Name: Collecte et dextraction de lADN de la salive pour le séquençage de prochaine génération (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Apprenez à extraire de l'ADN génomique de haute qualité à partir de salive entière pour la génomique. Cette méthode non invasive utilise une lyse cellulaire optimisée et une purification rigoureuse pour le séquençage de nouvelle génération.

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Ce travail a été financé par un R01 des National Institutes of Health (DC009453 soutien à CWB).

REMARQUE: Avant de fournir des échantillons de salive tous les sujets ont donné leur autorisation conforme aux lignes directrices pour le traitement de sujets humains à l&#39;Hôpital pour enfants de Nationwide informé. 1 prélèvement de salive et de stockage <ol><li> Avant la collecte de salive, veiller à ce que la bouche du sujet est libre de nourriture ou d&#39;autres substances étrangères en ayant l&#39;objet rincer la bouche avec de l&#39;eau et d&#39;éviter de manger ou de boire pendant 30 min avant de prélever l&#39;échantillon. </li><li> Ouvrez un tube de centrifugeuse de 15 ml avec 2,5 ml d&#39;ADN stabilisation tampon 2 en veillant à ne pas toucher l&#39;intérieur de la capsule ou le tube, et ont fait l&#39;objet cracher 2,5 ml de salive dans la solution tampon. Remarque: La collecte de plus de 2,5 ml de salive peut conduire à une dégradation de l&#39;échantillon à partir d&#39;un rapport insuffisante de l&#39;échantillon de tampon de stabilisation de l&#39;ADN. Collecte trop peu de salive va réduire les rendements attendus du protocole. Pour évaluer les volumes de collecte, utilisez les gradients numérotés sur le côté du til tube. </li><li> Remettre le bouchon et mélanger par inversion jusqu&#39;à ce que le mélange est homogénéisé. Une agitation vigoureuse n&#39;est pas nécessaire. Conserver les échantillons à température ambiante pour le stockage à court terme ou à 4 ° C pour le stockage à long terme (&gt; 3 mois). </li></ol> 2. Préparations initiales et de lyse cellulaire <ol><li> Avant de commencer l&#39;extraction, faire chauffer un bain d&#39;eau à 37 ° C, et de préparer un seau à glace. Trois 15 ml tubes de centrifugation coniques seront nécessaires pour chaque échantillon extrait. Les trois tubes sont utilisés pour maintenir les cellules et les protéines culot, le dernier extrait d&#39;ADNg, et les surnageants d&#39;isopropanol et d&#39;éthanol. </li><li> Récupérer des échantillons de stockage, et des échantillons inverses plusieurs fois alors vortex à vitesse moyenne pendant 15 sec. </li><li> Distribuer 2,5 ml d&#39;échantillon dans un tube de 15 ml à centrifuger propre, et ajouter 5 ml de solution de lyse cellulaire. Mélanger l&#39;échantillon 50 fois par inversion, et incuber à température ambiante pendant 30 min. </li></ol> 3. ARN enlèvement <ol><li> Ajouter 40 ul de RNase A Solution à 100 mg / ml, et incuber à 37 ° C pendant 15 min. </li><li> Retirer l&#39;échantillon du bain-marie à 37 ° et refroidir sur glace pendant 3 min. <ol><li> Après l&#39;incubation de la RNase A, d&#39;augmenter la température du bain d&#39;eau à 65 ° C pour l&#39;étape de réhydratation de l&#39;ADN du protocole. </li></ol></li></ol> 4. protéines et lipides enlèvement <ol><li> Ajouter 50 l de protéinase K Solution à 20 mg / ml, mélanger à plusieurs reprises par inversion, et incuber à température ambiante pendant un minimum de 30 minutes. Note: Ceci est un point de pause possible pour le protocole. Après l&#39;addition de la solution de protéinase K, l&#39;échantillon peut être stocké à 4 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;extraction peut être réalisée. Stockage à 4 ° C pendant 24 heures n&#39;a pas été montré pour avoir un effet significatif sur les rendements d&#39;extraction ou de la qualité de l&#39;ADN. Stockage à long terme, à ce stade n&#39;a pas été évaluée. </li><li> Ajouter 1,7 ml de solution de précipitation des protéines, vortex vigoureusement pendant 20 secondes à grande vitesse, et le placer sur la glace pendant 10 min. </li&gt; <li> Une fois les échantillons sont refroidis sur la glace pendant 10 min, centrifuger pendant 10 min à 3000 xg et 4 ° C. Les protéines précipitées doivent former un culot serré pour continuer. Si la pastille n&#39;est pas étanche ou la solution est encore trouble, les échantillons peuvent être refroidis sur la glace pendant 5 min et centrifugation plus répétées. Les échantillons doivent être conservés dans la glace pour assurer une pastille serré. </li></ol> 5 Isolement et purification de l&#39;ADNg <ol><li> 15 ml dans un tube à centrifuger propre, la pipette 5 ml d&#39;isopropanol et 8 pi de solution de glycogène pur à 20 mg / ml. </li><li> Verser le surnageant contenant l&#39;ADNg de l&#39;étape 4.3 dans le tube contenant la solution de glycogène et de l&#39;isopropanol, en laissant le culot de protéine précipitée. Une fois le surnageant a été ajouté, mélanger délicatement l&#39;échantillon 50 fois par inversion et centrifuger pendant 30 min à 3000 xg et 4 ° C. </li><li> Verser le surnageant dans un tube lentement de 15 ml propre. Après élimination du surnageant, ajouter 1 ml d&#39;éthanol à 70%laver le culot en basculant lentement et se déplaçant doucement de l&#39;éthanol sur le culot précipité plusieurs fois. Conserver la éthanol dans le tube. </li><li> Après le lavage initial, centrifuger l&#39;échantillon pendant 1 min à 2000 xg et 20 ° C. Cette étape de centrifugation peut être effectuée à 4 ° C ou 20 ° C. Aucun effet significatif de la température a été montré pour cette étape. </li><li> Après le lavage et la centrifugation initiale de la pastille, verser lentement le lavage à l&#39;éthanol à partir du tube et le jeter, puis effectuer un deuxième lavage en répétant les étapes 5.3 et 5.4. </li><li> Après l&#39;élimination du surnageant à partir de la deuxième lavage, le culot de permettre à l&#39;air sec pendant 15 minutes. <ol><li> Si l&#39;échantillon n&#39;est pas complètement séché, séché à l&#39;air pendant 15 min. </li></ol></li></ol> 6. réhydratation des ADNg <ol><li> Une fois que l&#39;échantillon est sec, ajouter 300 pi de Tris-EDTA pour réhydrater le culot séché ADNg. </li><li> Vortex de l&#39;échantillon pendant 5 secondes à la vitesse moyenne et le placer dans un65 ° C bain d&#39;eau chaude pendant 1 heure. </li><li> Retirer les échantillons du bain d&#39;eau et incuber O / N à la température ambiante. REMARQUE: Tous les produits et les réactifs utilisés sont listés dans le Tableau des matériaux, ainsi que le tableau 4. </li></ol>

