Name: De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: Apprenez la technique de patch-clamp en cellule entière pour caractériser les effets des récepteurs GABA B sur les interneurones parvalbumine-positifs de l'hippocampe. Cette méthode permet d'étudier les circuits inhibiteurs avec une identification morphologique précise.

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Les auteurs tiennent à remercier Ina Wolter pour son excellente assistance technique. VGAT-Vénus rats transgéniques ont été générées par les Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi et Y. Kawaguchi à l&#39;Institut national de sciences physiologiques, Okazaki, Japon, utilisant pCS2-Vénus fourni par le Dr A. Miyawaki.

Déclaration éthique: toutes les procédures et animale entretien ont été effectués conformément aux directives institutionnelles, la loi allemande sur la protection des animaux, la directive européenne 86/609 / CEE relative à la protection des animaux, et des directives des autorités locales (Berlin, T-0215/11 ) 1 Préparation de tranches aiguë-hippocampiques <ol><li> Prenez un rat transgénique (17 à 24 jours), l&#39;expression de la protéine fluorescente Venus / YFP sous le promoteur de VGAT, qui marque la majorité des interneurones inhibiteurs corticaux 13. Décapiter le rat. Rapidement disséquer le cerveau (&lt;40 sec) dans semifrozen, carbogenated (95% O 2, CO 2/5%) à base de saccharose liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF saccharose, figure 1A). </li><li> Évaluer le cerveau de rat disséqué pour Venus / YFP fluorescence avec une lampe 505 nm et 515 filtre d&#39;émission LED, monté sur une paire de lunettes. </li><li> Retirer la troisième frontale du cortex et CerebEllum; puis de séparer les hémisphères, le tout avec un scalpel. Retirer la face dorsale du cortex pour fournir une surface plane pour coller le cerveau vers le bas, comme décrit précédemment 14. </li><li> Couper des tranches transversales (300 um) de la formation hippocampique sur un vibratome, les hémisphères doivent être entourés d&#39;semifrozen, carbogenated saccharose ACSF (figure 1B) 14. Retirer régions supplémentaires du cortex rostral, le mésencéphale et le tronc cérébral. Transfert de chaque tranche dans une chambre de retenue immergé ACSF contenant du saccharose, qui est carbogenated et chauffé à 35 ° C. </li><li> Laissez les tranches de récupérer à 35 ° C pendant 30 min à partir du moment de la dernière tranche entrer dans le ACSF réchauffé. Pour ce faire, dans le but de réactiver les processus métaboliques et de faciliter la refermeture de processus neuronaux coupées. Puis transfert à la température ambiante pour le stockage (figure 1C). </li></ol> 2. fabrication et de remplissage de pipettes d&#39;enregistrement <ol><li> PuLes pipettes de patch ll de capillaires en verre, de sorte qu&#39;une résistance à la pipette de 2-4 MQ est réalisé quand il est rempli avec filtré (filtre de seringue, taille des pores: 0,2 um) solution intracellulaire contenant 0,1% de la biocytine (pour le marquage intracellulaire). Conserver la solution intracellulaire refroidi sur de la glace pour empêcher la dégradation de ses constituants. </li><li> Remplissez les pipettes de patch pour l&#39;identification des courants post-synaptiques avec une solution contenant un Cl faible physiologiquement pertinente - concentration (E R (Cl) = -61 mV; voir la liste de la solution). </li><li> Pour les enregistrements appariés pour identifier les réponses médiées par des récepteurs présynaptiques, remplir les pipettes de patch avec une solution intracellulaire de faible capacité Ca2 + tampon pour éviter les interférences avec l&#39;émetteur de presse pré-synaptique, ainsi que 4 fois plus élevée concentration de Cl - (E R (Cl) = -20 mV) pour améliorer le rapport signal-bruit de CISP observées 5 permettant une évaluation précise de resp pharmacologiqueonsiveness. Notez que la modification concentration de Cl - peut modifier la cinétique IPSC 15. </li></ol> 3 cellules entières Patch-clamp enregistrement de FS-IN <ol><li> Carbogenate l&#39;ACSF et alimenter par l&#39;intermédiaire du système de perfusion à la chambre d&#39;enregistrement, au moyen d&#39;une pompe péristaltique (ce qui supprime également l&#39;ACSF à partir de la chambre d&#39;enregistrement à travers une conduite d&#39;aspiration, la figure 2A). Mettre tous les appareils de la configuration en cours de préparation pour l&#39;enregistrement. </li><li> Transférer une tranche de la chambre d&#39;enregistrement et maintenir en place avec un anneau de platine enfilées avec des fibres simples de soie. Positionner la tranche de telle sorte que la couche pyramidale (str.) De CA1 s&#39;étend verticalement à travers le champ de vision, ce qui permet l&#39;accès aux deux pipettes à la fois la str. radiatum et str. oriens simultanément (figures 2C et 4A). </li><li> Placer la chambre dans la configuration et commencer la perfusion de carbogenated et chauffée (32-34 ° C) Un enregistrementCSF à un taux de 5 à 10 ml / min. </li><li> Évaluer la qualité de coupe sous l&#39;optique IR-DIC à un grossissement de 40X objectif, et visualiser avec une caméra CCD vu sur un écran. Présumer de la bonne qualité de la tranche si un grand nombre de cellules rondes, modérément contrastées CA1 pyramidales CA1 (PC) peut être vu dans str. pyramidale à des profondeurs de 20-30 um ci-dessous une surface lisse et légèrement cratères (figure 2C). Pauvres tranches de qualité contiennent un grand nombre de très contrastées, les cellules ratatinées ou gonflées, avec une surface de tranche inégale. </li><li> Identifier FS putatifs interneurones sous un éclairage à épifluorescence que ceux exprimant Vénus / YFP (figure 2B), avec une grande soma multipolaire dans ou près de la str. pyramidale. Sélectionnez les cellules raisonnablement profonde au sein de la tranche (50-100 um, figure 2C) afin de mieux préserver leur intégrité morphologique. </li><li> Monter