De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

L’objectif global de cette procédure est de caractériser les effets médiés par le récepteur GABA B dans les interneurones positifs à la parvalbumine de l’hippocampe identifiés. Ceci est accompli en produisant d’abord des tranches aiguës d’hippocampe de haute qualité. La deuxième étape consiste à utiliser un microscope vidéo pour sélectionner les neurones en fonction de l’expression veineuse de YFP et des caractéristiques connues des neurones positifs à l’albumine parale.

Ensuite, des enregistrements de patchs clamps de cellules entières sont obtenus et des enregistrements de stimulation extracellulaire ou d’appariement sont utilisés pour examiner les effets médiés par le récepteur GABA B. La dernière étape consiste à visualiser les neurones et à confirmer que les neurones enregistrés sont en fait positifs à l’albumine et sont des neurones inhibiteurs parasomatiques ou dendritiques. En fin de compte, cette méthode permet de caractériser les effets inhibiteurs médiés par le récepteur GABA B et permet une classification sans équivoque des interneurones enregistrés.

Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine interneuronale. Par exemple, comment les interneurones communiquent entre eux, comment leur excitabilité, leur production synaptique sont contrôlées par des systèmes neuromodulateurs. Bien que cette méthode donne un aperçu du GABAergique, le contrôle de l’hippocampe dans les neurones, elle peut également être appliquée à d’autres régions du cerveau, aux systèmes neuromodulateurs ou aux types de cellules.

Prenez le cerveau d’un rat transgénique âgé de 17 à 24 jours exprimant un YFP veineux fluorescent conservé dans du carbogène saccharose semi-congelé, un LCR à l’aide d’un scalpel, retirez le tiers frontal du cortex, le cervelet et séparez les hémisphères. Retirez la surface dorsale du cortex pour fournir une surface plane pour coller le cerveau pour la section. Collez les hémisphères sur la scène viome avec le bain viome rempli de carbogen rozen native saccharose.

Un LCR a coupé des tranches transversales de 300 micromètres de la formation hippocampique. Transférez chaque tranche dans une chambre de rétention immergée contenant du saccharose de carbogène, un LCR à 35 degrés Celsius. 30 minutes Après avoir placé la dernière tranche dans le saccharose réchauffé, un LCR transfère les tranches à température ambiante pour la conservation.

Tirez les pipettes patch des capillaires en verre afin d’obtenir une résistance de pipette de deux à quatre méga ohms. Une fois rempli, transférez une tranche d’hippocampe dans la chambre d’enregistrement, en la maintenant en place avec un anneau en platine enfilé avec des fibres simples de soie. Placez la chambre dans le dispositif d’enregistrement et commencez la perfusion avec un LCR d’enregistrement chauffé au carbogène à un débit de cinq à 10 millilitres par minute.

Utilisez une caméra vidéo pour évaluer la qualité de la coupe sous l’optique I-R-D-I-C à un grossissement d’objectif de 40 x. Supposons que la tranche est de bonne qualité. Si un grand nombre de cellules paramétalliques rondes modérément contrastées peuvent être observées dans le paramètre de strate à des profondeurs de 20 à 30 micromètres sous une surface lisse et légèrement cratérisée.

À l’aide d’un éclairage épifluorescent, identifiez les interneurones à enrichissement rapide présumé comme étant ceux exprimant la YFP veineuse avec une grande somatique multipolaire dans ou près de la couche parama. Ensuite, remplissez les pipettes patch avec une solution contenant une concentration de chlorure faible et physiologiquement pertinente pour l’identification des courants post-synaptiques et placez-la dans le porte-pipette sur la scène de tête. Appliquez ensuite une faible pression positive à travers la ligne de tube.

Abaissez la pipette à la surface de la tranche, légèrement décalée vers le centre du neurone sélectionné. Augmentez la pression à 70 à 80 millibars et abaissez rapidement la pipette à travers la tranche jusqu’à juste au-dessus du soma de la cellule sélectionnée. Appuyez la pipette contre la membrane cellulaire pour produire une fossette sur celle-ci.

Effectuez cette étape rapidement. Afin d’empêcher le marquage à la biotine des cellules voisines, créez un joint giga ohm en relâchant la pression et en appliquant simultanément une commande de tension négative de 20 millivolts à la pipette. Une fois l’étanchéité commencée, réduisez la commande de tension au potentiel de membrane de repos attendu, généralement entre moins 70 et moins 60 millivolts.

Appliquez maintenant une courte impulsion de pression négative pour rompre le patch membranaire, réalisant ainsi la configuration complète de la cellule. À l’aide du mode pince de courant, identifiez les interneurones à pic rapide par leur réponse à une famille d’impulsions de courant hyperpolarisantes à dépolarisantes. Pour observer les réponses évoquées synaptiquement, placez une électrode de stimulation extracellulaire dans la tranche à la limite de la couche radium et de l’enregistrement moléculaire de la strate.

En mode pince de tension, utilisez un stimulateur à tension constante isolé pour délivrer des trains uniques ou 200 hertz de cinq stimuli électriques de 50 volts aux axones pré-synaptiques toutes les 20 secondes. Ensuite, appliquez des antagonistes ionotropes des récepteurs du glutamate dans le bain afin de révéler les monos isolés. IPSC synaptique.

Isoler davantage l’IPSC médié par le récepteur GABA B avec l’application d’un antagoniste du récepteur GABA A. Pour commencer les enregistrements appariés. Tout d’abord, établissez un enregistrement cellulaire entier d’un interneurone pré-synaptique comme précédemment et confirmez le phénotype de pic rapide.

