Name: ADN purifié par affinité Chip (DAP-puce) Méthode pour déterminer les cibles génétiques pour bactérienne Deux systèmes de réglementation composants (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Découvrez la méthode DAP-chip pour identifier les sites de liaison génomiques des régulateurs de réponse bactériens. Cette technique in vitro permet d'étudier les réseaux de régulation génique sans connaître les signaux d'activation.

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Nous remercions Amy Chen pour son aide dans la préparation pour le tournage de la vidéo et pour démontrer la technique. Ce travail mené par ENIGMA: écosystèmes intégrés et des réseaux avec des gènes et des assemblages moléculaires (http://enigma.lbl.gov), un programme scientifique Secteur d&#39;intérêt au Lawrence Berkeley National Laboratory, a été pris en charge par le Bureau de la science, Bureau du biologique et recherche sur l&#39;environnement, du Département américain de l&#39;Énergie sous contrat DE-AC02-05CH11231.

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<li>Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+comparison+of+Leu3+binding+in+vitro+and+in+vivo+reveals+the+importance+of+nucleosome+occupancy+in+target+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection.</a> Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont pas de conflit d&#39;intérêt à divulguer.

La méthode DAP-puce décrit ici a été utilisé avec succès pour déterminer les cibles génétiques pour plusieurs RI dans Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 dont un est représenté ici comme un résultat représentatif. Pour RR DVU3023, le choix d&#39;une cible de gène candidat était simple. DVU3025 est située immédiatement en aval du gène de la RR, et les gènes de la RR et cible sont conservées dans plusieurs espèces Desulfovibrio, et en outre DVU3025 a un promoteur de sigma54-dépendante prédi...

