ADN purifié par affinité Chip (DAP-puce) Méthode pour déterminer les cibles génétiques pour bactérienne Deux systèmes de réglementation composants

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer les sites de fixation génomique des régulateurs de réponse bactériens à deux composants en utilisant un test in vitro basé sur une puces à ADN. Cette approche consiste à cloner et purifier une protéine régulatrice de réponse marquée, à l'activer par phosphorylation in vitro, puis à identifier un gène cible à l'aide de tests de migration en électrophorèse sur gel afin d'utiliser ce dernier comme témoin positif pour les étapes ultérieures de la puce à ADN. Dans une deuxième étape, la protéine régulatrice de réponse purifiée est mélangée avec l'ADN génomique, ce qui permet de séparer l'ADN lié à la protéine de l'ADN initial par purification d'affinité.

Ensuite, l'ADN lié aux protéines et l'ADN témoin sont amplifiés par PCR quantitative, puis vérifiés afin de confirmer l'enrichissement de la cible génique du contrôle positif dans la fraction liée aux protéines, marqués de manière fluorescente, regroupés et hybridés sur une puces à ADN en recouvrement total. Afin de déterminer les sites d'interaction génomiques du régulateur de réponse, les résultats indiquent les gènes les plus susceptibles d'être régulés par le régulateur de réponse étudié, et peuvent être confirmés ultérieurement par des tests de retard électrophorétique (EMSA). Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes telles que le « chip-chip » in vivo réside dans sa possibilité d'utilisation même lorsque les signaux activateurs et les conditions appropriées ne sont pas connus pour les systèmes à deux composants.

Cette méthode revêt une grande importance pour le domaine de la signalisation bactérienne, car la grande majorité des régulateurs présentent des gènes cibles inconnus, et cette méthode permet d'élucider les réseaux régulateurs complexes. Amy Chen, assistante de recherche de mon laboratoire, démontrera cette procédure avant le début de celle-ci.

Purifiez une protéine rr, spécifiquement la protéine DVU 3 0 2 3 exprimée à partir d'un gène DVU 3 0 2 3 cloné. Incubez 0,5 picomole de protéine DVU 3 0 2 3 avec 100 femtomoles d'un substrat d'ADN préparé antérieurement dans une solution tamponnée, jusqu'à un volume total de 20 microlitres. Après avoir mis en place une réaction sans protéine servant de témoin, incubez les réactions à température ambiante sur la paillasse pendant 20 minutes.

Après l'incubation, ajouter cinq microlitres de tampon de charge 5 x aux réactions de liaison. Déposer 18 microlitres de chaque réaction sur un gel mini de polyacrylamide 6 % préparé au préalable dans du TBE 0,5 x et faire migrer à 100 volts pendant deux heures. Une fois la migration terminée, découper une membrane en nylon chargée à la taille du gel et l'imbiber dans du TBE 0,5 x pendant au moins 10 minutes. Ensuite, retirer le gel de la cassette.

Retirez toutes les crêtes du gel et placez le gel et la membrane entre deux papiers filtres épais imbibés de TBE 0,5 X. Insérez le gel et la membrane dans un appareil de transfert semi-sec et faites fonctionner à 20 volts pendant 30 minutes. Ensuite, placez la membrane dans un appareil commercial de réticulation par lumière UV et réglez le temps sur trois minutes ; après avoir révélé le transfert à l’aide d’un kit de détection chimiluminescente, acquérez l’image à l’aide d’un ordinateur relié à une caméra équipée d’un capteur CCD.

Rechercher un décalage de la mobilité du substrat d'ADN en présence du RR, ce qui indique que le RR se lie à l'ADN testé. Ensuite, mélanger deux à trois microgrammes d'ADN génomique partagé avec 0,5 picomole de DVU 3 0 2 3 dans une solution tamponnée. Après incubation de la réaction à 25 degrés Celsius pendant 30 minutes, transférer 10 microlitres de ce mélange dans un tube de 1,5 millilitre et l'étiqueter comme ADN témoin.