Ensuite, patchez une cellule paramétallique CA one à une distance de 20 à 100 micromètres de l’interneurone contenant l’interneurone présynaptique. En mode pince de courant. Appliquez de brèves impulsions de courant dépolarisantes de seuil SRA pour susciter des potentiels d’action dans l’interneurone.

Si une connexion synaptique est présente, les potentiels d’action dans l’interneurone entraînent des IPC dans la tension clampée autour d’une cellule paramétallique. Une fois qu’une connexion est établie, suscitez des paires de potentiels d’action dans l’interneurone à pic rapide pré-synaptique avec un protocole d’impulsion apparié typique de deux stimuli dépolarisants avec un intervalle de 50 millisecondes. Après avoir recueilli les traces de contrôle, appliquez le baclofène, agoniste sélectif des récepteurs GABA B, sur le LCR A perfusant, activant ainsi les récepteurs GABA B.

Ensuite, appliquez l’antagoniste CGP 55 8 45 pour bloquer complètement les effets médiés par les récepteurs. Une fois l’enregistrement terminé, retirez lentement la pipette du corps de la cellule à l’aide d’une pince de tension. Au fur et à mesure que la résistance mesurée en série augmente, réduisez la tension de la membrane à moins 40 millivolts pour sceller la membrane somatique en formant un patch extérieur vers l’extérieur.

Suite aux enregistrements, fixer les tranches par immersion dans du paraformaldéhyde à 4 % avec un tampon de phosphate à 0,1 molaire pendant une nuit à quatre degrés Celsius, puis dans une solution saline tamponnée au phosphate et un bloc avec 10 % de sérum de chèvre normal à 0,03 % de TRITTON X 100 et 0,05 % d’azoture de sodium pendant une heure à température ambiante pour déterminer l’expression de l’albumine de par, utilisez un anticorps monoclonal de souris anti-parvalbumine dilué dans une solution contenant 5 % de sérum de chèvre normal, 0,3 % de TRITTON X 100 et 0,05 % d’azoture de sodium dans le PBS, incubez les anticorps primaires pendant deux à trois jours à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, rincez abondamment les tranches dans du PBS, appliquez des anticorps secondaires fluorescents anti-US ainsi qu’une protéine de liaison à la biotine conjuguée à un fluorochrome et incubez dans une solution contenant 3 % de sérum de chèvre normal, 0,1 % de tritton X 100 et 0,05 % de sodium dilué dans du PBS, incubez pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, rincez généreusement les tranches deux à trois fois avec du PBS, suivies de deux à trois rinçages dans un tampon de phosphate.

Montez les tranches sur des lames de verre et utilisez une entretoise de gélose de 300 micromètres pour éviter que la tranche ne s’effondre. Ensuite, recouvrez les tranches, glissez-les avec un support de montage fluorescent et scellez avec du vernis à ongles. Évaluer l’immunoréactivité par albumine de l’interneurone avec un grossissement élevé et une ouverture numérique.

Les cellules du cristallin objectif sont considérées comme immunoréactives pour l’albumine de par. Si l’immunomarquage s’aligne avec les structures marquées à la biotine, prenez une série d’images sur l’axe Z avec un microscope confocal à balayage laser, en imageant Aden fluorescent pour l’identification morphologique et la reconstruction tridimensionnelle. Ensuite, reconstruisez l’image en neurone en trois dimensions, en incorporant l’arborisation dendritique et axonale.

La réponse synaptique composée d’un interneurone à pic rapide en réponse à un seul stimulus extracellulaire est illustrée ici. Application des antagonistes ionotropiques des récepteurs du glutamate, des isolats DNQX et A PV, du courant post-synaptique inhibiteur monos synaptique ou de l’application IPSC de l’antagoniste des récepteurs gabaa. Gazin a aboli la composante rapide de l’IPSC.

Une série de cinq stimuli a révélé une IPSC lente médiée par le récepteur GABA B, qui a été bloquée par l’application ultérieure de CGP. Ces traces montrent des potentiels d’action dans l’interneurone pré-synaptique, à pics rapides et des CSP I unitaires à courte latence dans les cellules paramétalliques CA one dans des conditions de contrôle après le bain, l’application de baclofène et l’application ultérieure de CGP. Notez que le baclofène réduit l’amplitude de l’IPSC d’environ 50 % alors que l’antagoniste du récepteur GABA B a entraîné une récupération presque complète de l’amplitude de l’IPSC.

Un graphique temporel de l’amplitude de l’IPSC montre l’effet du baclofène et de l’interneurone à pic rapide CGPA montré à un grossissement de 20 x avait un somata situé à la limite de la couche radium et une poupée parama de la zone ca one avec des dendrites allant verticalement et couvrant toutes les couches. Alors que la majorité de l’axone se trouve dans et autour de la couche du corps cellulaire comme c’est le cas pour les cellules de panier, une image de grossissement de 60 x montre des paniers typiques d’axones se formant autour de ca un paramétal salata, qui sont marqués par l’astérisque orange. Une reconstruction tridimensionnelle du même interneurone est montrée ici avec le soma et les dendrites en noir et l’axone en rouge.

Les couches du ca one sont délimitées en bleu Une fois maîtrisé. Cette technique peut être réalisée en une journée avec une analyse morphologique postdoc réalisée sur plusieurs coupes à la fois après son développement. Cette approche combinée a ouvert la voie aux chercheurs sur les microcircuits hippocampiques et corticaux pour explorer la diversité physiologique morphologique ainsi que l’interrelation structure-fonction des types interneuronaux.