Name: ADN purifié par affinité Chip (DAP-puce) Méthode pour déterminer les cibles génétiques pour bactérienne Deux systèmes de réglementation composants (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Découvrez la méthode DAP-chip pour identifier les sites de liaison génomiques des régulateurs de réponse bactériens. Cette technique in vitro permet d'étudier les réseaux de régulation génique sans connaître les signaux d'activation.

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Nous remercions Amy Chen pour son aide dans la préparation pour le tournage de la vidéo et pour démontrer la technique. Ce travail mené par ENIGMA: écosystèmes intégrés et des réseaux avec des gènes et des assemblages moléculaires (http://enigma.lbl.gov), un programme scientifique Secteur d&#39;intérêt au Lawrence Berkeley National Laboratory, a été pris en charge par le Bureau de la science, Bureau du biologique et recherche sur l&#39;environnement, du Département américain de l&#39;Énergie sous contrat DE-AC02-05CH11231.

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont pas de conflit d&#39;intérêt à divulguer.

La méthode DAP-puce décrit ici a été utilisé avec succès pour déterminer les cibles génétiques pour plusieurs RI dans Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 dont un est représenté ici comme un résultat représentatif. Pour RR DVU3023, le choix d&#39;une cible de gène candidat était simple. DVU3025 est située immédiatement en aval du gène de la RR, et les gènes de la RR et cible sont conservées dans plusieurs espèces Desulfovibrio, et en outre DVU3025 a un promoteur de sigma54-dépendante prédi...

