Une analyse fonctionnelle pour les jonctions lacunaires examen; Électroporation des cellules adhérentes sur Indium Tin Oxide-

L'électroporation est une technique consistant à appliquer un courant électrique à des cellules vivantes afin d'ouvrir temporairement des pores dans la membrane cellulaire. Grâce à ces pores, des colorants et d'autres molécules qui ne traversent normalement pas la membrane cellulaire peuvent pénétrer dans la cellule ; les pores se referment rapidement, sans causer de dommage à la cellule. Nous décrirons comment des cellules adhérentes peuvent être électroporées tandis qu'elles poussent sur une lame partiellement revêtue d'un matériau conducteur et transparent.

Le matériau est de l'oxyde d'indium-étain, et lorsqu'il conduit un courant électrique, il ouvre des pores permettant à un colorant d'entrer dans la cellule. Il est alors possible d'examiner si les cellules possèdent des jonctions communicantes ou non, et combien de jonctions communicantes sont présentes. Ces dernières sont de petits canaux qui relient les intérieurs de cellules voisines et permettent le passage de petites molécules. On sait depuis longtemps que la communication par jonctions communicantes joue une variété de fonctions importantes dans la cellule, notamment la transformation néoplasique et la métastase.

Bienvenue dans cette présentation de projets cellulaires sur la manière d'effectuer une électroporation de cellules adhérentes à l'aide de l'Insitu. Cette image montre ce que nous serons en mesure de faire : le colorant fluorescent jaune a été introduit dans des cellules en cours de croissance sur un verre transparent et conducteur. Jusqu'à cette ligne, la ligne est plus facile à observer en contraste de phase.

Ici, vous pouvez observer que le colorant a diffusé à travers les jonctions gap, depuis les cellules situées à gauche, qui ont été chargées avec le colorant par électroporation, jusqu'aux cellules situées à droite. Cela donne un gradient de fluorescence. Les cellules sont tryps.

Après avoir été resuspendus, les cellules sont ensuite transférées dans un tube pour centrifugation. Il est très important que les cellules soient bien réparties, car elles se développent dans la chambre. Pour cette raison, il est préférable de centrifuger les cellules afin d'éliminer toute trace de trypsine.

Le milieu contenant des traces de trypsine est aspiré, les cellules sont resuspendues dans environ un millilitre de milieu de croissance, puis ensemencées dans la chambre. La pipette contient la suspension cellulaire ; retirez le couvercle de la chambre et déposez les cellules goutte à goutte dans la chambre afin de faciliter son transport. La chambre est placée dans une boîte de Pétri de six centimètres de diamètre.

La chambre retourne dans l'incubateur pour permettre la croissance des cellules. Les cellules ensemencées s'étaleront correctement et croîtront jusqu'à se toucher et former des jonctions communicantes. Lorsque les cellules sont prêtes pour l'électroporation, régler le générateur d'impulsions in situ aux conditions souhaitées.

Consulter le manuel pour la description du processus d'installation simple. Lorsque la tension sur l'insitu est réglée, le voyant rouge sur le clavier s'allume. Prendre les deux bouteilles réchauffées de DMEM sans calcium hors du bain-marie : l'une est du DMEM sans calcium, mais avec du sérum dialysé, et l'autre est du DMEM.

Sans calcium, préparez les pipettes en chargeant plus lâchement du jaune dans la pipette. Au lieu du soupir, sortez les cellules de l'incubateur. Éliminez le milieu en l'inversant dans le bécher de lavage au départ.

Ensuite, appliquez-le une fois sur le tissu avec du DMEM sans calcium, sans chercher à éliminer complètement tout le DMEM, car les cellules pourraient sécher. Ajoutez soigneusement le jaune de lucifère sur la barrière afin de ne pas perturber les cellules, mais suffisamment rapidement pour qu'elles ne s'assèchent pas. Utilisez 200 microlitres pour chaque moitié de la chambre.

Mettez le couvercle sur la chambre insitu, puis insérez-la dans le support. Assurez-vous que les languettes aux extrémités de la chambre s’emboîtent dans les fentes du support en poussant ce dernier. Insérez la chambre dans le porte-chambre.

Appuyez sur le bouton d'impulsion du clavier du générateur d'impulsions. La DEL du générateur d'impulsions et du support de chambre clignotera en rouge pendant le processus d'électroporation, puis passera au vert pour indiquer que le cycle d'initialisation est terminé. Repoussez le curseur sous le support de chambre et retirez la chambre.

Aspirez la majeure partie du jaune de lucifère afin de le réutiliser, mais prenez soin de ne pas dessécher les cellules. Ajoutez du DMEM sans calcium. En présence de sérum dialysé, le sérum favorise la fermeture des pores ; replacez la chambre dans l’incubateur pour permettre le transfert du jaune de lucifère à travers les jonctions communicantes.