<ol><li>Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saliva+as+a+source+of+human+DNA+for+population+and+association+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies.</a> Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).</li>
<li>Min, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mircosatellite+and+SNP+genotyping+success+rates+established+in+a+large+number+of+genomic+DNA+samples+extracted+from+mouth+swabs+and+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Twin+Research+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes.</a> Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).</li>
<li>Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+rates+and+fear+of+phlebotomy+in+pediatric+patients+in+a+genetic+study+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy.</a> Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).</li>
<li>Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+saliva+by+mail+for+genetic+and+cotinine+analyses+in+participants+recruited+through+the+internet%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet.</a> European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).</li>
<li>Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+blood%2C+saliva%2C+and+buccal+cell+samples+in+a+pilot+study+on+the+danish+nurse+cohort%3A+Comparison+of+the+response+rate+and+quality+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).</li>
<li>Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva%3A+A+convenient+source+of+DNA+for+analysis+of+bi-allelic+polymorphisms+of+fc%CE%B3+receptor+iia+%28cd32%29+and+fc%CE%B3+receptor+iiib+%28cd16%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16).</a> Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).</li>
<li>Dawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates%2C+from+salivary+analyses%2C+of+the+turnover+time+of+oral+mucosal+epithelium+in+humans+and+the+number+of+bacteria+in+an+edentulous+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth.</a> Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).</li>
<li>Bahlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva-derived+DNA+performs+well+in+large-scale%2C+high-density+single-nucleotide+polymorphism+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+performance+between+saliva+and+blood-derived+genomic+dnas+on+the+dmet+array%3A+A+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison.</a> PLoS ONE. 7 (3), e33968(2012).</li>
<li>Simmons, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+genotype-phenotype+model+determinism%3A+Application+to+bivariate+reading%2Flanguage+traits+and+epistatic+interactions+in+language-impaired+families%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Heredity%22%5BJournal%5D)">Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families.</a> Human Heredity. 70, 232-244 (2010).</li>
<li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+precipitation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">Ethanol precipitation of DNA.</a> Focus. 7, 1-2 (1985).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+Transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>DePristo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+variation+discovery+and+genotyping+using+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.</a> Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La présente procédure est un protocole d&#39;extraction de l&#39;ADN optimisé qui a considérablement amélioré le rendement de l&#39;ADN de poids moléculaire élevé par rapport à des procédés classiques, sans compromettre la qualité de l&#39;ADN. L&#39;étape critique avec le plus grand effet sur ​​le rendement le plus, c&#39;est l&#39;étape 5.2, qui comprend une étape de centrifugation plus longue au cours de précipitation à l&#39;éthanol que n&#39;importe quel protocole publié examiné ici, sauf une qui n&#39;a pas été la...