La capacité des bactéries à survivre et à prospérer dépend de façon critique sur la façon dont ils sont capables de percevoir et de répondre aux perturbations de leur environnement, et ce, à son tour dépend de leurs systèmes de transduction du signal. Le nombre de systèmes de signalisation une bactérie de encode a été appelé son &quot;QI microbienne&quot; et peut être une indication de la variabilité de son environnement et de sa capacité à détecter des signaux multiples et d&#39;affiner sa réponse 1. Deux systèmes de transduction de signaux composants (TCS) sont des systèmes de signalisation les plus répandues utilisées par les bactéries, et ils sont constitués d&#39;une histidine kinase (HK) qui détecte le signal externe et le transmet par l&#39;intermédiaire de la phosphorylation d&#39;un régulateur de réponse effectrice (RR) 2. RR peuvent avoir une variété de domaines de la production et donc différents modes effectrices, mais la réponse la plus fréquente est la régulation transcriptionnelle via un domaine 1 liaison à l&#39;ADN. Les signaux détectés et les fonctions correspondantes du canal déférentt majorité des TCS restent inconnus. Bien que des procédés in vivo tels que ChIP-chip sont couramment utilisés pour la détermination des sites de liaison de facteurs de transcription génomiques 3, ils ne peuvent être utilisés pour les deux RR bactériennes du système composant si les conditions ou les signaux d&#39;activation sont connus. Souvent, les signaux environnementaux qui activent un TCS sont plus difficiles à déterminer que leurs gènes cibles. La puce à ADN in vitro dosage à base décrit ici peut être utilisé pour déterminer rapidement et efficacement les gènes cibles et de prévoir des fonctions de TCS. Cet essai tire parti du fait que les RR peuvent être phosphorylés et donc activés in vitro à l&#39;aide de petites molécules telles que des donneurs de phosphate d&#39;acétyle 4. Dans ce procédé, appelé DAP-puce pour l&#39;ADN-affinité-puce purifié (Figure 1), le gène de la RR d&#39;intérêt est clone avec un His-tag dans E. coli, et une protéine marquée par la suite purifié est autorisé à bie à la tonte de l&#39;ADN génomique. L&#39;ADN lié à une protéine est ensuite enrichi par affinité purification, l&#39;ADN enrichi et entrée sont amplifiés, marqué par fluorescence, mis en commun et hybride à une gamme de carrelage qui est faite sur mesure pour l&#39;organisme d&#39;intérêt (figure 1). expériences de puces à ADN sont soumis à des artefacts et donc des mesures supplémentaires sont utilisés pour optimiser le dosage. Une telle démarche est de tenter de déterminer une cible pour le RR à l&#39;étude en utilisant des tests électrophorétique de décalage de mobilité (EMSA) (voir flux de travail dans la figure 2). Puis, après liaison à l&#39;ADN génomique et les étapes de la DAP, l&#39;ADN lié à une protéine et d&#39;entrée sont examinés par qPCR pour déterminer si la cible positif est enrichi dans la fraction liée aux protéines par rapport à la fraction d&#39;entrée, confirmant ainsi les conditions optimales de liaison pour l&#39; RR (figure 2). Après tableau hybridation, les données sont analysées pour trouver des pics de signal d&#39;intensité plus élevée indiquant loci génomiques où la protéine hannonce lié. Les fonctions peuvent être prévus pour la RR en fonction des objectifs de gènes obtenus. Les loci génomiques cibles sont utilisés pour prédire motifs de sites de liaison, qui sont ensuite validés expérimentalement à l&#39;aide EMSA (Figure 2). Les prédictions fonctionnelles et cibles génétiques pour la RR peuvent ensuite être étendues aux espèces qui codent RR orthologues en scannant les génomes pour des motifs de liaison similaires (figure 2) étroitement liés. La méthode DAP-puce peut fournir une mine d&#39;informations pour un TCS où il n&#39;y avait auparavant aucune. Le procédé peut également être utilisé pour n&#39;importe quel régulateur transcriptionnel si la protéine peut être purifiée et des conditions de liaison d&#39;ADN peut être déterminée, et pour n&#39;importe quel organisme d&#39;intérêt avec une séquence génomique disponible. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. L&#39;-puce ADN purifié par affinité (DAP-puce) stratégie 7. Le gène de la RR de l&#39;organisme d&#39;intérêt est cloné avec un His-tag carboxy-terminale dans un E. coli souche d&#39;expression. Protéine purifiée marquée par His est activée par phosphorylation avec du phosphate d&#39;acétyle, et on le mélange avec de l&#39;ADN génomique cisaillé. Une aliquote de la réaction de liaison est enregistré sous forme d&#39;ADN d&#39;entrée, tandis que le reste est soumis à une purification par affinité en utilisant une résine Ni-NTA. L&#39;entrée et l&#39;ADN de RR lié sont génome amplifié, et marqué avec Cy3 et Cy5, respectivement. L&#39;ADN marqué est mis en commun et hybridée à une matrice de carrelage, qui est ensuite analysé afin de déterminer les gènes cibles. Figure modifiée et réimprimée en utilisant la licence creative commons de 7. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2. Sommaire des flux de travail. Pour toute protei marqué purifién, commencer par déterminer une cible en utilisant l&#39;EMSA. Autoriser protéine à lier l&#39;ADN génomique et l&#39;ADN purifier par affinité (DAP) et l&#39;ensemble du génome amplifier (WGA), le ADN enrichi et entrée. Si une cible du gène est connue, utiliser qPCR pour s&#39;assurer que la cible connue est enrichi dans la fraction liée aux protéines. Si aucune cible pourrait être déterminée, passez directement à l&#39;étiquetage de l&#39;ADN et l&#39;hybridation tableau. Si l&#39;enrichissement par qPCR pas pu être observée, puis répétez la liaison protéine-ADNg et étapes DAP-WGA utilisant différentes quantités de protéines. Utiliser l&#39;analyse de réseau pour trouver les pics et les faire correspondre à cibler des gènes. Utiliser les régions en amont de gènes cibles pour prédire motifs de site de liaison. Valider les motifs expérimentalement à l&#39;aide EMSA. Utilisez le motif de scanner les génomes d&#39;espèces apparentées codant orthologues de la RR à l&#39;étude, et de prévoir les gènes ciblés dans ces espèces. Sur la base des cibles de gènes obtenus, la fonction physiologique de la RR et ses orthologues peut être prédite. Figure modifié et reproduit à l&#39;aide du c créativeommons licence de 7.

