Moyenne de la glycoprotéine d'enveloppe virale Pointes de Electron Cryotomography reconstructions utilisant Jsubtomo

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les structures des complexes de glycoprotéines présents à la surface des virus enveloppés. Cela est réalisé en localisant d'abord les particules virales dans les volumes tomographiques précédemment calculés à partir de données de microscopie électronique cryogénique. La deuxième étape consiste à créer deux modèles initiaux statistiquement indépendants des complexes de glycoprotéines en utilisant un sous-ensemble de données défini manuellement.

Ensuite, ces modèles sont affinés puis utilisés pour détecter automatiquement tous les complexes de glycoprotéines sur les particules virales. La dernière étape consiste à affiner la structure du complexe de glycoprotéines en utilisant l'ensemble complet des données. Enfin, des outils de visualisation moléculaire sont utilisés pour interpréter la structure finale.

L'analyse structurale tridimensionnelle de ces protéines spike glycosylées est d'une valeur inestimable pour comprendre la pathogenèse virale ainsi que pour la conception de médicaments. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la cristallographie aux rayons X, est qu'elle permet de déterminer les structures de protéines membranaires dans leur environnement membranaire naturel. Cette technique peut contribuer à aborder des questions clés en biologie structurale.

Par exemple, la structure de nombreux virus contenant une membrane. Bien que cette technique puisse fournir des informations sur les complexes de glycoprotéines présents dans ces virus, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme les protéines membranaires incorporées dans des liposomes. La procédure sera démontrée par deux membres de mon équipe, Slee et David Bittel.

Pour commencer, ouvrez un fichier autogramme dans B show. Sélectionnez manuellement les particules virales sur les clichés en définissant les coordonnées du centre d'une particule virale à l'aide de l'outil de sélection des particules. Répétez cette étape jusqu'à ce que toutes les variantes aient été traitées.

Enregistrez les coordonnées du virus dans un fichier star. Poursuivez en répétant ce processus pour tous les tomos. Exécutez ensuite J sub tomo py en mode extraction afin d'extraire les sous-volumes de vari dans des fichiers de volumes individuels, en utilisant les fichiers star enregistrés comme fichiers d'entrée pour générer deux modèles initiaux indépendants.

Tout d'abord, ouvrez le fichier de carte de sous-volume ovarien. Affichez dans B. Sélectionnez un sous-ensemble de pics dans les sous-volumes Varian en définissant les coordonnées centrales d'un pic à l'aide de l'outil de sélection de particules accessible via la fenêtre de la boîte à outils.

Répétez cette étape jusqu'à ce que toutes les pointes clairement distinctes aient été traitées. Enregistrez les coordonnées des pointes dans un fichier star. Répétez cette étape jusqu'à ce qu'environ 200 pointes de glycoprotéines aient été traitées.

Après avoir attribué les vues aux varians comme décrit dans le protocole textuel, créez un masque dans l'espace réel à l'aide de J sub tomo. Créez mask py. Ensuite, générez un masque dans l'espace réciproque à l'aide de J sub tomo create wedge mask py.

Le masque de l'espace réciproque est utilisé pour exclure les régions situées dans la zone du coin manquant, résultant d'une acquisition de données tomographiques selon un seul axe. Ensuite, créez deux moyennes initiales en utilisant J.Sub tomo pour générer des moyennes. PY en utilisant un fichier de sélection enregistré comme fichier d'entrée.

Utilisez l'itération pour réduire le bruit dans les moyennes initiales en alignant et en moyennant de manière itérative les deux modèles précédemment générés avec J sub-tomo itérer or PY. Les détails concernant les deux étapes de ce processus sont disponibles dans le protocole écrit. Évaluez le degré de symétrie de la structure en examinant le fichier de carte filtrée passe-bas résultant dans kyira. Par exemple, si la protubérance est un complexe trimérique, une symétrie triple doit être apparente.

Poursuivez le raffinement de la structure tel que décrit dans le protocole textuel. Ensuite, générez des points initiaux répartis uniformément à la surface de Varian pour la correspondance de modèles et attribuez un vecteur de vue initial aux points initiaux en exécutant JVs py. Utilisez les fichiers star précédemment générés comme fichiers d'entrée afin de produire environ 1,5 fois plus de points initiaux que le nombre attendu de pics.

Ce vecteur de vue approxime la direction de la pointe la plus proche de chaque point semence. Ensuite, générer deux moyennes indépendantes de la surface du virus comme précédemment. Puis affiner la position des points semences comme indiqué dans le protocole textuel.

Enfin, générez les fichiers de marqueurs com à partir des fichiers star de graines affinés en utilisant jvs.py. Examinez les graines en ouvrant les fichiers CMM et les fichiers de carte de virion associés. Dans kyira.

Veillez à ce que les graines affinées soient correctement alignées par rapport à la membrane virale. Les marqueurs affinés peuvent être colorés en fonction de leurs coefficients de corrélation croisée afin de localiser automatiquement toutes les pointes dans les sous-volumes Varian à l'aide d'une correspondance de modèle locale autour des graines affinées, puis d'aligner et de moyenner les pointes localisées. Utilisez les moyennes obtenues à partir d'un sous-ensemble de pointes sélectionnées manuellement comme modèles initiaux. Des détails supplémentaires sur ce processus sont disponibles dans le protocole écrit. Pour visualiser les résultats, ouvrez la structure affinée de la pointe dans Kyira à des fins de visualisation.

Procédez au positionnement des structures atomiques. Ensuite, créez un modèle composite du virion à l'aide de j Subo Create model DO py. Enfin, ouvrez le modèle composite pour la visualisation dans kyira.

Le modèle initial a été affiné à l'aide de 205 pics sélectionnés manuellement. Une symétrie triple a été observée au niveau du pic central sans application de symétrie préalable, et cette symétrie a été imposée lors des tours d'affinement suivants afin de détecter manuellement tous les pics présents à la surface des varicelles. 106 germes ont été générés pour chaque viron à un rayon de 43 nanomètres et avec un espacement de 20 degrés, et leurs positions ont été affinées itérativement par rapport à la membrane.

Les régions de glycoprotéines en forme de pic présentant la meilleure corrélation ont été utilisées pour calculer la moyenne finale. La résolution moyenne atteinte était de 35 angströms. Elle a révélé une structure en trimère au centre du pic, ainsi qu'une contribution partielle provenant de six pics voisins.

Des modèles composites des varis ont été calculés en plaçant la structure dans les positions connues, révélant ainsi la disposition des pics à la surface des Varian. Parfois, des régions localement ordonnées de pics étaient visibles. Lors de l'application de cette procédure, il est important d'utiliser uniquement les meilleures données et de vérifier attentivement tous les résultats intermédiaires.

Après avoir suivi cette procédure, des structures obtenues par cristallographie aux rayons X peuvent être ajustées dans la moyenne finale afin d'obtenir une vue plus précise des interactions entre protéines. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment moyenner des structures de glycoprotéines de l'enveloppe virale à l'aide de J Omo.