L&#39;obtention de l&#39;ADN de haute qualité pour des études génétiques humaines est essentielle dans le processus de découverte de gènes de maladies. Le sang, bien que nécessitant une intervention invasive et étant également plus cher que le prélèvement de salive, est favorisée par la création de lignées de cellules immortalisées comme une source inépuisable de l&#39;ADN, ou iPSCs pour des études fonctionnelles, et parfois de l&#39;ADN sanguin est utilisé lorsque des lignées cellulaires ne sont pas disponibles. Toutefois, l&#39;obtention de sang exige un préleveur qualifié et le sang a une demi-vie plus courte que la salive 1. ADN de la salive est moins cher et plus facile à obtenir, car il peut être collecté et envoyé par la poste, sans la nécessité d&#39;un préleveur, augmentant ainsi gisements potentiels de sujets bien au-delà de la zone de chalandise des hôpitaux et des laboratoires 2. inscription de l&#39;étude peut être améliorée lorsque les sujets ont la possibilité de donner un échantillon de salive au lieu de sang 3, 4. préoccupations au sujet de la quantité et de la qualité de l&#39;ADN de la salive peuvent avoir limité sa nous généraliséee en dépit de nombreuses études récentes études ont montré la pertinence de la salive totale, avec une moyenne de 4,3 x 10 5 cellules par millilitre, pour des tests ADN sur les prélèvements dans la bouche des méthodes plus anciennes qui n&#39;ont pas obtenu d&#39;importantes quantités de salive 2, 3, 4, 5, 6. Bien que la littérature existe modeste montrant la pertinence d&#39;ADN dérivé de la salive totale pour les applications de génotypage y compris les méthodes à base de microréseaux 8, 9, le séquençage de prochaine génération 10, aucune étude n&#39;a examiné (NGS). L&#39;objectif pour l&#39;optimisation de l&#39;ensemble de ce protocole d&#39;extraction d&#39;ADN de la salive était de maximiser la quantité et de la qualité pour les applications de la génétique d&#39;une manière rentable qui est facilement mis en œuvre dans les laboratoires avec des réactifs et consommables communs. l&#39;extraction d&#39;ADN à partir de la salive nécessite plusieurs interventions: 1) la collecte et le stockage, 2) la lyse des cellules, 3) un traitement à la RNase, 4) la précipitation des protéines, 5) précipitation par l&#39;éthanol, 6) l&#39;ADN de la réhydratation. La solution de stabilisation tampon ADN, décrit2 précédemment, sans modification des fonctions de manière adéquate. Aucune tentative pour optimiser le traitement de la RNase et les étapes de réhydratation de l&#39;ADN a été effectué. Pour chaque étape restante, plusieurs variables qui pourraient affecter les rendements ont été identifiés. Chaque variable a été manipulée individuellement et l&#39;amélioration du rendement et de la qualité a été évaluée statistiquement. Pour les variables qui ont été montrées pour améliorer le rendement et / ou la qualité de l&#39;ADN, les valeurs optimales ont été inclus dans le protocole final.