La capacité des bactéries à survivre et à prospérer dépend de façon critique sur la façon dont ils sont capables de percevoir et de répondre aux perturbations de leur environnement, et ce, à son tour dépend de leurs systèmes de transduction du signal. Le nombre de systèmes de signalisation une bactérie de encode a été appelé son &quot;QI microbienne&quot; et peut être une indication de la variabilité de son environnement et de sa capacité à détecter des signaux multiples et d&#39;affiner sa réponse 1. Deux systèmes de transduction de signaux composants (TCS) sont des systèmes de signalisation les plus répandues utilisées par les bactéries, et ils sont constitués d&#39;une histidine kinase (HK) qui détecte le signal externe et le transmet par l&#39;intermédiaire de la phosphorylation d&#39;un régulateur de réponse effectrice (RR) 2. RR peuvent avoir une variété de domaines de la production et donc différents modes effectrices, mais la réponse la plus fréquente est la régulation transcriptionnelle via un domaine 1 liaison à l&#39;ADN. Les signaux détectés et les fonctions correspondantes du canal déférentt majorité des TCS restent inconnus. Bien que des procédés in vivo tels que ChIP-chip sont couramment utilisés pour la détermination des sites de liaison de facteurs de transcription génomiques 3, ils ne peuvent être utilisés pour les deux RR bactériennes du système composant si les conditions ou les signaux d&#39;activation sont connus. Souvent, les signaux environnementaux qui activent un TCS sont plus difficiles à déterminer que leurs gènes cibles. La puce à ADN in vitro dosage à base décrit ici peut être utilisé pour déterminer rapidement et efficacement les gènes cibles et de prévoir des fonctions de TCS. Cet essai tire parti du fait que les RR peuvent être phosphorylés et donc activés in vitro à l&#39;aide de petites molécules telles que des donneurs de phosphate d&#39;acétyle 4. Dans ce procédé, appelé DAP-puce pour l&#39;ADN-affinité-puce purifié (Figure 1), le gène de la RR d&#39;intérêt est clone avec un His-tag dans E. coli, et une protéine marquée par la suite purifié est autorisé à bie à la tonte de l&#39;ADN génomique. L&#39;ADN lié à une protéine est ensuite enrichi par affinité purification, l&#39;ADN enrichi et entrée sont amplifiés, marqué par fluorescence, mis en commun et hybride à une gamme de carrelage qui est faite sur mesure pour l&#39;organisme d&#39;intérêt (figure 1). expériences de puces à ADN sont soumis à des artefacts et donc des mesures supplémentaires sont utilisés pour optimiser le dosage. Une telle démarche est de tenter de déterminer une cible pour le RR à l&#39;étude en utilisant des tests électrophorétique de décalage de mobilité (EMSA) (voir flux de travail dans la figure 2). Puis, après liaison à l&#39;ADN génomique et les étapes de la DAP, l&#39;ADN lié à une protéine et d&#39;entrée sont examinés par qPCR pour déterminer si la cible positif est enrichi dans la fraction liée aux protéines par rapport à la fraction d&#39;entrée, confirmant ainsi les conditions optimales de liaison pour l&#39; RR (figure 2). Après tableau hybridation, les données sont analysées pour trouver des pics de signal d&#39;intensité plus élevée indiquant loci génomiques où la protéine hannonce lié. Les fonctions peuvent être prévus pour la RR en fonction des objectifs de gènes obtenus. Les loci génomiques cibles sont utilisés pour prédire motifs de sites de liaison, qui sont ensuite validés expérimentalement à l&#39;aide EMSA (Figure 2). Les prédictions fonctionnelles et cibles génétiques pour la RR peuvent ensuite être étendues aux espèces qui codent RR orthologues en scannant les génomes pour des motifs de liaison similaires (figure 2) étroitement liés. La méthode DAP-puce peut fournir une mine d&#39;informations pour un TCS où il n&#39;y avait auparavant aucune. Le procédé peut également être utilisé pour n&#39;importe quel régulateur transcriptionnel si la protéine peut être purifiée et des conditions de liaison d&#39;ADN peut être déterminée, et pour n&#39;importe quel organisme d&#39;intérêt avec une séquence génomique disponible. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. L&#39;-puce ADN purifié par affinité (DAP-puce) stratégie 7. Le gène de la RR de l&#39;organisme d&#39;intérêt est cloné avec un His-tag carboxy-terminale dans un E. coli souche d&#39;expression. Protéine purifiée marquée par His est activée par phosphorylation avec du phosphate d&#39;acétyle, et on le mélange avec de l&#39;ADN génomique cisaillé. Une aliquote de la réaction de liaison est enregistré sous forme d&#39;ADN d&#39;entrée, tandis que le reste est soumis à une purification par affinité en utilisant une résine Ni-NTA. L&#39;entrée et l&#39;ADN de RR lié sont génome amplifié, et marqué avec Cy3 et Cy5, respectivement. L&#39;ADN marqué est mis en commun et hybridée à une matrice de carrelage, qui est ensuite analysé afin de déterminer les gènes cibles. Figure modifiée et réimprimée en utilisant la licence creative commons de 7. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2. Sommaire des flux de travail. Pour toute protei marqué purifién, commencer par déterminer une cible en utilisant l&#39;EMSA. Autoriser protéine à lier l&#39;ADN génomique et l&#39;ADN purifier par affinité (DAP) et l&#39;ensemble du génome amplifier (WGA), le ADN enrichi et entrée. Si une cible du gène est connue, utiliser qPCR pour s&#39;assurer que la cible connue est enrichi dans la fraction liée aux protéines. Si aucune cible pourrait être déterminée, passez directement à l&#39;étiquetage de l&#39;ADN et l&#39;hybridation tableau. Si l&#39;enrichissement par qPCR pas pu être observée, puis répétez la liaison protéine-ADNg et étapes DAP-WGA utilisant différentes quantités de protéines. Utiliser l&#39;analyse de réseau pour trouver les pics et les faire correspondre à cibler des gènes. Utiliser les régions en amont de gènes cibles pour prédire motifs de site de liaison. Valider les motifs expérimentalement à l&#39;aide EMSA. Utilisez le motif de scanner les génomes d&#39;espèces apparentées codant orthologues de la RR à l&#39;étude, et de prévoir les gènes ciblés dans ces espèces. Sur la base des cibles de gènes obtenus, la fonction physiologique de la RR et ses orthologues peut être prédite. Figure modifié et reproduit à l&#39;aide du c créativeommons licence de 7.