l&#39;électrode d&#39;enregistrement dans le support de pipette sur la headstage; alors l&#39;applicationment une faible pression positive (20 à 30 mbar) à travers la ligne de tube. Abaisser la pipette à la surface de la tranche, légèrement décalé vers le centre du neurone sélectionné. </li><li> Obtenir la configuration d&#39;enregistrement cellule entière comme décrit précédemment 14,16 et voir également les figures 2D et 2E: <ol><li> Cibler une cellule: Augmenter la pression à 70-80 mbar et abaisser rapidement la pipette par la tranche juste au-dessus du soma de la cellule sélectionnée (figure 2D, en haut). </li><li> Approche de la cellule: Appuyez sur la pipette contre la membrane cellulaire pour produire une «fossette» sur elle (figure 2D, en haut). Effectuez cette étape rapidement, afin d&#39;éviter l&#39;étiquetage biocytine de cellules voisines. </li><li> Créer un joint gigaohm: Relâchez la pression et appliquer simultanément une commande de 20 mV tension à la pipette. Un joint giga-ohms (1-50 GQ; figure 2D, le fond et la figure 2E milieu) typicallié se développe rapidement. Une fois scellé, appliquer le potentiel membranaire de repos attendu (typiquement entre -70 et -60 mV) en tant que commande de tension. </li><li> Brisez le patch: Une fois scellé, la rupture de la pièce de membrane avec une brève impulsion de pression négative; réalisant ainsi la configuration cellule entière (Figure 2E, en bas). </li></ol></li><li> Compenser la capacité de cellule entière et de la résistance série (R S). R s est normalement 5-20 MQ et stable jusqu&#39;à 120 min. Abandon cellules si le potentiel (V M) de la membrane sur la percée est plus dépolarisée à -50 mV; R S est initialement supérieure à 30 MQ; ou R S changements de plus de 20% au cours de l&#39;enregistrement. </li><li> Identifier FS-ins par leur réponse (en mode courant-clamp) à une famille de l&#39;hyper à la dépolarisation des impulsions de courant (-250 à 250 pA, figure 2F, en haut). FS-ins ont relativement dépolarisé V M (typiquement -50 to -60 mV), courte membrane constante de temps (&lt;20 ms) et répondre à une 500 pA dépolarisants injection de courant avec un train de potentiels d&#39;action (PA) à des fréquences&gt; 100 Hz 11 (figure 2F, en bas), qui sont nettement différents de ceux de CA1 PC (Figure 2F, milieu). </li></ol> 4. extracellulaire stimulation électrique à susciter des réponses GABA B R médiation <ol><li> Pour observer les réponses synaptiques évoqués, placer une électrode de stimulation extracellulaire (une pipette de patch rempli de 2 M de NaCl; Résistance: 0,1-0,3 MQ) dans la tranche à la frontière de str. radiatum et str. lacunosum-moleculare. Positionner l&#39;électrode 200 à 300 um de la soma latérale pour empêcher une stimulation électrique directe de la cellule et de réduire au minimum les artefacts de stimulation (figure 3A). </li><li> Une fois que l&#39;électrode de stimulation est positionnée, obtenir l&#39;enregistrement de cellules entières dela cellule choisie et évaluer le phénotype physiologique en mode courant pince comme dans la section 3.9 (figure 3B). </li><li> Avec le neurone enregistré dans voltage-clamp (V M -65 mV), délivrer une stimulation électrique des axones présynaptiques à 50 V (~ 500 uA stimulus efficace) toutes les 20 secondes, en utilisant un stimulateur de tension constante isolé. Utilisez unique stimuli (100 ps durée, la figure 3C, en haut) pour observer GABA B R CISP médiation, et s&#39;imbriquent avec des trains de multiples stimuli (à 200 Hz) afin de produire une plus grande version de l&#39;émetteur. </li><li> Bain s&#39;applique antagonistes des récepteurs ionotropiques du glutamate (récepteur d&#39;AMPA: DNQX [10 uM]; récepteur NMDA: D-AP5 [50 uM]) pour révéler la CISP monosynaptique isolé (Figure 3C, supérieur au milieu). Isoler davantage l&#39;IPSC GABA B R-médiation avec l&#39;application d&#39;un bloqueur GABA A R (gabazine [10 uM]; figure 3C de l milieutournesol). </li><li> Confirmez la résultante lente courant sortant (figure 3C inférieur, élargi) comme étant GABA B R-médiée par l&#39;application ultérieure de CGP-55845 [5 uM] (figure 3C inférieur, reposant en gris) </li></ol> 5. jumelés enregistrements de synapses couplés FS-IN et CA1 PC <ol><li> Évaluer le contrôle présynaptique GABA B R médiation de la transmission synaptique inhibitrice des enregistrements simultanés, réalisées entre synapses couplés paires IN et PC comme décrit ci-dessous. </li><li> Tout d&#39;abord, établir un enregistrement cellule entière d&#39;une interneurones présynaptique (comme dans la section 3) et confirmer le phénotype de FS (figure 4A). </li><li> Puis de relier un PC CA1 voisin (20-100 um Distance, figure 4A) et exercez une brève dépolarisation supraliminaire impulsions de courant (1 msec, 1-5 nA amplitude) à la présynaptique IN (tenue en mode courant-clamp) pour obtenir des points d&#39;accès. Si un co synaptiquennection est présent, les points d&#39;accès dans le résultat IN dans CISP dans le CA1 PC, qui s&#39;est tenue en tension de serrage (compenser R S à environ 80%). </li><li> Si nécessaire, remplir une nouvelle électrode d&#39;enregistrement et enregistrer à partir d&#39;autres ordinateurs CA1 jusqu&#39;à ce qu&#39;une connexion soit trouvée. </li><li> Une fois la connexion établie, obtenir des paires de points d&#39;accès dans le présynaptique FS-IN pour évaluer à la fois la réponse synaptique unitaire et le comportement dynamique. Utilisation d&#39;un protocole typique double choc de deux stimuli dépolarisants avec un intervalle de 50 ms (figure 4B). </li><li> Recueillir des traces de contrôle dans les conditions de base. Ensuite, appliquer les baclofène R agonistes GABA B sélectifs (10 uM) à l&#39;ACSF perfusion, activant ainsi GABA B Rs, suivis par l&#39;antagoniste CGP-55845 (5 M), pour bloquer complètement les effets des récepteurs médiation. Recueillir ~ 50 traces pendant l&#39;état d&#39;équilibre de chaque condition