<table><tbody><tr><td>15 ml Tubes à centrifuger</td><td>Fisher</td><td>12-565-268</td><td></td></tr><tr><td>Solution de lyse cellulaire</td><td>Qiagen</td><td>158908</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Solution de précipitation de protéines</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>EZ-BioResearch</td><td>S1003</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol à 70 %</td><td>Fisher</td><td>04-355-305</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td>Fisher</td><td>BP2473-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>AC194090010</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 m) Solution</td><td>Fisher</td><td>03-500-506</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Fisher</td><td>BP166-100&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur Vortex Analogique</td><td>Fisher</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td></td></tr></tbody></table>

collecte et d&#39;extraction de l&#39;adn de la salive pour le séquençage de prochaine génération

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

La source d’ADN préférée dans la recherche en génétique humaine est le sang, ou les lignées cellulaires dérivées du sang, car ces sources produisent de grandes quantités d’ADN de haute qualité. Cependant, l’extraction d’ADN à partir de salive peut produire un ADN de haute qualité avec peu ou pas de dégradation/fragmentation qui convient à une variété de tests d’ADN sans les frais d’un phlébotomiste et peut même être acquis par la poste. Cependant, à l’heure actuelle, aucun protocole de collecte/extraction d’ADN salivaire pour le séquençage de nouvelle génération n’a été présenté dans la littérature. Ce protocole optimise les paramètres de collecte/stockage de la salive et d’extraction de l’ADN pour qu’ils soient de qualité et de quantité suffisantes pour les tests d’ADN selon les normes les plus élevées, y compris le génotypage des microréseaux et le séquençage de nouvelle génération.

Pour déterminer les paramètres optimaux pour l&#39;extraction de l&#39;ADN d&#39;une série d&#39;extractions d&#39;ADN appariés a été effectuée. Un échantillon de salive, seule a été divisé et chaque partie a testé avec l&#39;une des deux valeurs possibles d&#39;une variable donnée. Au moins huit répétitions de chaque test apparié ont été réalisées (par exemple, un seul échantillon de salive a été aliquote de tester l&#39;extraction à la fois avec et sans participation initiale de 50 ° C incubation). Optimisati...

L’extraction de l’ADN à partir de la salive peut fournir une source facilement disponible d’ADN de haut poids moléculaire, avec peu ou pas de dégradation/fragmentation. Ce protocole fournit des paramètres optimisés pour la collecte/le stockage de la salive et l’extraction de l’ADN afin qu’ils soient de qualité et en quantité suffisantes pour les tests d’ADN en aval avec des exigences de qualité élevées.

Collecte et d&#39;extraction de l&#39;ADN de la salive pour le séquençage de prochaine génération