<table><tbody><tr><td>Colonne HisTrapFF (colonne Ni-Sepharose)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5255-01</td><td></td></tr><tr><td>Akta explorer (instrument FPLC)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Colonne de dessalage</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Kit d’extraction de gel</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotides marqués à la biotine</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>6 % polyacrylamide-0.5x TBE mini gel retardateur d’ADN préfabriqué</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, États-Unis</td><td>EC63652BOX</td><td>Alternativement, vous pouvez verser votre propre gel.</td></tr><tr><td>Membrane en nylon</td><td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>INYC00010</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Cellule de transfert électrophorétique semi-sèche</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Papier blot extra épais, 8 x 13,5 cm</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3967</td><td></td></tr><tr><td>Réticulant UV Modèle XL-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>Kit de détection chimiluminescente d’acide nucléique (Pierce)</td><td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, États-Unis</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Résine d’agarose Ni-NTA</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, États-Unis</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex Kit d’amplification du génome entier (tampon de fragmentation, tampon de préparation de bibliothèque, solution de stabilisation de bibliothèque, enzyme de préparation de bibliothèque, mélange maître d’amplification 10x, WGA polymérase)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis</td><td>WGA2-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>Thermo Scientific, Wilmington, DE, États-Unis</td><td>Pour la quantification de l’ADN</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta Sybr Green SuperMix, avec ROX</td><td>Quanta biosciences</td><td>95055-500</td><td>Tout mélange Sybr Green PCR peut être utilisé</td></tr><tr><td>Film thermoscellable PlateMax Ultra transparent pour qPCR</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>Microplaque PCR transparente à profil bas à 96 puits</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>PCR-96-LP-AB-C</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems StepOne Plus Système de PCR en temps réel</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, États-Unis</td><td>4376600</td><td>N’importe quel système de PCR en temps réel peut être utilisé</td></tr><tr><td>Kit de purification par PCR Qiaquick</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28104</td><td>Tout kit de nettoyage par PCR peut être utilisé</td></tr><tr><td>avec des nonamères marqués Cy3/Cy5</td><td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, États-Unis</td><td>N46-0001, N46-0002</td><td></td></tr><tr><td>Klenow polymérase 50 000 U/ml, 3'-5' exo-</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>M0212M</td><td></td></tr><tr><td>Système d’hybridation</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, États-Unis n</td><td>/A</td><td>Cette société ne fabrique plus de matrices ou d’articles connexes, de sorte qu’il faudra utiliser d’autres sources telles qu’Agilent ou Affymetrix.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, États-Unis Kit d’hybridation</td><td></td></tr><tr><td>(2x tampon d’hybridation, composant d’hybridation A, oligo d’alignement)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, États-Unis d’Amérique</td><td>(</td><td></td></tr><tr><td>10x tampon de lavage I, II, III, 1 M DTT)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, États-Unis d’Amérique Scanner</td><td></td> de <td></td></tr> microréseaux <tr><td>GenePix 4200A</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td>Ce modèle a été remplacé par des</td><td></td>modèles supérieurs</tr><tr><td>Logiciel de microarray GenePix Pro</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nimblescan v.2.4, Logiciel d’analyse de puce ChIP</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

adn purifié par affinité chip (dap-puce) méthode pour déterminer les cibles génétiques pour bactérienne deux systèmes de réglementation composants

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Les méthodes in vivo tels que ChIP-chip sont des techniques bien établies utilisées pour déterminer les cibles mondiales de gènes pour des facteurs de transcription. Cependant, ils sont d&#39;une utilité limitée dans l&#39;exploration de deux systèmes de réglementation composants bactériens avec des conditions d&#39;activation non caractérisés. De tels systèmes régulent la transcription seulement quand elle est activée en présence de signaux uniques. Etant donné que ces signaux sont souvent inconnus, le procédé in vitro de puces à ADN située à décrit dans cet article vidéo peut être utilisée pour déterminer des cibles de gènes et des sites de liaison pour les régulateurs de réponse. Cette méthode puce ADN purifié par affinité peut être utilisée pour n&#39;importe quel régulateur purifiée dans un organisme avec un génome séquencé. Le protocole consiste à permettre la protéine marquée purifiée à se lier à l&#39;ADN génomique cisaillée et ensuite la purification par affinité de l&#39;ADN lié à une protéine, suivie par le marquage fluorescent de l&#39;ADN et l&#39;hybridation à un réseau de carrelage personnalisé. Précédentes étapes qui peuvent être utilisés pour optimiser le dosage de spécificationc régulateurs sont également décrits. Les pics générés par l&#39;analyse des données du tableau sont utilisés pour prédire motifs de sites de liaison, qui sont ensuite validés expérimentalement. Les prédictions de motifs peuvent être utilisés en outre pour déterminer les gènes cibles de régulateurs de réponse orthologues d&#39;espèces étroitement apparentées. Nous démontrons l&#39;applicabilité de ce procédé en déterminant les gènes cibles et de motifs de site de liaison et la prédiction ainsi la fonction d&#39;un régulateur de réponse DVU3023 de sigma54-dépendante de l&#39;environnement dans la bactérie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