de drogue (figure 4B et C). </li><li> Une fois l&#39;enregistrement terminé, sceller la membrane somatique en formant un outside-out patch: retirer lentement la pipette à partir du corps de la cellule en V-clamp et les R S augmente, réduire le V M à -40 mV. Pour ce faire, afin de faciliter la formation du patch outside-out; puis retirer la pipette de la salle de bain. </li></ol> 6 Analyse des propriétés électrophysiologiques <ol><li> REMARQUE: Une multitude de logiciels différents sont disponibles pour l&#39;acquisition de données électrophysiologiques. Ici, WinWCP, un programme Windows dans le forfait gratuit Strathclyde électrophysiologie logiciel est utilisé, ce qui permet d&#39;enregistrer jusqu&#39;à 16 canaux d&#39;entrées analogiques et une sortie de 10 signaux numériques. </li><li> Filtre passe-bas de toutes les données à 5-10 kHz et à 20 kHz échantillon. </li><li> Analyser les données physiologiques avec une analyse bains hors ligne. REMARQUE: Stimfit, un logiciel open source qui comprend une enveloppe de Python, est utilisé dans ce cas; cependant, d&#39;autres alternatives peuvent facilement être utilisés à la place. <ol><li> Analyser passive membrane propriétés des neurones enregistrées, acquises en pince ampèremétrique, du potentiel de membrane au repos. </li><li> Mesurer la moyenne du potentiel de membrane au repos de la ligne de base des réponses enregistrées à partir du début de l&#39;enregistrement. </li><li> Calculer la résistance d&#39;entrée, en utilisant la loi d&#39;Ohm, à partir de la réponse de tension à la plus petite des impulsions de courant d&#39;hyperpolarisation (≤ -50 Pa). Pour améliorer le rapport signal sur bruit, des traces multiples moyens. Remarque: les exemples sont généralement des moyennes de 10-50 balayages individuels. </li></ol></li><li> Estimer le temps de membrane apparente constante en ajustant une courbe monoexponentielle à la désintégration des réponses aux petites impulsions de courant hyperpolarisants. </li><li> Analyser l&#39;action onde potentiel pour déterminer le seuil, amplitude (seuil à crête) et la durée (largeur mesurée à mi-hauteur) provoquée par niveau de seuil de dépolarisation des impulsions de courant. </li><li> Analyser GABA B R CISP médiation à partir d&#39;enregistrements tension de serrage. Filtre retrace off-line à500 Hz (filtre gaussien) et d&#39;évaluer l&#39;amplitude de crête et la latence de la réponse à médiation par GABA B de R (en moyenne d&#39;au moins 10 traces). </li><li> Détecter l&#39;effet de GABA B Rs inhibitrice sur la production de IN comme un changement dans l&#39;amplitude de crête des CPSI GABA A R médiées mesurées entre le pic et le niveau de référence précédent. Calculer l&#39;amplitude moyenne de ≥50 traces de la période de contrôle et l&#39;état d&#39;équilibre de toutes les époques pharmacologiques. </li></ol> 7 Visualisation et Immunocytochemistry de FS-Ins <ol><li> Après les enregistrements, fixer les tranches par immersion dans du paraformaldéhyde 4% avec 0,1 M de tampon phosphate (PB, pH = 7,35) O / N à 4 ° C. </li><li> Si les tranches nécessaires peuvent être transférées à PB et stockés jusqu&#39;à environ 1 semaine avant le traitement. </li><li> Tranches Laver abondamment à PB frais et suite à 0,025 M PB NaCl à 0,9% (PBS, pH = 7,35). </li><li> Pour réduire anticorps liaison non spécifique, bloquer les tranches for 1 heure à température ambiante dans une solution contenant 10% de sérum normal de chèvre (NGS), 0,3% de Triton-X100 (un détergent pour perméabiliser les membranes) et 0,05% de NaN3, composé dans du PBS. </li><li> Pour étiqueter l&#39;expression de PV, en utilisant un anticorps monoclonal de souris anti-PV dilué dans une solution contenant 5% de NGS, 0,3% de Triton-X100, 0,05% de NaN3 dans du PBS. Incuber les anticorps primaires pendant 2-3 jours à 4 ° C 12. Rincer soigneusement les tranches dans du PBS. </li><li> Appliquer des anticorps secondaires anti-souris fluorescents (par exemple, AlexaFluor-546.) Avec la streptavidine-protéine de liaison de biotine conjugué à un fluorochrome (par exemple, AlexaFluor-647); et incuber dans une solution contenant 3% de NGS, 0,1% de Triton-X100, 0,05% de NaN3, dilué dans du PBS et incubation O / N à 4 ° C. </li><li> Rincer généreusement les tranches 2-3 fois avec du PBS suivi par 2-3 rinçages dans PB. Montez les tranches sur des lames de verre. Utilisez un 300 um agar entretoise pour empêcher la tranche de s&#39;effondrer. Tranches lamelle avec un fluocent milieu de montage et joint avec vernis à ongles. </li></ol> 8. imagerie et la reconstruction de Visualized FS-Ins <ol><li> Visualisez les tranches à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal à balayage, avec le journaliste fluorochome excité avec la ligne laser approprié (diode laser 635 nm pour AlexaFluor-647; hélium-néon 543 nm pour AlexaFluor-546 étiquetage des PV et Argon 488 ou 515 nm pour Venus / YFP). </li><li> Prendre des images à une résolution en Z approprié (typiquement de 0,5 à 1 um d&#39;étapes, en utilisant un objectif 20X) afin de produire une pile en Z de la cellule entière. Piles multiples sont normalement requis pour l&#39;image de la cellule entière, qui peut être numériquement cousu hors ligne à l&#39;aide FIDJI / logiciel ImageJ (figure 5A). </li><li> Reconstruire la cellule de la pile d&#39;images cousu au moyen d&#39;une méthode de suivi semi-automatique (simple plug-in Neurites Tracer dans le progiciel FIDJI / ImageJ 17, Figure C). </li><li> Enfin, évaluer le PV-immunoréactivité de l&#39;interneuron avec une lentille d&#39;objectif à grande ouverture numérique (60X silicium-immersion, NA = 1,3). Faire des images de la soma, dendrites proximales et axone proximal, ou encore de terminaisons axonales si lavage somatique de PV est trop fort. Les cellules sont considérées comme immunoréactive pour PV si l&#39;immuno-marquage est visible à aligner avec les structures de biocytine marquée (Figure 5B). </li></ol>