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

L'objectif général de cette procédure est d'extraire de l'ADN génomique de haute qualité à partir de salive totale. Cela est réalisé en lysant d'abord les cellules afin de libérer l'ADN. La deuxième étape de la procédure consiste à éliminer les impuretés d'ARN et de protéines.La troisième étape consiste à précipiter l'ADN génomique et à éliminer toute contamination ou impureté résiduelle. La dernière étape consiste à réhydrater l'ADN génomique pour des applications en aval telles que la PCR et le séquençage. En fin de compte, la spectroscopie, la photométrie et l'amplification peuvent démontrer que l'ADN génomique collectif est de haute qualité.Le principal avantage de cette technique par rapport aux trousses de collecte est que les coûts seront considérablement réduits sans perte de rendement. Une demi-heure avant la collecte de la salive, les sujets doivent se rincer la bouche avec de l'eau, puis s'abstenir de manger ou de boire jusqu'au prélèvement de l'échantillon. Pour prélever l'échantillon, demandez au sujet d'expectorer précisément 2,5 millilitres de salive dans un tube de 15 millilitres contenant 2,5 millilitres de tampon de stabilisation de l'ADN.Ne touchez pas l'intérieur du tube ni l'intérieur du bouchon. Pendant cette étape, bouchonnez le tube et homogénéisez le mélange par retournements, sans agiter. Conservez ensuite l'échantillon à température ambiante à court terme ou à quatre degrés Celsius pendant une durée maximale de trois mois.Les préparatifs incluent le chauffage d'un bain-marie à 37 degrés Celsius et la préparation de trois tubes de 15 millilitres. Commencez par retourner l'échantillon plusieurs fois, puis vortexez-le à vitesse moyenne pendant 15 secondes. Transférez 2,5 millilitres de l'échantillon dans l'un des tubes.Ajoutez cinq millilitres de solution de lyse cellulaire à l'aliquote et mélangez la solution de lyse dans l'échantillon en retournant le tube 50 fois. Une fois l'échantillon homogénéisé, laissez-le incuber pendant 30 minutes. À température ambiante, après une demi-heure, ajoutez 40 microlitres d'ARN A à 100 milligrammes par millilitre à la solution de cellules lysées.Ensuite, retournez rapidement le tube cinq fois. Incubez la réaction d'ARN à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Puis refroidissez le tube sur de la glace pendant trois minutes.À ce stade, augmentez la température du bain-marie à 65 degrés Celsius. Ensuite, retirez le tube de la glace. Ajoutez 50 microlitres de protéinase K et mélangez ; laissez ensuite la réaction s'incuber soit à température ambiante pendant 30 minutes, soit de 16 à 24 heures à quatre degrés Celsius.Ensuite, ajoutez 1,7 millilitre de solution de précipitation des protéines et vortexez le tube pendant 20 secondes à vitesse élevée. Laissez ensuite l'échantillon refroidir sur de la glace pendant 10 minutes. Une fois refroidi, centrifugez un échantillon pendant 10 minutes à 3000 G et à quatre degrés Celsius.Si le culot n'est pas compact, refroidissez l'échantillon pendant cinq minutes supplémentaires et centrifugez-le à nouveau pendant cinq minutes. Répétez ce processus jusqu'à l'obtention d'un culot compact. Veillez à maintenir l'échantillon toujours froid.Commencez l'isolement de l'ADN en préparant un tube propre de 15 millilitres contenant cinq millilitres d'isopropanol et huit microlitres de solution de glycogène à 20 milligrammes par millilitre. Versez ensuite le surnageant de l'échantillon centrifugé dans ce tube. Éliminez le culot et mélangez l'échantillon en effectuant 50 inversions.Ensuite, centrifuger l'échantillon à 3000 G et à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Verser le surnageant dans un autre tube de 15 millilitres propre, en laissant le culot. Ajouter un millilitre d'éthanol à 70 % et agiter manuellement en inclinant le tube pendant 30 secondes.Ensuite, centrifuger la solution d'éthanol pendant une minute à 2000 Gs et à quatre degrés Celsius ou à 20 degrés Celsius. Éliminer le surnageant en le versant lentement, puis ajouter plus d'éthanol au culot. Agiter doucement le mélange à la main et répéter la centrifugation.Versez ensuite lentement l'éthanol à nouveau. Pendant le lavage, le culot peut devenir lâche. S'il se détache, veillez à ce qu'il reste dans la solution d'éthanol et ne colle ni aux parois ni au couvercle du tube.Ne pas retourner le tube pendant ce lavage. Après les lavages à l'éthanol, laisser le tube sécher à l'air libre pendant 15 à 30 minutes. Ensuite, reconstituer le culot d'ADN génomique en ajoutant d'abord 300 microlitres de tampon Tris EDTA.Ensuite, vortexer un échantillon à vitesse moyenne pendant cinq secondes et transférer l'échantillon dans un bain d'eau à 65 degrés Celsius pendant une heure. Après chauffage dans le bain, laisser l'échantillon incuber toute la nuit à température ambiante. Le lendemain, l'ADN sera prêt à être utilisé. L'électrophorèse sur gel d'ADN extrait de salive montre des bandes de poids moléculaire élevé appropriées, sans brouillage indicatif d'un ADN dégradé. L'étape de suppression de l'ARN est nécessaire et très efficace.Après la digestion des ARN, le rapport entre 260 et 280 nanomètres est en moyenne de 1,74. Importamment, l'ADN est adapté au séquençage à haut débit. Un kit d'enrichissement ciblé a été appliqué à 24 échantillons ciblant 2,6 mégabases d'ADN ; 12 échantillons portant des codes à barres ont été séquencés par voie.Toutes les 24 échantillons présentaient des données de séquençage à haut débit de haute qualité, et des polymorphismes de nucléotide unique rares ont pu être identifiés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment extraire de l'ADN génomique de haute qualité à partir de salive totale.

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Considérant la salive d'échantillonnage pour l'application clinique future, une sucette en forme de l'ultrafiltration (LLUF) sonde a été fabriquée pour s'adapter à la cavité buccale humaine. Une analyse directe de la salive non digérés par NanoLC-spectrométrie de masse LTQ a démontré la capacité de sondes LLUF pour éliminer les protéines et les protéines de grandes abondance élevés, et de faire peu abondantes peptides plus détectable.

