Name: Moyenne de la glycoprotéine denveloppe virale Pointes de Electron Cryotomography reconstructions utilisant Jsubtomo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Découvrez la moyenne de complexes glycoprotéiques viraux par cryotomographie électronique avec Jsubtomo. Cette méthode permet d'étudier les structures de spikes à 35 angströms pour la conception de médicaments antiviraux.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

<html> Connaissance de la structure virale de pointes de glycoprotéines de la membrane du virion est essentielle pour comprendre la réplication du virus et le développement de thérapies pour traiter et prévenir l&#39;infection. Cryo-microscopie électronique combinée avec une moyenne de particule est apparue comme la méthode la plus utilisée pour résoudre les structures de particules virales enveloppées, y compris les pointes de glycoprotéines. Cependant, cette méthode est limitée aux virus icosahedrally symétriques. Ici, grâce à l&#39;application de cryo-tomographie et subtomogram moyenne dans Jsubtomo, nous avons défini un protocole général pour la détermination de pointes de glycoprotéines sur pléomorphique virus enveloppés qui ne se prêtent pas à d&#39;autres méthodes structurelles en cours de biologie. Nos résultats représentatifs montrent que la résolution de cette méthode est suffisante pour révéler un aperçu de l&#39;architecture de domaine, oligomérisation, et plus l&#39;organisation de l&#39;ordre de pointes de glycoprotéines sur des virions intacts. jove_content &quot;&gt; L&#39;étape la plus critique dans le protocole construit deux modèles de départ fiables qui sont statistiquement indépendantes l&#39;une de l&#39;autre. exécution réussie de cette étape suppose que les pointes de glycoprotéine sont suffisamment importants et non emballés contre l&#39;autre trop serré, de sorte que les pics individuels peuvent visuellement reconnus et repris manuellement dans le tomographies, et deux modèles indépendants moyenne. Si cela n&#39;est pas possible, deux modifications du protocole peuvent être tentées. Tout d&#39;abord, deux modèles aléatoires indépendantes peuvent être construits en définissant d&#39;abord deux sous-ensembles aléatoires de subtomograms puis la moyenne des subtomograms 30 à l&#39;intérieur de ces sous-ensembles. D&#39;autre part, si la structure de la pointe isolée a été extraite par d&#39;autres moyens, par exemple par cristallographie aux rayons X, il peut être utilisé en tant que modèle de départ. Cependant, il faut veiller à faible ou filtre passe-bas ce modèle en utilisant un seuil de faible résolution (50-70 Å), que les deux modèles qui en résultent dans la prochaine ronde de raffinement serastatistiquement indépendantes qu&#39;au-delà de cette résolution. En raison de cette mise en garde, la première approche est recommandée. La résolution obtenue à partir de ce protocole dépend de quatre facteurs principaux: i. stratégie de collecte de données et de la qualité des données d&#39;entrée, ii. nombre des subtomograms, iii. la précision de l&#39;alignement des subtomograms, et iv. hétérogénéité des structures. Alors que la première et deuxième limitation peut être en grande partie résolu par l&#39;aide de détecteurs de haute signal-bruit directs électroniques combinés avec la FCE corrigé la tomographie et la collecte de données automatisée, la précision de l&#39;alignement est en outre affectée par la taille et la forme de la structure d&#39;intérêt lui-même. Lors de l&#39;application de ce protocole sur les petites pointes qui n&#39;ont pas traits saillants, il peut être avantageux de lier des fragments Fab à la pointe pour améliorer la précision d&#39;alignement et donc la résolution 31. Enfin, si les structures de calcul de la moyenne présentent des conformations multiples, sous-tomogrh méthodes de classification peuvent être utilisés pour différentes conformations moyenne séparément. À cette fin, Jsubtomo s&#39;intègre avec le paquet Dynamo, offrant classification de subtomogram puissant 9. Le protocole ci-dessus est complémentaire de la cristallographie aux rayons X des glycoprotéines virales isolées. Structures cristallographiques peuvent être montés dans des moyennes de sous-tomogramme d&#39;obtenir l&#39;orientation précise de la glycoprotéine par rapport à la membrane du virion. L&#39;application de cette méthode sera sans aucun doute continuer à faire la lumière sur la structure du virus enveloppés et physiopathologie.