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<li>Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+origin+of+CB1-dependent+tonic+inhibition+of+GABA+release+at+cholecystokinin-positive+basket+cell+to+pyramidal+cell+synapses+in+the+CA1+region+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).</li>
<li>Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoreactivity+for+the+GABAA+receptor+alpha1+subunit%2C+somatostatin+and+Connexin36+distinguishes+axoaxonic%2C+basket%2C+and+bistratified+interneurons+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus.</a> Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous décrivons une méthode qui combine des techniques de neuro-anatomiques et électrophysiologiques à la caractérisation fonctionnelle des neurones morphologically- et neurochimique identifiés in vitro; notamment les divers types de IN inhibiteurs corticaux. Les principaux aspects de la procédure sont les suivantes: (1) pré-sélection des potentiels IN; (2) l&#39;enregistrement intracellulaire et le neurone visualisation; et enfin (3) l&#39;analyse morphologique et immunocytochimique de IN enregistrées. Bien que cette ét...

Circuits neuronaux de l&#39;hippocampe ont longtemps fait l&#39;objet d&#39;un examen minutieux, par rapport à l&#39;anatomie et de la physiologie, en raison de leur rôle essentiel dans l&#39;apprentissage et la mémoire, ainsi que la navigation spatiale chez les humains et les rongeurs. De même, l&#39;organisation laminaire de premier plan, mais simplement de l&#39;hippocampe fait de cette région un sujet de prédilection des études portant sur les propriétés structurales et fonctionnelles des réseaux corticaux. Circuits de l&#39;hippocampe sont constitués de cellules excitateurs principaux (&gt; 80%) et un plus petit (10-20%), mais la cohorte très diversifié d&#39;interneurones inhibiteurs 1-3. Interneurones libèrent de l&#39;acide γ-aminobutyrique (GABA) de leurs terminaux des axones qui agit à ionotropes rapide récepteurs GABA A (GABA A R) et lents métabotropiques GABAB récepteurs GABA (B R) 4. Ces mécanismes inhibiteurs contrebalancer excitation et de réguler l&#39;excitabilité des cellules principales, et donc lamoment de ir et le modèle de décharge. Cependant, les interneurones GABA libéré agit non seulement sur ​​les cellules principales, mais également sur ​​les interneurones 5,6 eux-mêmes. Récepteurs post-synaptiques et pré médiation régulation par rétroaction et interactions mutuelles inhibitrices entre les différents types de interneurones. Ces mécanismes inhibiteurs dans les réseaux des interneurones sont soupçonnés d&#39;être au cœur de la production et la mise en forme des modèles d&#39;activité de la population, en particulier les oscillations à des fréquences différentes 7. Cellule entière enregistrement patch-clamp est une méthode bien établie pour l&#39;examen des propriétés intrinsèques et les interactions synaptiques des neurones. Toutefois, en raison de la grande diversité des types de interneurones, enquête sur les interneurones inhibiteurs exige l&#39;identification rigoureuse des cellules enregistrées. Comme types de interneurones hippocampiques sont caractérisés par des éléments particuliers morphologiques et l&#39;expression du marqueur neurochimique, anatomique combinée et immunocytochimique eXAMEN peut fournir un moyen de déterminer précisément 6,8,9 identité des interneurones. Dans le présent article, nous décrivons une approche expérimentale dans laquelle des cellules entières enregistrements de patch-clamp de neurones simples ou paires synaptique couplés sont combinés avec marquage intracellulaire, suivie par analyse post-hoc morphologique et immunocytochimique, permettant la caractérisation de la lenteur GABA B médiée par le récepteur des effets inhibiteurs dans les interneurones identifiés. A titre d&#39;exemple, nous nous concentrons sur un type majeur de interneurones, un sous-ensemble de ce qu&#39;on appelle les «cellules de panier&quot; (de la Colombie-Britannique), qui innerve les soma et proximale des dendrites de ses objectifs post-synaptiques et se caractérise par un &quot;dopage rapide» (FS) décharger motif, recouvrant un axone forte densité de la couche de corps de la cellule, et l&#39;expression de la protéine parvalbumine de liaison du calcium (PV) 10,11. Ces interneurones présentent d&#39;importants courants postsynaptiques inhibiteurs, ainsi que des pré proéminentmodulation synaptique de leur sortie synaptique, en réponse à l&#39;activation GABA B R 12. La combinaison des techniques décrites ici peut être appliqué aussi bien pour étudier les mécanismes intrinsèques ou synaptiques dans une variété d&#39;autres types de neurones identifiés.