Échantillonnage humaines Peptidome salive autochtones l&#39;aide d&#39;une sonde d&#39;ultrafiltration Lollipop-Like: Simplifier et améliorer la détection des peptides pour spectrométrie de masse clinique

Le séquençage d’amplicon au bisulfite (BSAS) est une méthode de quantification de la méthylation de la cytosine dans les régions génomiques ciblées d’intérêt. Cette méthode utilise la conversion au bisulfite associée à l’amplification par PCR des régions cibles avant le séquençage de nouvelle génération pour produire une quantification absolue de la méthylation de l’ADN à un niveau spécifique à la base.

Ciblé méthylation de l&#39;ADN Analyse par séquençage de nouvelle génération

Ce manuscrit décrit une approche automatisée de sélection de la taille du gel pour purifier les fragments d’ADN pour le séquençage de nouvelle génération. La technologie Ranger permet une automatisation complète de l’ensemble du processus de chargement de gel d’agarose, d’analyse électrophorétique et de récupération de fragments d’ADN ciblés, ce qui permet d’obtenir des bibliothèques de séquençage de nouvelle génération à haut débit et de haute qualité.

Sélection de la taille Gel automatisé pour améliorer la qualité des bibliothèques de séquençage de prochaine génération Préparé à partir d&#39;échantillons d&#39;eau de l&#39;environnement

Nous décrivons une méthode efficace, robuste et rentable pour extraire l'acide nucléique à partir des prélèvements pour la caractérisation des communautés bactériennes en utilisant ARNr 16S séquençage de l'amplicon du gène. La méthode permet une approche de traitement commun pour les types d'échantillons multiples et peut accueillir un certain nombre de processus d'analyse en aval.

L&#39;extraction d&#39;acide nucléique et efficace de l&#39;ARNr 16S bactérien pour Séquençage génique communautaire Caractérisation

La métagénomique a été utilisée pour étudier le microbiome des aliments pour bovins d’ensilage. L’analyse a été effectuée par séquençage shotgun. Cette approche a été utilisée pour caractériser la composition de la communauté microbienne dans l’alimentation du bétail.

Métagénomique Analyse des Ensilage

La comparaison et l'optimisation de deux méthodes d'enrichissement d'ADN organellaire végétal sont présentées: centrifugation différentielle traditionnelle et fractionnement de l'ADNc total basé sur l'état de méthylation. Nous évaluons la quantité et la qualité d'ADN qui en résultent, démontrons la performance dans le séquençage de prochaine génération de lecture courte et discutons le potentiel d'utilisation dans le séquençage à une seule molécule à longue lecture.

Optimisation et analyse comparative des méthodes d&#39;enrichissement de l&#39;ADN des plantes organiques Convient pour le séquençage de la prochaine génération

Nous décrivons ici un protocole simple pour générer des profils d’empreintes génétiques en amplifiant le locus VNTR D1S80 à partir de l’ADN des cellules épithéliales.

Application de l’empreinte génétique à l’aide du locus D1S80 dans les classes de laboratoire

Décrit ici est un protocole d’extraction d’ADN utilisant des perles magnétiques pour produire des extractions d’ADN de haute qualité à partir de moustiques. Ces extractions conviennent à une approche de séquençage de nouvelle génération en aval.

Un protocole d’extraction de l’ADN des moustiques à base de perles magnétiques pour le séquençage de nouvelle génération

Ce protocole détaille une approche globale pour la culture, le séquençage et l’assemblage hybride de novo du génome des bactéries urinaires. Il fournit une procédure reproductible pour la génération de séquences génomiques complètes et circulaires utiles pour étudier les éléments génétiques chromosomiques et extrachromosomiques contribuant à la colonisation urinaire, à la pathogenèse et à la dissémination de la résistance aux antimicrobiens.

Assemblage hybride du génome de novo pour la génération de génomes complets de bactéries urinaires à l’aide de technologies de séquençage à lecture courte et longue

Nous présentons une méthode optimisée pour l’extraction de l’ADN à partir d’expectorations décontaminées à l’aide d’une méthode d’extraction matricielle combinée à une purification par billes magnétiques pour le séquençage ciblé de nouvelle génération de Mycobacterium tuberculosis en aval.

Extraction d’ADN basée sur la matrice pour un séquençage ciblé de nouvelle génération sur des échantillons d’expectorations décontaminés

Apprenez à extraire de l'ADN génomique de haute qualité à partir de salive entière pour la génomique. Cette méthode non invasive utilise une lyse cellulaire optimisée et une purification rigoureuse pour le séquençage de nouvelle génération.

Collecte et d'extraction de l'ADN de la salive pour le séquençage de prochaine génération

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