Electron cryo-tomographie est une technique d&#39;imagerie cryo-microscopie électronique permettant le calcul d&#39;un à trois dimensions (3D) de reconstruction des échantillons biologiques complexes. Spécimens appropriés vont de complexes macromoléculaires purifiés 1, 2 filaments, vésicules enrobées 3, et les virus polymorphes de la membrane 4 à 5 cellules procaryotes entiers et même des zones minces de cellules eucaryotes entiers 6. Après la collecte de données d&#39;une inclinaison de la série, les volumes tomographiques 3D, ou des tomographies, peut être calculée en utilisant plusieurs logiciels, y compris celles bSoft 7 et 8 MID. Deux aspects inhérents à l&#39;étude d&#39;échantillons biologiques par la limite d&#39;électrons cryo-tomographie l&#39;interprétation biologique des volumes tomographiques correspondant. Tout d&#39;abord, en raison de la limitation de la dose d&#39;électrons qui peut être appliquée à des matières biologiques avant d&#39;introduire dégâts d&#39;irradiation importante, signaratios l-bruit dans les données tomographiques sont généralement très faibles. Deuxièmement, à la suite d&#39;un échantillonnage limité géométrie d&#39;inclinaison lors de la collecte de données, des vues de l&#39;objet restent absents, conduisant à une soi-disant «manque de coin &#39;artefact dans le volume tomographique. Cependant, ces deux limitations peuvent être surmontées si le volume tomographique contient répéter des structures identiques, tels que des complexes macromoléculaires, qui peuvent être avec succès moyennes 9-12. Avant moyenne des structures de reconstructions de tomographie, les objets d&#39;intérêt doivent être trouvés et alignés à la même orientation. La localisation de ces structures peut être réalisée par corrélation croisée d&#39;une structure de matrice dans le volume tomographique utilisant une approche souvent dénommé modèle correspondant 13. Le modèle utilisé dans ce processus d&#39;adaptation peut être dérivé de cryo-microscopie électronique ou électronique de cryo-tomographie par reconstruction 3D combiné, ou il peut être une carte de densité de simulationune structure atomique. Plusieurs forfaits de calcul ont été développés pour mener à bien ces tâches 11. Calcul de la moyenne des pics de la glycoprotéine du virus de la membrane, comme le VIH-1, a été une approche particulièrement efficace pour l&#39;étude de la structure 14 à 16. Une bonne compréhension de la structure fait partie intégrante de révéler à la fois les bases moléculaires des interactions virus-hôte et l&#39;orientation du développement de la conception antiviral et un vaccin. Bien que la cristallographie macromoléculaire est la technique de choix pour la haute résolution (généralement mieux que 4 Å) Analyse structurale des glycoprotéines virales et de leurs complexes, les structures de rayons X résultant de cette méthode sont des protéines isolées de l&#39;environnement membranaire naturel sur le virion . Ainsi, les détails importants tels que l&#39;architecture d&#39;ordre supérieur de glycoprotéines virales, dans le contexte du virion, demeurent insuffisantes. D&#39;autre part, cryo-microscopie électronique et reconstruction de particule uniquedes virus enveloppés ensemble est limité à virions à symétrie icosaédrique 17,18. Cryotomography électronique associée à l&#39;alignement de sous-volume est donc apparue comme une technique complémentaire qui permet l&#39;étude des pics de la glycoprotéine de forme irrégulière, les virus polymorphes in situ. Nous avons développé un logiciel nommé Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) pour la détection, l&#39;alignement et la moyenne des sous-volumes tomographiques. Jsubtomo a été utilisée dans la détermination de la structure d&#39;un certain nombre de structures cellulaires et virales 19-26. Ici, nous présentons un protocole détaillé, qui permet de déterminer les structures de pic viral de la surface. Pour contourner excès de raffinement structures moyennes en corrélant le bruit, le schéma de raffinement «étalon-or» est adoptée 10,27. Enfin, les stratégies pour la visualisation et l&#39;interprétation des résultats typiques sont discutés.

<table><tbody><tr><td>Jsubtomo (ver 1.3.1)</td><td>Université d’Oxford</td><td>n/a</td><td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td></tr><tr><td>Bsoft (ver 1.8.7)</td><td>NIAMS, NIH</td><td>n/a</td><td>bsoft.ws</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF</td><td>n/a</td><td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td></tr></tbody></table>

moyenne de la glycoprotéine d&#39;enveloppe virale pointes de electron cryotomography reconstructions utilisant jsubtomo