La méthode ci-dessus a été appliquée pour déterminer les gènes cibles mondiales des RR dans le sulfate de modèle réduisant bactérie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Ce micro-organisme a un grand nombre de TCS représenté par plus de 70 RI, ce qui indique la grande variété de signaux possibles qui détecte et répond à. Analyses in vivo sur les fonctions de ces systèmes de signalisation sont difficiles à réaliser étant donné que leurs signaux, et donc les conditions d&#39;activation sont ...

Cet article vidéo décrit une méthode de puces à ADN sur la base in vitro afin de déterminer les gènes cibles et des sites de liaison pour deux régulateurs de réponse du système de composants.

ADN purifié par affinité Chip (DAP-puce) Méthode pour déterminer les cibles génétiques pour bactérienne Deux systèmes de réglementation composants

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer les sites de fixation génomique des régulateurs de réponse bactériens à deux composants en utilisant un test in vitro basé sur une puces à ADN. Cette approche consiste à cloner et purifier une protéine régulatrice de réponse marquée, à l'activer par phosphorylation in vitro, puis à identifier un gène cible à l'aide de tests de migration en électrophorèse sur gel afin d'utiliser ce dernier comme témoin positif pour les étapes ultérieures de la puce à ADN. Dans une deuxième étape, la protéine régulatrice de réponse purifiée est mélangée avec l'ADN génomique, ce qui permet de séparer l'ADN lié à la protéine de l'ADN initial par purification d'affinité.Ensuite, l'ADN lié aux protéines et l'ADN témoin sont amplifiés par PCR quantitative, puis vérifiés afin de confirmer l'enrichissement de la cible génique du contrôle positif dans la fraction liée aux protéines, marqués de manière fluorescente, regroupés et hybridés sur une puces à ADN en recouvrement total. Afin de déterminer les sites d'interaction génomiques du régulateur de réponse, les résultats indiquent les gènes les plus susceptibles d'être régulés par le régulateur de réponse étudié, et peuvent être confirmés ultérieurement par des tests de retard électrophorétique (EMSA). Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes telles que le « chip-chip » in vivo réside dans sa possibilité d'utilisation même lorsque les signaux activateurs et les conditions appropriées ne sont pas connus pour les systèmes à deux composants.Cette méthode revêt une grande importance pour le domaine de la signalisation bactérienne, car la grande majorité des régulateurs présentent des gènes cibles inconnus, et cette méthode permet d'élucider les réseaux régulateurs complexes. Amy Chen, assistante de recherche de mon laboratoire, démontrera cette procédure avant le début de celle-ci.Purifiez une protéine rr, spécifiquement la protéine DVU 3 0 2 3 exprimée à partir d'un gène DVU 3 0 2 3 cloné. Incubez 0,5 picomole de protéine DVU 3 0 2 3 avec 100 femtomoles d'un substrat d'ADN préparé antérieurement dans une solution tamponnée, jusqu'à un volume total de 20 microlitres. Après avoir mis en place une réaction sans protéine servant de témoin, incubez les réactions à température ambiante sur la paillasse pendant 20 minutes.Après l'incubation, ajouter cinq microlitres de tampon de charge 5 x aux réactions de liaison. Déposer 18 microlitres de chaque réaction sur un gel mini de polyacrylamide 6 % préparé au préalable dans du TBE 0,5 x et faire migrer à 100 volts pendant deux heures. Une fois la migration terminée, découper une membrane en nylon chargée à la taille du gel et l'imbiber dans du TBE 0,5 x pendant au moins 10 minutes. Ensuite, retirer le gel de la cassette.Retirez toutes les crêtes du gel et placez le gel et la membrane entre deux papiers filtres épais imbibés de TBE 0,5 X. Insérez le gel et la membrane dans un appareil de transfert semi-sec et faites fonctionner à 20 volts pendant 30 minutes. Ensuite, placez la membrane dans un appareil commercial de réticulation par lumière UV et réglez le temps sur trois minutes ; après avoir révélé le transfert à l’aide d’un kit de détection