<table><tbody><tr><td>Rats transgéniques vGAT-venus</td><td></td><td></td><td>voir Uematsu, &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2008</td></tr><tr><td>Lunettes Venus (515 nm)</td><td>BLS Ltd., Hongrie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Outils de dissection</td><td>&lt;em&gt;c.-à-d.&lt;/em&gt; FST</td><td></td><td>Pour l'ablation du cerveau</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>Ou tout autre vibratome haut de gamme à oscillation verticale minimale</td></tr><tr><td>Chambres de maintien des tranches</td><td></td><td></td><td>Faites sur mesure au laboratoire</td></tr><tr><td>Microscope droit IR-DIC</td><td>Olympus, Japon</td><td>BX50WI</td><td>Avec système de micromanipulateur ; &lt;em&gt;c.-à-d.&lt;/em&gt; Luigs et Neumann, Kleindiek &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>Till Photonics</td><td>VX55</td><td></td></tr><tr><td>Système LED 505 nm</td><td>Cairn Research</td><td>Système OptiLED</td><td>Ou lampe au mercure ou autre système LED &lt;em&gt;c.-à-d.&lt;/em&gt; CooLED.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B&amp;nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Alternativement 2 amplificateurs Axopatch 200B&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Logiciel d'acquisition WinWCP</td><td>John Dempster, Université de Strathclyde</td><td></td><td>Tout logiciel d'acquisition de qualité peut être utilisé, &lt;em&gt;c.-à-d.&lt;/em&gt; EPHUS, pClamp, Igor etc.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tireuse d'électrodes</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>Utilisée avec filament en boîte</td></tr><tr><td>Verre à pipette borosilicaté</td><td>Hilgenberg, Allemagne</td><td>1405020</td><td>2 mm de diamètre extérieur, 1 mm de diamètre intérieur, sans filament</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Gilson</td><td>Minipuls</td><td>D'autres pompes ou l'alimentation par gravité peuvent être utilisées à la place</td></tr><tr><td>Thermomètre numérique</td><td></td><td></td><td>Fait sur mesure</td></tr><tr><td>Manomètre numérique</td><td>Supertech, Hongrie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/&quot; target=&quot;_blank"&gt;Stimulateur isolé à tension constante&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Digitimer Ltd.</a></td><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds2a-isolated-constant-voltage-stimulatorstimulus-isolator/&quot; target=&quot;_blank"&gt;DS-2A&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Biocytine</td><td>Invitrogen</td><td>B1592</td><td>Aussi connue sous le nom de &amp;epsilon;-Biotinoyle-L-Lysine&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DL-AP5(V) sel disodique</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120271</td><td></td></tr><tr><td>DNQX sel disodique</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120169</td><td>Alternativement NBQX ou CNQX</td></tr><tr><td>Gabazine (SR95531)</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120042</td><td>Alternativement méthiodure de bicuculline</td></tr><tr><td>R-Baclofène</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120325</td><td></td></tr><tr><td>CGP-55,845 chlorhydrate</td><td>Tocris</td><td>1248</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>anticorps monoclonal anti-PV de souris</td><td>Swant, Suisse</td><td>235</td><td>Concentration de travail 1:5 000-1:10 000</td></tr><tr><td>anticorps secondaire anti-souris&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td>Si l'on utilise un rongeur exprimant Venus ou GFP, l'utilisation d'un canal rouge (&lt;em&gt;c.-à-d.&lt;/em&gt; 546 nm) est conseillée.</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscopie</td><td></td><td></td><td>Toute marque de haute qualité</td></tr><tr><td>Coverslips en verre</td><td></td><td></td><td>Généralement 22 x 22 mm</td></tr><tr><td>Séparateurs en agar</td><td></td><td></td><td>Bloc d'agar, découpé au vibratome à 300 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Olympus, Japon</td><td>Fluoview FV1000</td><td>Ou tout autre système comparable</td></tr><tr><td>Fiji (Fiji is just ImageJ)</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td><td>Voir Schindelin &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2012</td></tr></tbody></table>