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Les virus enveloppés utilisent des glycoprotéines membranaires sur leur surface d&#39;entrée de médiation dans des cellules hôtes. Analyse la structure tridimensionnelle de ces glycoprotéine &#39;pointes&#39; est souvent techniquement difficile, mais important pour la compréhension de la pathogenèse virale et dans la conception de médicaments. Ici, un protocole est présenté pour virale détermination de la structure de pointe par le biais de la moyenne de calcul de données cryo-tomographie électronique. Cryo-tomographie est une technique en microscopie électronique utilisée pour obtenir des reconstructions tridimensionnelles tomographiques de volume, ou des tomographies, des échantillons biologiques tels que les virus polymorphes de la membrane dans un état quasi-native, congelé-hydraté. Ces tomographies révèlent des structures d&#39;intérêt en trois dimensions, mais à faible résolution. Moyenne de calcul de sous-volumes, ou sous-tomographies, est nécessaire pour obtenir plus de détails de la résolution de la répétition des motifs structuraux, tels que pointes de glycoprotéines virales. Une approche de calcul détaillé pour aligning et moyenne sous-tomographies à l&#39;aide du logiciel Jsubtomo est décrite. Cette approche permet la visualisation de la structure de pointes de glycoprotéines virales à une résolution de l&#39;ordre de 20-40 Å et l&#39;étude de l&#39;étude de la hausse des commandes pic-à-pic interactions sur la membrane du virion. Les résultats typiques sont présentés pour le virus Bunyamwera, un virus enveloppé de la famille des Bunyaviridae. Cette famille est un groupe structurellement divers agents pathogènes constituent une menace pour la santé humaine et animale.

Nous démontrons l&#39;application de la moyenne flux de travail sous-tomographie décrit ci-dessus pour le complexe de la glycoprotéine d&#39;enveloppe du virus Bunyamwera (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) en utilisant un ensemble de données publiées antérieurement mis 24. paramètres de collecte de données et le raffinement sont listés dans le Tableau 1. Une tomographie représentatif est montré à la figure 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Paramètre (unité) </td><td> Valeur </td></tr><tr><td> La collecte des données </td><td></td></tr><tr><td> Tension (kV) </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Grossissement calibré (X) </td><td> 111000 </td></tr><tr><td> La taille du pixel (A) </td><td> 5.4 </td></tr><tr><td> Dose estimée (e - / Å 2) </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Underfocus (pm) </td><td> 4,0-4,5 </td&gt; </tr><tr><td> Zéro FCE (A) une </td><td> 26-30 </td></tr><tr><td> Plage d&#39;inclinaison (°) </td><td> -60 À 60 </td></tr><tr><td> Tilt échantillonnage (°) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Données et raffinement </td><td></td></tr><tr><td> Tomographies </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Virions </td><td> 29 </td></tr><tr><td> Graines par virion </td><td> 106 </td></tr><tr><td> Nombre total de graines </td><td> 3074 </td></tr><tr><td> Spikes détectés </td><td> 1346 </td></tr><tr><td> Spikes après de supprimer les chevauchements </td><td> 1401 </td></tr><tr><td> Spikes après sélection sur la base de corrélation croisée </td><td> 1022 </td></tr><tr><td> Spikes inclus dans la moyenne finale </td><td> 1022 </td></tr><tr><td> Symétrie </td><td> C3 </td></tr><tr><td> Échantillonnage angulaire (°) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Résolutiongamme utilisée dans le raffinement (Å) </td><td> 42-334 </td></tr><tr><td> Résolution estimation finale (A) b </td><td> 35 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: la collecte des données et statistiques Bunyamwera de raffinement. un FCT, la fonction de transfert de contraste. b Calculé à l&#39;aide de Fourier coque corrélation entre deux structures indépendamment raffinés au seuil de 0,143. <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" /> Figure 2:. Slice par une tomographie de virions Bunyamwera Plusieurs vues de côté pic évident dans la périphérie de chaque virion sont indiqués par des flèches. La tomographie a été filtré passe-bas à 60 Å. Barre d&#39;échelle de 100 nm. Tout d&#39;abord, nous avons affiné un modèle initial en utilisant 205 pointes, récolté manuellement ( <strong&gt; Figure 3). Trois symétrie du centre-pic le plus évident était sans appliquer de symétrie (figure 3B) et a été imposée dans les rondes subséquentes de raffinement (figure 3C). Pour détecter automatiquement tous les pics sur la surface du virion, nous avons généré 106 graines de chaque virion au rayon de 43 nm et un espacement de 20 degrés (figure 4A) et de façon itérative affiné leurs positions par rapport à la membrane (figure 4B). <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" /> Figure 3: Le raffinement de la structure de la matrice initiale. (A) cylindrique en moyenne (C100) modèle construit à partir des positions définies manuellement de pointes. (B) En moyenne densité après cinq tours de raffinement sans symétrie (C1) a imposé affiche une hausse de trois foiscaractéristiques symétriques. La résolution du modèle est de 48 Å. (C) moyenne de la pointe a été résolu à 41 Å après cinq tours de raffinement avec triple symétrie. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" /> Figure 4:. Raffinement des graines AB) Un sous-ensemble de graines avant (A) et après (B) raffinement sont présentés sur une densite de virion de la figure 2 Graines à (B) ont été codés par couleur en fonction de la transversale respective. coefficients de corrélation (bleu, faible corrélation, le rouge, haute corrélation). Les meilleurs corrélation glycoprotéine correctifs de pointes (top 75% après la suppression des chevauchements; ~ 1000 pointes) ont été utilisés pour calculer la moyenne finale. La moyenne a été résolu à 35 Å de résolution (Figure 5). Il a révélé une structure de pointe trimérique dans le milieu, enOutre une contribution de six crampons voisins. Modèles composites des virions, calculés en plaçant la structure en des positions connues, ont révélé placement des pointes sur la surface du virion (Figure 6A). De temps en temps, des taches commandés localement des pointes étaient évidents (figure 6B). <img alt="Figure 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" /> Figure 5: Structure raffinée d&#39;un patch de la couche de pointes de glycoprotéines après template matching. (AB) Deux cartes «même» et «bizarre», reconstruites à partir de deux moitiés des données sont présentées. Les deux cartes montrent un degré remarquable de similitude, la vérification de l&#39;valable jusqu&#39;au de l&#39;approche. L&#39;orientation autour de l&#39;axe de temps est différente de la pointe que les deux cartes ont été reconstruits entièrement indépendamment l&#39;un de l&#39;autre. (C) moyenne des deux cartes est indiqué enla résolution finale de 35 Å. <img alt="Figure 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" /> Figure 6: Placement des pointes sur le virion Bunyamwera. (A) du modèle composite d&#39;un virion. Voir vecteurs (bâtons) indiquent les orientations des pointes. Les couleurs indiquent la corrélation entre chaque pic et la structure du modèle (bleu, une faible corrélation, le rouge, forte corrélation). (B) Un gros plan d&#39;une pièce ordonnée de pointes.