Ajouter 30 microlitres de résine aros NTA au nickel dans un tube microfuge de 0,6 millilitre. Centrifuger l'échantillon à 100 ×g pendant une minute afin de ramener la résine au fond du tube après la centrifugation. Éliminer le surnageant à ce stade.

Ajouter 100 microlitres de tampon de lavage et agiter doucement le tube pour mélanger le contenu. Après centrifugation, appliquer 100 Gs pendant deux minutes et éliminer le surnageant. Ajouter les 90 microlitres restants de la réaction de liaison au résine de nickel NTA.

Incubez ensuite l'échantillon dans un agitateur rotatif pendant 30 minutes. Une fois terminé, centrifugez l'échantillon à 100 Gs pendant deux minutes. Après avoir éliminé le surnageant, répétez les étapes de lavage trois fois supplémentaires.

Ensuite, ajoutez 35 microlitres de tampon d'élution à la résine et mélangez par vortexage. Incubez l'échantillon sur la paillasse à température ambiante pendant cinq minutes. Après centrifugation de l'échantillon, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et étiquetez-le comme la fraction ADN liée aux protéines.

Ensuite, ajoutez 35 microlitres de tampon d'élution à l'ADN témoin après purification des fractions d'ADN témoin et d'ADN lié aux protéines. Ajoutez 10 microlitres de chacun dans des tubes PCR distincts. Puis ajoutez un microlitre de tampon de fragmentation 10 x, deux microlitres de tampon de préparation de la banque et un microlitre de solution de stabilisation de la banque à chaque échantillon, et mélangez soigneusement les échantillons par vortexage.

Incubez les échantillons dans un thermocycleur à 95 degrés Celsius pendant deux minutes. Une fois terminé, refroidissez les échantillons sur de la glace. Ensuite, ajoutez un microlitre d'enzyme de préparation de banque génétique aux échantillons et mélangez le contenu à l'aide d'une pipette.

Incubez les échantillons dans un thermocycleur. Après l'incubation, ajoutez 47,5 microlitres d'eau, 7,5 microlitres de mix maître d'amplification 10 x et 5 microlitres de polymérase à chaque tube. Une fois les échantillons mélangés, chauffez-les dans un thermocycleur.

Préparer en triplicat des réactions de QPCR pour chaque matrice d'ADN en préparant un mélange maître à une fois pour chaque jeu d'amorces précédemment conçu, puis aliquoter 18 microlitres du mélange maître par puits d'une plaque PCR 96 puits. Diluer les échantillons d'ADN amplifiés et purifiés, ainsi que les échantillons d'ADN liés à la protéine, avec de l'eau à une concentration de cinq nanogrammes par microlitre, et ajouter deux microlitres de chaque échantillon dans les puits. Ensuite, sceller la plaque avec un film d'étanchéité UltraClear pour QPCR.

Faire centrifuger la plaque à 200 ×g pendant une minute. Après avoir placé la plaque dans un appareil de PCR quantitative en temps réel, utiliser les conditions suivantes pour marquer l'ADN d'entrée avec s si trois et l'ADN enrichi avec sci cinq : mélanger un microgramme d'ADN avec 40 microlitres de neuf-mers marqués S3 SCI-FI, puis ajuster le volume à 80 microlitres avec de l'eau. Ensuite, dénaturer les échantillons à 98 degrés Celsius pendant 10 minutes à l’obscurité dans un thermocycleur.

Lorsque l'opération est terminée, refroidir rapidement les échantillons sur de la glace pendant deux minutes, puis ajouter deux microlitres de polymérase 3' 5' exo, cinq millimolaires de triphosphates de désoxynucléotide et huit microlitres d'eau à chaque réaction. Après homogénéisation, incuber les réactions à 37 degrés Celsius pendant deux heures à l'abri de la lumière dans un thermocycleur. À ce stade, ajouter du EDTA à une concentration finale de 50 millimolaires pour arrêter les réactions, ainsi qu'une solution de chlorure de sodium à 0,5 molaire.