<table><tbody><tr><td>Colonne HisTrapFF (colonne Ni-Sepharose)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5255-01</td><td></td></tr><tr><td>Akta explorer (instrument FPLC)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Colonne de dessalage</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Kit d’extraction de gel</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotides marqués à la biotine</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>6 % polyacrylamide-0.5x TBE mini gel retardateur d’ADN préfabriqué</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, États-Unis</td><td>EC63652BOX</td><td>Alternativement, vous pouvez verser votre propre gel.</td></tr><tr><td>Membrane en nylon</td><td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>INYC00010</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Cellule de transfert électrophorétique semi-sèche</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Papier blot extra épais, 8 x 13,5 cm</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3967</td><td></td></tr><tr><td>Réticulant UV Modèle XL-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>Kit de détection chimiluminescente d’acide nucléique (Pierce)</td><td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, États-Unis</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Résine d’agarose Ni-NTA</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, États-Unis</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex Kit d’amplification du génome entier (tampon de fragmentation, tampon de préparation de bibliothèque, solution de stabilisation de bibliothèque, enzyme de préparation de bibliothèque, mélange maître d’amplification 10x, WGA polymérase)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis</td><td>WGA2-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>Thermo Scientific, Wilmington, DE, États-Unis</td><td>Pour la quantification de l’ADN</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta Sybr Green SuperMix, avec ROX</td><td>Quanta biosciences</td><td>95055-500</td><td>Tout mélange Sybr Green PCR peut être utilisé</td></tr><tr><td>Film thermoscellable PlateMax Ultra transparent pour qPCR</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>Microplaque PCR transparente à profil bas à 96 puits</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>PCR-96-LP-AB-C</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems StepOne Plus Système de PCR en temps réel</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, États-Unis</td><td>4376600</td><td>N’importe quel système de PCR en temps réel peut être utilisé</td></tr><tr><td>Kit de purification par PCR Qiaquick</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28104</td><td>Tout kit de nettoyage par PCR peut être utilisé</td></tr><tr><td>avec des nonamères marqués Cy3/Cy5</td><td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, États-Unis</td><td>N46-0001, N46-0002</td><td></td></tr><tr><td>Klenow polymérase 50 000 U/ml, 3'-5' exo-</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>M0212M</td><td></td></tr><tr><td>Système d’hybridation</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, États-Unis n</td><td>/A</td><td>Cette société ne fabrique plus de matrices ou d’articles connexes, de sorte qu’il faudra utiliser d’autres sources telles qu’Agilent ou Affymetrix.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, États-Unis Kit d’hybridation</td><td></td></tr><tr><td>(2x tampon d’hybridation, composant d’hybridation A, oligo d’alignement)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, États-Unis d’Amérique</td><td>(</td><td></td></tr><tr><td>10x tampon de lavage I, II, III, 1 M DTT)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, États-Unis d’Amérique Scanner</td><td></td> de <td></td></tr> microréseaux <tr><td>GenePix 4200A</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td>Ce modèle a été remplacé par des</td><td></td>modèles supérieurs</tr><tr><td>Logiciel de microarray GenePix Pro</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nimblescan v.2.4, Logiciel d’analyse de puce ChIP</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

adn purifié par affinité chip (dap-puce) méthode pour déterminer les cibles génétiques pour bactérienne deux systèmes de réglementation composants