de cellules entières de patch-clamp enregistrements de morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Interneurones inhibiteurs GABAergiques jouent un rôle central dans les circuits neuronaux du cerveau. Interneurones comprennent un petit sous-ensemble de la population neuronale (10-20%), mais montrent une grande hétérogénéité physiologique, morphologique et neurochimique, reflétant leurs diverses fonctions. Par conséquent, l&#39;enquête des interneurones fournit des renseignements importants sur les principes de l&#39;organisation et de la fonction des circuits neuronaux. Ceci, cependant, nécessite une approche physiologique et neuro-anatomique intégré pour la sélection et l&#39;identification des types individuels des interneurones. Cellules entières d&#39;enregistrement de tranches de cerveau aiguës d&#39;animaux transgéniques, exprimant des protéines fluorescentes dans les promoteurs de marqueurs spécifiques d&#39;interneurones patch-clamp, fournit une méthode efficace pour cibler et électrophysiologique caractériser les propriétés intrinsèques et synaptiques des types des interneurones spécifiques. Combiné avec intracellulaire étiquetage de colorant, cette approche peut être étendue avec post-hoc moanalyse rphological et immunocytochimique, permettant une identification systématique des neurones enregistrés. Ces méthodes peuvent être adaptés à un large éventail de questions scientifiques concernant les propriétés fonctionnelles des divers types de neurones corticaux.