Transférer ensuite dans des tubes de 1,5 millilitre contenant un volume égal d'isopropanol, après une incubation de 10 minutes à l'obscurité. Centrifuger les échantillons à 12 000 ×g pendant 10 minutes. Réunir ensemble six microgrammes de chaque ADN marqué S3 et sci-fi dans un tube de 1,5 millilitre et sécher sous vide dans un centrifugeuse à faible chaleur et à l'obscurité, en recouvrant le couvercle de la centrifugeuse s'il est transparent.

Une fois les culots secs, on les resuspend dans cinq microlitres d'eau. Ajouter ensuite 13 microlitres d'une solution de hybridation à 1 x, préparée au préalable, au mélange maître après vortexage pendant 15 secondes, puis incuber les échantillons à 95 degrés Celsius dans un bain sec pendant cinq minutes. Retirer les échantillons du bain sec et les placer dans un système d'hybridation à 42 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation pour le chargement.

Ensuite, placer l'assemblage de lame mélangeur préparé précédemment dans le système d'hybridation. Introduire 16 microlitres d'échantillon dans le port de remplissage. Puis sceller les ports avec un film adhésif et activer le mélange dans le système après une hybridation de 16 à 20 heures à 42 degrés Celsius.

Faites glisser le mélangeur, faites glisser la lame dans un outil de démontage et placez-la à l’intérieur d’une boîte contenant du tampon tiède un. Détachez le mélangeur tout en agitant vigoureusement l’outil de démontage. Placez la lame dans un récipient contenant 50 millilitres de tampon de lavage un et agitez vigoureusement pendant deux minutes.

Ensuite, répétez l'étape précédente avec 50 millilitres de tampon de lavage deux et 50 millilitres de tampon de lavage trois RRR DVU 3 0 2 3 déplacé. L'analyse par qPCR de la région en amont de DVU 3 0 2 5 a montré que la région en amont de DVU 3 0 2 5 est enrichie dans la fraction liée aux protéines par rapport à l'ADN d'entrée, indiquant ainsi que les conditions de liaison étaient appropriées pour DVU 3 0 2 3. DVU 0 0 1 3 a servi de contrôle négatif. Les quatre pics les plus élevés obtenus après l'analyse par DAP-chip ont été sélectionnés comme étant les cibles les plus probables parmi les DV 3 0 2 3.

La cible positive DVU 3 0 2 5 correspondait au premier pic obtenu, ayant le score le plus élevé. Deux cibles géniques sont deux autres perméases du lactate codées de manière différente. La quatrième cible génique ne se situe pas dans une région en amont, mais dans une région intergénique située entre deux gènes transcrits de façon convergente. Les régions en amont des cibles obtenues par DAP-chip ont été utilisées avec le logiciel MEME afin de prédire un motif de site de fixation.

Le motif a été davantage validé en introduisant des substitutions dans les bases conservées au sein du motif, ce qui a supprimé le décalage de liaison. Le motif validé a été utilisé pour analyser les génomes d'autres bactéries réductrices de sulfate possédant des orthologues de DVU 3 0 2 3 ; les loci ont été choisis comme cibles géniques potentielles lorsque le motif était localisé dans les régions situées en amont des cadres de lecture ouverts, en utilisant les séquences de motif prédites pour les rs homologues. Un motif consensus du site de liaison a été établi, qui ressemble fortement à celui de Divo Garris Hilton Burrow.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la méthode Daptive pour déterminer les gènes cibles des protéines régulatrices. Cette méthode peut être utilisée pour analyser la taille de liaison de toute protéine régulatrice, à condition que la protéine puisse être purifiée et que la séquence du génome soit connue.