Le chronométrage doit être constant d'une expérience à l'autre. La norme est de trois minutes. Versez le milieu dans le bécher de déchets.

Ajouter une solution de fixation au formaldéhyde à 4 % à l’aide d’une pipette ou d’un papier buvard, attendre au moins deux minutes à température ambiante. Éliminer le formaldéhyde et rincer plusieurs fois avec du PBS. Les cellules étant fixées au verre, il y a peu de risque qu’elles se détachent durant les lavages.

Pour pouvoir observer les cellules en contraste de phase, il est important de placer une lame couvre-objet au-dessus de la chambre. Remplissez la chambre avec du PBS en formant un ménisque convexe. En évitant les bulles d'air, placez la lame couvre-objet.

Ne vous inquiétez pas si le PBS déborde. Absorbez simplement l'excès de PBS sur du papier absorbant. Vous avez besoin d'un microscope à fluorescence inversé, de préférence avec contraste de phase et un bloc de filtres pour le jaune de luciférine. En contraste de phase, recherchez le bord de la zone électroporée.

Vous verrez deux lignes sous les cellules en fluorescence. Sur la moitié de la lame, les cellules fluoresceront intensément. La ligne la plus proche des cellules lumineuses correspond à la limite de la zone électroporée.

Toute fluorescence supplémentaire est due au transfert de lucifer yellow à travers les jonctions gap. Par exemple, cette image de cellules épithéliales montre des cellules qui ont été électroporées sur le côté gauche de l'image, transférant le lucifer yellow à des cellules voisines non électroporées, créant ainsi un gradient de cellules fluorescentes partant du bord du revêtement conducteur vers la droite. Cette image montre le même champ de cellules en contraste de phase.

Remarquez que vous pouvez voir très clairement la ligne X. Une mesure quantitative du degré de transfert par jonctions communicantes peut être effectuée manuellement en utilisant les images en fluorescence et en contraste de phase des cellules électroporées. Les étoiles situées le long du bord de la zone conductrice sont considérées comme des cellules donneuses.

Ils ont été électroporés et ont capté du matériel libre pour le jaune. Ils transmettent le luc pour le jaune à des cellules voisines situées à droite, qui le transmettent à leur tour. Encore plus loin en quantités décroissantes.

Le rapport entre les points et les étoiles, ici de 41 à huit, peut produire un nombre permettant de comparer l'importance du transfert jonctionnel par jonctions gap dans ce cas. 5,1 est l'indice de jonction gap. Une alternative au marquage et au comptage manuels des cellules consiste à utiliser un logiciel d'analyse d'image pour mesurer les quantités relatives de fluorescence le long du côté non électroporé de la bordure d'une cellule électroporée.

Ces cellules ne possèdent pas de jonctions gap. Voici le bord droit de la zone électroporée. Remarquez qu'il n'y a pas de gradient de fluorescence, ce qui indique l'absence de jonctions gap en contraste de phase.

Vous pouvez voir clairement toutes les cellules. Notez que la ligne X est également clairement visible. Dans cet exemple.

Toutes les cellules dans la chambre ont été stimulées par le facteur de croissance épidermique EGF, puis fixées et marquées pour le phospho arc dix minutes plus tard. Notez que les cellules colorées à droite n'ont pas été électroporées, tandis que les cellules situées à gauche jusqu'à cette ligne ont été électroporées. Les cellules non électroporées présentent une coloration brune avec un anticorps anti-phospho irk et de l'immunoperoxydase.

Les cellules électroporées ne présentent aucune coloration, car le peptide phospho électroporé a bloqué le domaine SSH deux de grab deux et inhibé la phosphorylation d'EGF par irk. Remarquez la région située à trois ou quatre longueurs cellulaires à droite de la ligne, où les cellules n'ont pas encore été électroporées mais ne présentent pas non plus de coloration. Il s'agit de cellules ayant acquis le peptide bloquant provenant de leurs voisines électroporées via les jonctions communicantes.

Il s'agit de la démonstration la plus probante possible que l'inhibition du signal doit être attribuée au peptide et ne peut pas être un artefact de l'électroporation. Étant donné que ces cellules ne sont pas électroporées, il s'agit du même champ observé en contraste de phase. Remarquez l'absence de tout changement de morphologie après électroporation.

Chez certains patients, la communication par jonctions communicantes peut être quantifiée avec précision dans une grande variété de cellules en culture. L'introduction de peptides afin d'interrompre des voies de signalisation spécifiques constitue une approche puissante pour évaluer l'importance, dans des cellules vivantes, d'interactions entre protéines qui ont été identifiées à l'aide de protéines purifiées. Cela peut représenter la première étape importante dans le développement de médicaments peptidomimétiques.