À condition que la qualité de coupe est sensiblement bon, l&#39;enregistrement à la fois CA1 PC et FS-IN peut être réalisé avec un minimum de difficultés. La ligne de rat transgénique exprimant Vénus / YFP sous le promoteur de VGAT 13 ne permet pas d&#39;identifier sans équivoque FS-IN, voire BC. Cependant enregistrements de IN dans et autour de str. pyramidale, où la densité de FS-IN est généralement élevé 1, entraîne une forte probabilité de sélection FS-IN (figure 2B). ...

Réseaux corticaux sont contrôlés par un petit, mais diversifié ensemble des interneurones inhibiteurs. Exploration fonctionnelle des interneurones nécessite donc l&#39;enregistrement ciblée et identification rigoureuse. Décrit ici est une approche combinée impliquant des enregistrements de cellules entières de paires simples ou synapses de neurones couplés avec marquage intracellulaire, post-hoc morphologique et l&#39;analyse immunocytochimique.

De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

L’objectif global de cette procédure est de caractériser les effets médiés par le récepteur GABA B dans les interneurones positifs à la parvalbumine de l’hippocampe identifiés. Ceci est accompli en produisant d’abord des tranches aiguës d’hippocampe de haute qualité. La deuxième étape consiste à utiliser un microscope vidéo pour sélectionner les neurones en fonction de l’expression veineuse de YFP et des caractéristiques connues des neurones positifs à l’albumine parale.Ensuite, des enregistrements de patchs clamps de cellules entières sont obtenus et des enregistrements de stimulation extracellulaire ou d’appariement sont utilisés pour examiner les effets médiés par le récepteur GABA B. La dernière étape consiste à visualiser les neurones et à confirmer que les neurones enregistrés sont en fait positifs à l’albumine et sont des neurones inhibiteurs parasomatiques ou dendritiques. En fin de compte, cette méthode permet de caractériser les effets inhibiteurs médiés par le récepteur GABA B et permet une classification sans équivoque des interneurones enregistrés.Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine interneuronale. Par exemple, comment les interneurones com

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Neuroscience

Neurosciences

Ce protocole décrit une technique appelée électrophysiologie par patch clamp à cellules entières, qui est une méthode pour étudier les propriétés électriques des neurones de Mauthner et d’autres cellules réticulospinales dans les embryons de poisson-zèbre.