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Les méthodes in vivo tels que ChIP-chip sont des techniques bien établies utilisées pour déterminer les cibles mondiales de gènes pour des facteurs de transcription. Cependant, ils sont d&#39;une utilité limitée dans l&#39;exploration de deux systèmes de réglementation composants bactériens avec des conditions d&#39;activation non caractérisés. De tels systèmes régulent la transcription seulement quand elle est activée en présence de signaux uniques. Etant donné que ces signaux sont souvent inconnus, le procédé in vitro de puces à ADN située à décrit dans cet article vidéo peut être utilisée pour déterminer des cibles de gènes et des sites de liaison pour les régulateurs de réponse. Cette méthode puce ADN purifié par affinité peut être utilisée pour n&#39;importe quel régulateur purifiée dans un organisme avec un génome séquencé. Le protocole consiste à permettre la protéine marquée purifiée à se lier à l&#39;ADN génomique cisaillée et ensuite la purification par affinité de l&#39;ADN lié à une protéine, suivie par le marquage fluorescent de l&#39;ADN et l&#39;hybridation à un réseau de carrelage personnalisé. Précédentes étapes qui peuvent être utilisés pour optimiser le dosage de spécificationc régulateurs sont également décrits. Les pics générés par l&#39;analyse des données du tableau sont utilisés pour prédire motifs de sites de liaison, qui sont ensuite validés expérimentalement. Les prédictions de motifs peuvent être utilisés en outre pour déterminer les gènes cibles de régulateurs de réponse orthologues d&#39;espèces étroitement apparentées. Nous démontrons l&#39;applicabilité de ce procédé en déterminant les gènes cibles et de motifs de site de liaison et la prédiction ainsi la fonction d&#39;un régulateur de réponse DVU3023 de sigma54-dépendante de l&#39;environnement dans la bactérie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

La méthode ci-dessus a été appliquée pour déterminer les gènes cibles mondiales des RR dans le sulfate de modèle réduisant bactérie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Ce micro-organisme a un grand nombre de TCS représenté par plus de 70 RI, ce qui indique la grande variété de signaux possibles qui détecte et répond à. Analyses in vivo sur les fonctions de ces systèmes de signalisation sont difficiles à réaliser étant donné que leurs signaux, et donc les conditions d&#39;activation sont ...

Cet article vidéo décrit une méthode de puces à ADN sur la base in vitro afin de déterminer les gènes cibles et des sites de liaison pour deux régulateurs de réponse du système de composants.

ADN purifié par affinité Chip (DAP-puce) Méthode pour déterminer les cibles génétiques pour bactérienne Deux systèmes de réglementation composants

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer les sites de fixation génomique des régulateurs de réponse bactériens à deux composants en utilisant un test in vitro basé sur une puces à ADN. Cette approche consiste à cloner et purifier une protéine régulatrice de réponse marquée, à l'activer par phosphorylation in vitro, puis à identifier un gène cible à l'aide de tests de migration en électrophorèse sur gel afin d'utiliser ce dernier comme témoin positif pour les étapes ultérieures de la puce à ADN. Dans une deuxième étape, la protéine régulatrice de réponse purifiée est mélangée avec l'ADN génomique, ce qui permet de séparer l'ADN lié à la protéine de l'ADN initial par purification d'affinité.Ensuite, l'ADN lié aux protéines et l'ADN témoin sont amplifiés par PCR quantitative, puis vérifiés afin de confirmer l'enrichissement de la cible génique du contrôle positif dans la fraction liée aux protéines, marqués de manière fluorescente, regroupés et hybridés sur une puces à ADN en recouvrement total. Afin de déterminer les sites d'interaction génomiques du régulateur de réponse, les résultats indiquent les gènes les plus susceptibles d'être régulés par le régulateur de

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Dans cette vidéo, nous démontrons la technique d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les sites de liaison aux protéines sur des régions spécifiques de l’ADN génomique des cellules précurseurs d’oligodendrocytes via l’immunoprécipitation sélective de fragments de chromatine liés aux protéines. Cette méthode permet d’étudier l’interaction de plusieurs protéines régulatrices, y compris les facteurs de transcription impliqués dans la régulation des gènes.

Immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les sites de liaison aux protéines cibles sur l’ADN génomique

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Dosage de la répression génique rapporteure pour étudier la régulation translationnelle d’un gène cible

Cette vidéo présente une méthode pour détecter les souches cyanobactériennes dans un échantillon environnemental à l’aide d’une puce à microréseaux d’anticorps. Les échantillons porteurs de diverses bactéries interagissent avec les anticorps imprimés, et l’immunomarquage avec des anticorps anti-cyanobactéries marqués au fluorophore révèle la présence de souches cyanobactériennes spécifiques par fluorescence à des endroits distincts.