chimiluminescente, acquérez l’image à l’aide d’un ordinateur relié à une caméra équipée d’un capteur CCD.Rechercher un décalage de la mobilité du substrat d'ADN en présence du RR, ce qui indique que le RR se lie à l'ADN testé. Ensuite, mélanger deux à trois microgrammes d'ADN génomique partagé avec 0,5 picomole de DVU 3 0 2 3 dans une solution tamponnée. Après incubation de la réaction à 25 degrés Celsius pendant 30 minutes, transférer 10 microlitres de ce mélange dans un tube de 1,5 millilitre et l'étiqueter comme ADN témoin.Ajouter 30 microlitres de résine aros NTA au nickel dans un tube microfuge de 0,6 millilitre. Centrifuger l'échantillon à 100 ×g pendant une minute afin de ramener la résine au fond du tube après la centrifugation. Éliminer le surnageant à ce stade.Ajouter 100 microlitres de tampon de lavage et agiter doucement le tube pour mélanger le contenu. Après centrifugation, appliquer 100 Gs pendant deux minutes et éliminer le surnageant. Ajouter les 90 microlitres restants de la réaction de liaison au résine de nickel NTA.Incubez ensuite l'échantillon dans un agitateur rotatif pendant 30 minutes. Une fois terminé, centrifugez l'échantillon à 100 Gs pendant deux minutes. Après avoir éliminé le surnageant, répétez les étapes de lavage trois fois supplémentaires.Ensuite, ajoutez 35 microlitres de tampon d'élution à la résine et mélangez par vortexage. Incubez l'échantillon sur la paillasse à température ambiante pendant cinq minutes. Après centrifugation de l'échantillon, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et étiquetez-le comme la fraction ADN liée aux protéines.Ensuite, ajoutez 35 microlitres de tampon d'élution à l'ADN témoin après purification des fractions d'ADN témoin et d'ADN lié aux protéines. Ajoutez 10 microlitres de chacun dans des tubes PCR distincts. Puis ajoutez un microlitre de tampon de fragmentation 10 x, deux microlitres de tampon de préparation de la banque et un microlitre de solution de stabilisation de la banque à chaque échantillon, et mélangez soigneusement les échantillons par vortexage.Incubez les échantillons dans un thermocycleur à 95 degrés Celsius pendant deux minutes. Une fois terminé, refroidissez les échantillons sur de la glace. Ensuite, ajoutez un microlitre d'enzyme de préparation de banque génétique aux échantillons et mélangez le contenu à l'aide d'une pipette.Incubez les échantillons dans un thermocycleur. Après l'incubation, ajoutez 47,5 microlitres d'eau, 7,5 microlitres de mix maître d'amplification 10 x et 5 microlitres de polymérase à chaque tube. Une fois les échantillons mélangés, chauffez-les dans un thermocycleur.Préparer en triplicat des réactions de QPCR pour chaque matrice d'ADN en préparant un mélange maître à une fois pour chaque jeu d'amorces précédemment conçu, puis aliquoter 18 microlitres du mélange maître par puits d'une plaque PCR 96 puits. Diluer les échantillons d'ADN amplifiés et purifiés, ainsi que les échantillons d'ADN liés à la protéine, avec de l'eau à une concentration de cinq nanogrammes par microlitre, et ajouter deux microlitres de chaque échantillon dans les puits. Ensuite, sceller la plaque avec un film d'étanchéité UltraClear pour QPCR.Faire centrifuger la plaque à 200 ×g pendant une minute. Après avoir placé la plaque dans un appareil de PCR quantitative en temps réel, utiliser les conditions suivantes pour marquer l'ADN d'entrée avec s si trois et l'ADN enrichi avec sci cinq : mélanger un microgramme d'ADN avec 40 microlitres de neuf-mers marqués S3 SCI-FI, puis ajuster le volume à 80 microlitres avec de l'eau. Ensuite, dénaturer les échantillons à 98 degrés Celsius pendant 10 minutes à l’obscurité dans un thermocycleur.Lorsque l'opération est terminée, refroidir rapidement les échantillons sur de la glace pendant deux minutes, puis ajouter deux microlitres de polymérase 3' 5' exo, cinq millimolaires de triphosphates de désoxynucléotide et huit microlitres d'eau à chaque réaction. Après homogénéisation, incuber les réactions à 37 degrés Celsius pendant deux heures à l'abri de la lumière dans un