Électrophysiologie par patch clamp de cellules entières : une méthode pour étudier les propriétés électriques des neurones

Cette vidéo montre une technique d’enregistrement par patch-clamp à partir de la surface de la membrane dendritique. Cela permet d’examiner directement les propriétés électriques des dendrites et des canaux ioniques voltage-dépendants sous-jacents dans les neurones dopaminergiques.

Enregistrements patch-clamp de la dendrite d’un neurone dopaminergique dans une tranche de cerveau

La vidéo présente un protocole pour étudier les interactions synaptiques et les réponses neuronales dans une tranche de cerveau d’hippocampe de souris transfectée. Il s’agit d’éclairer des neurones sensoriels à longue portée pour déclencher des potentiels d’action et d’enregistrer les potentiels post-synaptiques excitateurs qui en résultent dans le neurone enregistré à l’aide de la technique du patch-clamp à cellules entières.

photostimulation et enregistrements de neurones dans des tranches d’hippocampe de souris

Cette vidéo montre la procédure d’exécution d’enregistrements électrophysiologiques dans les neurones de la substance gélatinosa (SG) de coupes de moelle épinière, en utilisant des techniques de patch-clamp de cellules entières pour analyser les modèles de décharge des neurones. Cette méthode permet d’étudier les réponses neuronales aux stimuli dans les neurones SG de la moelle épinière.

Enregistrement par patch clamp de cellules entières dans un neurone de la substance gélatinosa d’une coupe de moelle épinière

Cette vidéo montre la procédure de cartographie des connexions synaptiques en sécurisant une tranche de cerveau, en positionnant des pipettes pour obtenir des configurations de cellules entières et en stimulant les neurones présynaptiques pour enregistrer les réponses postsynaptiques, élucidant ainsi la connectivité neuronale.

Enregistrement par patch clamp apparié des connexions neuronales dans des coupes cérébrales aiguës

Décrit ici est un procédé d'obtention de longues étendues de l'enregistrement en cours d'un canal ionique avec la technique de patch-clamp cellule attachée. Cette méthode permet d'observer, en temps réel, le modèle de conformations ouverture-fermeture de canal qui sous-tendent le signal biologique. Ces données renseignent sur les propriétés du canal dans les membranes biologiques intactes.

Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

Les enregistrements de paires sont des enregistrements simultanés de cellules entières à partir de deux neurones synaptiquement connectés, permettant une caractérisation électrophysiologique et pharmacologique précise des synapses entre les neurones individuels. Nous décrivons ici la méthodologie détaillée et les exigences pour établir cette technique dans les cultures de coupes organotypiques d’hippocampe dans tout laboratoire équipé pour l’électrophysiologie.

Appariés enregistrements de cellules entières dans organotypiques coupes d&#39;hippocampe

Les enregistrements patch-clamp et le remplissage simultané de neurones couplés synaptiquement dans des tranches cérébrales aiguës permettent une analyse corrélée de leurs propriétés structurelles et fonctionnelles. L’objectif de ce protocole est de décrire les étapes techniques essentielles de l’enregistrement électrophysiologique des microcircuits neuronaux et de leur analyse morphologique ultérieure.

Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

Ce protocole décrit les étapes de procédure de base pour effectuer des cellules entières enregistrements de patch-clamp. Cette technique permet l'étude du comportement électrique des neurones, et lorsqu'elle est effectuée dans des tranches de cerveau, permet d'évaluer les différentes fonctions de neurones à partir de neurones qui sont encore intégrés dans des circuits du cerveau relativement bien conservées.

Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

Les enregistrements de patch-clamp subcellulaires offrent la possibilité d’étudier les propriétés fonctionnelles des dendrites. Cependant, ces structures fines ne sont pas facilement accessibles en raison de leur petit diamètre. Le protocole décrit ici vise à faciliter la collecte d’enregistrements stables et fiables à partir des dendrites des neurones dopaminergiques en tranches in vitro.

Subcellulaires Recordings Patch-clamp du Domaine somato de nigrales Dopamine Neurones

Le protocole actuel décrit comment isoler et purifier la microglie hippocampique primaire de souris adultes, suivi d’instructions pour effectuer des enregistrements de cellules entières sur ces cellules fortement isolées.

Isolement et enregistrement par patch-clamp de cellules entières de la microglie de l’hippocampe chez des souris adultes

Apprenez la technique de patch-clamp en cellule entière pour caractériser les effets des récepteurs GABA B sur les interneurones parvalbumine-positifs de l'hippocampe. Cette méthode permet d'étudier les circuits inhibiteurs avec une identification morphologique précise.

De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés (Vidéo) | JoVE Journal

De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

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