Une approche est présentée pour déterminer les structures des complexes de glycoprotéines membranaires virales en utilisant une combinaison de cryotomographie électronique et de calcul de la moyenne par sous-tomogramme avec le progiciel de calcul Jsubtomo.

Moyenne de la glycoprotéine d&#39;enveloppe virale Pointes de Electron Cryotomography reconstructions utilisant Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les structures des complexes de glycoprotéines présents à la surface des virus enveloppés. Cela est réalisé en localisant d'abord les particules virales dans les volumes tomographiques précédemment calculés à partir de données de microscopie électronique cryogénique. La deuxième étape consiste à créer deux modèles initiaux statistiquement indépendants des complexes de glycoprotéines en utilisant un sous-ensemble de données défini manuellement.Ensuite, ces modèles sont affinés puis utilisés pour détecter automatiquement tous les complexes de glycoprotéines sur les particules virales. La dernière étape consiste à affiner la structure du complexe de glycoprotéines en utilisant l'ensemble complet des données. Enfin, des outils de visualisation moléculaire sont utilisés pour interpréter la structure finale.L'analyse structurale tridimensionnelle de ces protéines spike glycosylées est d'une valeur inestimable pour comprendre la pathogenèse virale ainsi que pour la conception de médicaments. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la cristallographie aux rayons X, est qu'elle permet de déterminer les structures de protéines membranaires dans leur environnement membranaire naturel. Cette technique peut contribuer à aborder des questions clés en biologie structurale.Par exemple, la structure de nombreux virus contenant une membrane. Bien que cette technique puisse fournir des informations sur les complexes de glycoprotéines présents dans ces virus, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme les protéines membranaires incorporées dans des liposomes. La procédure sera démontrée par deux membres de mon équipe, Slee et David Bittel.Pour commencer, ouvrez un fichier autogramme dans B show. Sélectionnez manuellement les particules virales sur les clichés en définissant les coordonnées du centre d'une particule virale à l'aide de l'outil de sélection des particules. Répétez cette étape jusqu'à ce que toutes les variantes aient été traitées.Enregistrez les coordonnées du virus dans un fichier star. Poursuivez en répétant ce processus pour tous les tomos. Exécutez ensuite J sub tomo py en mode extraction afin d'extraire les sous-volumes de vari dans des fichiers de volumes individuels, en utilisant les fichiers star enregistrés comme fichiers d'entrée pour générer deux modèles initiaux indépendants.Tout d'abord, ouvrez le fichier de carte de sous-volume ovarien. Affichez dans B. Sélectionnez un sous-ensemble de pics dans les sous-volumes Varian en définissant les coordonnées centrales d'un pic à l'aide de l'outil de sélection de particules accessible via la fenêtre de la boîte à outils.Répétez cette étape jusqu'à ce que toutes les pointes clairement distinctes aient été traitées. Enregistrez les coordonnées des pointes dans un fichier star. Répétez cette étape jusqu'à ce qu'environ 200 pointes de glycoprotéines aient été traitées.Après avoir attribué les vues aux varians comme décrit dans le protocole textuel, créez un masque dans l'espace réel à l'aide de J sub tomo. Créez mask py. Ensuite, générez un masque dans l'espace réciproque à l'aide de J sub tomo create wedge mask py.Le masque de l'espace réciproque est utilisé pour exclure les régions situées dans la zone du coin manquant, résultant d'une acquisition de données tomographiques selon un seul axe. Ensuite, créez deux moyennes initiales en utilisant J.Sub tomo pour générer des moyennes. PY en utilisant un fichier de sélection enregistré comme fichier d'entrée.Utilisez l'itération pour réduire le bruit