thermocycleur. À ce stade, ajouter du EDTA à une concentration finale de 50 millimolaires pour arrêter les réactions, ainsi qu'une solution de chlorure de sodium à 0,5 molaire.Transférer ensuite dans des tubes de 1,5 millilitre contenant un volume égal d'isopropanol, après une incubation de 10 minutes à l'obscurité. Centrifuger les échantillons à 12 000 ×g pendant 10 minutes. Réunir ensemble six microgrammes de chaque ADN marqué S3 et sci-fi dans un tube de 1,5 millilitre et sécher sous vide dans un centrifugeuse à faible chaleur et à l'obscurité, en recouvrant le couvercle de la centrifugeuse s'il est transparent.Une fois les culots secs, on les resuspend dans cinq microlitres d'eau. Ajouter ensuite 13 microlitres d'une solution de hybridation à 1 x, préparée au préalable, au mélange maître après vortexage pendant 15 secondes, puis incuber les échantillons à 95 degrés Celsius dans un bain sec pendant cinq minutes. Retirer les échantillons du bain sec et les placer dans un système d'hybridation à 42 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation pour le chargement.Ensuite, placer l'assemblage de lame mélangeur préparé précédemment dans le système d'hybridation. Introduire 16 microlitres d'échantillon dans le port de remplissage. Puis sceller les ports avec un film adhésif et activer le mélange dans le système après une hybridation de 16 à 20 heures à 42 degrés Celsius.Faites glisser le mélangeur, faites glisser la lame dans un outil de démontage et placez-la à l’intérieur d’une boîte contenant du tampon tiède un. Détachez le mélangeur tout en agitant vigoureusement l’outil de démontage. Placez la lame dans un récipient contenant 50 millilitres de tampon de lavage un et agitez vigoureusement pendant deux minutes.Ensuite, répétez l'étape précédente avec 50 millilitres de tampon de lavage deux et 50 millilitres de tampon de lavage trois RRR DVU 3 0 2 3 déplacé. L'analyse par qPCR de la région en amont de DVU 3 0 2 5 a montré que la région en amont de DVU 3 0 2 5 est enrichie dans la fraction liée aux protéines par rapport à l'ADN d'entrée, indiquant ainsi que les conditions de liaison étaient appropriées pour DVU 3 0 2 3. DVU 0 0 1 3 a servi de contrôle négatif. Les quatre pics les plus élevés obtenus après l'analyse par DAP-chip ont été sélectionnés comme étant les cibles les plus probables parmi les DV 3 0 2 3.La cible positive DVU 3 0 2 5 correspondait au premier pic obtenu, ayant le score le plus élevé. Deux cibles géniques sont deux autres perméases du lactate codées de manière différente. La quatrième cible génique ne se situe pas dans une région en amont, mais dans une région intergénique située entre deux gènes transcrits de façon convergente. Les régions en amont des cibles obtenues par DAP-chip ont été utilisées avec le logiciel MEME afin de prédire un motif de site de fixation.Le motif a été davantage validé en introduisant des substitutions dans les bases conservées au sein du motif, ce qui a supprimé le décalage de liaison. Le motif validé a été utilisé pour analyser les génomes d'autres bactéries réductrices de sulfate possédant des orthologues de DVU 3 0 2 3 ; les loci ont été choisis comme cibles géniques potentielles lorsque le motif était localisé dans les régions situées en amont des cadres de lecture ouverts, en utilisant les séquences de motif prédites pour les rs homologues. Un motif consensus du site de liaison a été établi, qui ressemble fortement à celui de Divo Garris Hilton Burrow.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la méthode Daptive pour déterminer les gènes cibles des protéines régulatrices. Cette méthode peut être utilisée pour analyser la taille de liaison de toute protéine régulatrice, à condition que la protéine puisse être purifiée et que la séquence du génome soit connue.

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Le dépistage de la fonctionnelle non-codant des variants génétiques utilisant mobilité électrophorétique Maj Assay (EMSA) et l&#39;ADN-affinité Précipitations Assay (DAPA)

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