Technique de détection de souches cyanobactériennes à l’aide d’une puce à microréseau d’anticorps

Nous avons développé une plateforme microfluidique pour des tests rapides de sensibilité aux antibiotiques. Le fluide est passé à grande vitesse sur les bactéries immobilisées au fond d’un canal microfluidique. En présence de stress et d’antibiotiques, les souches sensibles de bactéries meurent rapidement. Cependant, les bactéries résistantes peuvent survivre à ces conditions stressantes.

Tests de sensibilité aux antibiotiques induits par le stress sur une puce

Nous décrivons ici un essai en couplant l'identification ADN adénine méthyltransférase (DamID) pour le séquençage à haut débit (DamID-seq). Cette méthode améliorée offre une résolution plus élevée et une plage dynamique plus large, et permet l'analyse des données DamID-Seq en conjonction avec d'autres données de séquençage à haut débit tels que ChIP-seq, ARN-Seq, etc.

DamID-seq: L&#39;échelle du génome Cartographie des protéine-ADN Interactions par séquençage à haut débit de fragments d&#39;ADN adénine-méthylé

Nous présentons un plan stratégique et un protocole pour identifier les variants génétiques non codants affectant la liaison à l’ADN du facteur de transcription (TF). Un protocole expérimental détaillé est fourni pour l’analyse du test de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) et du test de précipitation d’affinité de l’ADN (DAPA) de la liaison de l’ADN TF dépendant du génotype.

Le dépistage de la fonctionnelle non-codant des variants génétiques utilisant mobilité électrophorétique Maj Assay (EMSA) et l&#39;ADN-affinité Précipitations Assay (DAPA)

Leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la leucémie la plus courante dans le monde occidental. Facteurs de transcription NFAT sont des régulateurs importants de développement et l’activation de nombreux types de cellules. Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) dans les cellules humaines de CLL pour identifier les gènes de la nouvelle cible de NFAT2.

Une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les gènes cibles de nouveaux NFAT2 dans la leucémie lymphoïde chronique

Dans cette méthode, nous quantifions l'affinité de liaison des protéines de liaison d'ARN (RBPs) aux emplacements de liaison de cognate et non-cognate utilisant un simple, vivant, test de journaliste dans les cellules bactériennes. L'exemple est basé sur la répression d'un gène journaliste.

Un jeu d'enfant pour quantifier la liaison protéine-ARN chez les bactéries

L'immunoprécipitation de chromatine couplée au séquençage de prochaine génération (ChIP-seq) est une méthode employée pour établir des interactions entre des facteurs de transcription et les séquences génomiques qu'ils contrôlent. Ce protocole décrit les techniques d'exécution du ChIP-seq avec des biofilms bactériens, en utilisant Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm bactérien à titre d'exemple.

Découverte des cibles réglementaires de csgD dans le biofilm de Salmonella utilisant l'immunoprécipitation de chromatine et le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

L’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (DRaCALA) peut être utilisée pour identifier les petites protéines de liaison au ligand d’un organisme à l’aide d’une bibliothèque ORFeome.

Identification des protéines de liaison des petits ligands avec l’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (DRaCALA)

Les nanomachines basées sur DNAzyme peuvent être utilisées pour la détection hautement sélective et sensible des acides nucléiques. Cet article décrit un protocole détaillé pour la conception de nanomachines basées sur DNAzyme avec un cœur de 10 à 23 à l’aide de logiciels libres et leur application dans la détection d’un fragment de virus d’Epstein-Barr à titre d’exemple.

Nanomachines à base de DNAzyme 10-23 pour la reconnaissance des acides nucléiques

Découvrez la méthode DAP-chip pour identifier les sites de liaison génomiques des régulateurs de réponse bactériens. Cette technique in vitro permet d'étudier les réseaux de régulation génique sans connaître les signaux d'activation.

ADN purifié par affinité Chip (DAP-puce) Méthode pour déterminer les cibles génétiques pour bactérienne Deux systèmes de réglementation composants (Vidéo) | JoVE Journal

ADN purifié par affinité Chip (DAP-puce) Méthode pour déterminer les cibles génétiques pour bactérienne Deux systèmes de réglementation composants

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