dans les moyennes initiales en alignant et en moyennant de manière itérative les deux modèles précédemment générés avec J sub-tomo itérer or PY. Les détails concernant les deux étapes de ce processus sont disponibles dans le protocole écrit. Évaluez le degré de symétrie de la structure en examinant le fichier de carte filtrée passe-bas résultant dans kyira. Par exemple, si la protubérance est un complexe trimérique, une symétrie triple doit être apparente.Poursuivez le raffinement de la structure tel que décrit dans le protocole textuel. Ensuite, générez des points initiaux répartis uniformément à la surface de Varian pour la correspondance de modèles et attribuez un vecteur de vue initial aux points initiaux en exécutant JVs py. Utilisez les fichiers star précédemment générés comme fichiers d'entrée afin de produire environ 1,5 fois plus de points initiaux que le nombre attendu de pics.Ce vecteur de vue approxime la direction de la pointe la plus proche de chaque point semence. Ensuite, générer deux moyennes indépendantes de la surface du virus comme précédemment. Puis affiner la position des points semences comme indiqué dans le protocole textuel.Enfin, générez les fichiers de marqueurs com à partir des fichiers star de graines affinés en utilisant jvs.py. Examinez les graines en ouvrant les fichiers CMM et les fichiers de carte de virion associés. Dans kyira.Veillez à ce que les graines affinées soient correctement alignées par rapport à la membrane virale. Les marqueurs affinés peuvent être colorés en fonction de leurs coefficients de corrélation croisée afin de localiser automatiquement toutes les pointes dans les sous-volumes Varian à l'aide d'une correspondance de modèle locale autour des graines affinées, puis d'aligner et de moyenner les pointes localisées. Utilisez les moyennes obtenues à partir d'un sous-ensemble de pointes sélectionnées manuellement comme modèles initiaux. Des détails supplémentaires sur ce processus sont disponibles dans le protocole écrit. Pour visualiser les résultats, ouvrez la structure affinée de la pointe dans Kyira à des fins de visualisation.Procédez au positionnement des structures atomiques. Ensuite, créez un modèle composite du virion à l'aide de j Subo Create model DO py. Enfin, ouvrez le modèle composite pour la visualisation dans kyira.Le modèle initial a été affiné à l'aide de 205 pics sélectionnés manuellement. Une symétrie triple a été observée au niveau du pic central sans application de symétrie préalable, et cette symétrie a été imposée lors des tours d'affinement suivants afin de détecter manuellement tous les pics présents à la surface des varicelles. 106 germes ont été générés pour chaque viron à un rayon de 43 nanomètres et avec un espacement de 20 degrés, et leurs positions ont été affinées itérativement par rapport à la membrane.Les régions de glycoprotéines en forme de pic présentant la meilleure corrélation ont été utilisées pour calculer la moyenne finale. La résolution moyenne atteinte était de 35 angströms. Elle a révélé une structure en trimère au centre du pic, ainsi qu'une contribution partielle provenant de six pics voisins.Des modèles composites des varis ont été calculés en plaçant la structure dans les positions connues, révélant ainsi la disposition des pics à la surface des Varian. Parfois, des régions localement ordonnées de pics étaient visibles. Lors de l'application de cette procédure, il est important d'utiliser uniquement les meilleures données et de vérifier attentivement tous les résultats intermédiaires.Après avoir suivi cette procédure, des structures obtenues par cristallographie aux rayons X peuvent être ajustées dans la moyenne finale afin d'obtenir une vue plus précise des interactions entre protéines. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment moyenner des structures de glycoprotéines de l'enveloppe virale à l'aide de J Omo.

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