carbone de la même manière et faites évaporer une fine couche de carbone sur la surface fracturée de l'échantillon directement par-dessus, à 90 degrés, afin de renforcer la réplique. Cela nécessite également généralement environ 15 à 20 secondes, une fois la réplication, l'ombrage et la stabilisation au carbone terminés.

Éteignez la pompe à vide et la chambre, puis retirez le porte-échantillon de l'appareil. À l'aide d'une pince fine, retirez chaque porte-échantillon en or du serre-lame double et laissez-le dégeler pendant plusieurs secondes avant de poser délicatement le porte-échantillon à la surface de l'eau dans une plaque de culture. Manipulez les répliques à l'aide d'une boucle en fil fin ou d'une grille en cuivre conventionnelle pour microscope électronique tenue par une pince fine, puis transférez-les vers une autre plaque de culture contenant du dichromate de sodium à 5 % dans de l'acide sulfurique à 50 % pendant une à plusieurs heures. Ce bain digère le matériau biologique réel à partir de la réplique.

Lorsque la digestion est terminée, transférez la réplique sur une surface d'eau propre et récupérez-la sur une grille standard en cuivre destinée à la microscopie électronique. Conservez les grilles porteuses de répliques dans des boîtes à grilles commerciales, où elles resteront stables pendant des années. Avec une manipulation délicate ou pour l'examen ultra-structural par fracture cryogénique, observez les répliques gravées au microscope électronique en transmission à une tension d'accélération, généralement comprise entre 50 et 80 kilovolts.

Enregistrez les images pertinentes sur un film standard de MET ou à l’aide d’une caméra numérique haute résolution située dans la membrane cellulaire à la base de chaque cil et flagelle eucaryote. Le cil et le flagelle possèdent un réseau de particules associées à la membrane, organisées en brins ENC formant une couronne autour de l’axe du cil, appelée collier ciliaire. Des réseaux spécialisés de particules membranaires apparaissent au niveau de la bordure luminaire des cellules épithéliales en cours de ciliogenèse.

Ces réseaux de particules représentent des colliers ciliaires naissants, situés à la base des cils émergents et matures. Diverses études en fracture par congélation d'épithéliums révèlent une organisation complexe de structures anastomosées en sillons et en cordons qui entourent la région apicale des limites basolatérales. La fracture des membranes des cellules épithéliales met en évidence les faces de fracture plasmiques des jonctions serrées, qui apparaissent sous forme de cordons, tandis que les faces de fracture extracellulaires présentent des sillons complémentaires.

Les jonctions gap apparaissent dans les préparations par fracture à froid d'une variété de tissus et sont représentées par des réseaux denses de particules sur les faces de fracture plasmiques et des fossettes complémentaires sur la fracture extracellulaire. Les faces illustrées ici constituent un exemple de congélation rapide suivie d'une profonde corrosion et d'une ombre latérale tournante. La cellule épithéliale a été fracturée à travers le cytoplasme et une face de fracture plasmique est visible derrière les têtes de flèches.

Une surface cellulaire réelle révélée par une gravure ultérieure une fois maîtrisée. Cette technique peut être réalisée en un cycle d'une durée d'environ trois heures, produisant un à trois échantillons si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les différentes étapes sont fortement interdépendantes et qu'une erreur à une étape peut rendre le résultat inadéquat pour l'examen et l'évaluation après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire et moléculaire pour explorer comment les mutations génétiques confèrent des anomalies structurelles aux cellules, de manière à provoquer des conditions pathologiques et des maladies.