Name: Un test comportemental simple pour tester la fonction visuelle dans Xenopus laevis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Découvrez un test comportemental simple pour évaluer la fonction visuelle chez les têtards de Xenopus laevis. Cette méthode utilise un réservoir noir et blanc pour mesurer les préférences de nage guidées par la vision.

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Ce travail a été financé par des subventions des Instituts nationaux de la santé: EY015748, EY017964 (MET), et EY019517 (ASV). Ce travail a également été soutenue par la recherche pour prévenir la cécité sans restriction Grant au département d&#39;ophtalmologie et les Lions de New York Central. Nous tenons également à remercier notre technicien animalier, Matthew Mellini, pour son excellent soin des animaux et pour le renforcement de la vedette dans cette vidéo.

Protection des animaux Le têtards de Xenopus laevis utilisées dans cette étude ont été cultivés, élevés et traités conformément aux procédures approuvées par Upstate Medical University IACUC et le Guide pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. . 1 Configuration Pré-comportement: têtards <ol><li> Obtenir des embryons de xénope fécondés provenant d&#39;une source disponible dans le commerce ou in vitro féconder les ovocytes, comme décrit précédemment 6. </li><li> Placez blastula des embryons de neurones de la scène de la plaque à 18 ˚ C en 60 mm boîtes de Pétri contenant 0,1 X MMR [10 modifié (ROR) solution mère de Ringer X Marc (10 mM MgCl 2, 20 mM de KCl, 20 mM de CaCl2; HEPES 50 mM; NaCl 1 M; ajusté à pH 7,5, passé à l&#39;autoclave à température ambiante et stockées)] avec 50 ug / ml de l&#39;antibiotique gentamicine. Changez 0,1 X MMR chaque jour et éliminer les embryons morts. </li><li> Une fois les embryons atteignent Nieuwkoop et Faber stade ~ 27 au 30 juillet, passer èmee embryons dans 0,1 X MMR sans antibiotique pour permettre la croissance bactérienne de l&#39;intestin. </li><li> Cultiver les têtards jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le stade d&#39;alimentation (étape 45) et déplacez-les dans des boîtes de Pétri de 100 mm remplis de 0,1 X MMR. Les nourrir ortie poudre surnageant chaque jour pendant une semaine, en changeant le 0,1 X MMR le jour intervenir. </li><li> Après une semaine dans le plat 100 mm Petri, déplacer les animaux de la moitié des réservoirs de gallons remplis d&#39;eau de grenouille [0,5 g / L océan instantanée et 2 mM de phosphate de sodium dibasique (Na 2 HPO 4: mw 141,96) pH 6,8]. Nourrissez-les comme dans l&#39;étape 2.4, mais changer l&#39;eau seulement 2-3 fois par semaine lorsque l&#39;eau est trouble. Maintenir les animaux dans un cycle lumière obscurité de 12 h de lumière/12 avec les lumières allumer à 6 heures. </li><li> Placez le réservoir demi-gallon avec les sujets de test sur une surface blanche, comme un sous-tapis de paillasse, au moins 12 heures O / N, avant le test. </li><li> têtards d&#39;essai aux stades 45 à 50 comme décrit dans l&#39;étape 3 ci-dessous. </li></ol> . 2 Configuration Pré-comportement: Equipment <ol><li> Mettez de côté une zone de laboratoire pour l&#39;analyse du comportement. Il devrait être dans un quartier calme à faible trafic avec l&#39;éclairage fluorescent standard. </li><li> Préparer les bacs de test pour les animaux. Les bacs de test, un demi-gallon imbriqués sont composées de deux parties: un réservoir interne qui contiendra l&#39;eau et têtards; et un réservoir externe avec le stimulus visuel. <ol><li> Pour le réservoir interne, faire une petite marque sur les coins extérieurs avec un feutre, 5 cm du fond; il s&#39;agit de la ligne d&#39;eau (figure 1A, la ligne pointillée verte). </li><li> Aussi, pour le réservoir intérieur, remplir les divets dans le réservoir (dans les coins et au centre) avec un composé inerte, comme Sylgard élastomère. NOTE: Les têtards s&#39;attarder dans ces domaines si elles ne sont pas remplis po </li><li> Pour le réservoir externe, couvrir exactement la moitié de l&#39;extérieur d&#39;un réservoir avec du ruban électrique noir et l&#39;autre moitié avec le tissu blanc papier Figure 1B. </li></ol></li><li> Placez les réservoirs sur leinoculation platine. </li><li> Configuration de la webcam / trépied afin qu&#39;il soit au-dessus des bacs de test. Régler la caméra pour permettre la visualisation de la zone d&#39;essai, comme le montre la figure 1C. </li><li> Connectez la webcam à un ordinateur avec le logiciel QuickTime Player installé 5. Allumez l&#39;appareil photo. Dans QuickTime Player, sous Fichier, sélectionnez &quot;Nouvel enregistrement de séquence. La configuration de test de comportement sera visible sur l&#39;ordinateur tout de suite. </li><li> Drapé d&#39;un chiffon de coton léger sur l&#39;ensemble de la configuration pour réduire indices externes qui pourraient influer sur le comportement des têtards, ainsi que, de réduire la lumière réfléchie sur la surface de l&#39;eau. </li><li> Veiller à ce que la luminance au titre des mesures de tissu entre 35-50 cd / m 2. </li></ol> 3. Comportement Assay <ol><li> Remplir le réservoir de test interne pour la marque de 5 cm d&#39;eau fait dans l&#39;étape 1.2.1 avec de l&#39;eau de grenouille. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un petit filet, déplacez doucement l&#39;animal dans le réservoir de test interne. </li><li> Ouvrir QuickTime logiciel sur ordinateur et, à l&#39;aide du réservoir externe comme un guide, assurez-vous que l&#39;appareil est en mesure de visualiser et d&#39;enregistrer la zone de test. </li><li> Écrivez le nom de l&#39;animal, la date et l&#39;heure sur un morceau de papier et d&#39;enregistrer avec la caméra. </li><li> Placez le réservoir de test dans le réservoir extérieur, le côté noir du réservoir vers la droite Figure 2. </li><li> Commencer à enregistrer le film immédiatement après l&#39;organisation du réservoir et réglez la minuterie pendant 2 min. </li><li> Quand le minuteur sonne, retirer le réservoir de test interne, tourner le réservoir externe de 180 ° et placez le réservoir de test interne à l&#39;intérieur du réservoir externe. Démarrer la minuterie. Remarque: le côté noir devrait maintenant être de l&#39;autre côté. </li><li> Répétez l&#39;étape 3.7, huit fois plus pour un total de dix essais. Utilisez la figure 2 comme un guide, en cochant chaque essai. </li><li> Répétez le test de comportement sur deux jours différents. </li></ol> 4. Rétinienne axotomie <ol><li> Placez l&#39;animal dans 0,02% tricaine jusqu&#39;à ce qu&#39;ils ne répondent pasà une pincée de queue avec un # 3 forceps. </li><li> Faire fondre 1% d&#39;agarose dans 0,1 X MMR puis ajouter à une boîte de Pétri de 60 mm. Une fois refroidie, une petite motte de terre rectangulaire dans l&#39;agarose et ajouter le têtard de la motte de terre avec un peu de tricaïne 0,02%, de sorte que l&#39;animal est partiellement immergé dans le liquide. </li><li> Pierce la peau à un angle de 45 degrés derrière la région dorsale de l&#39;oeil avec une aiguille 25 G, tout en s&#39;agrippant de l&#39;animal contre la pince sur le côté opposé. </li><li> Prendre soin de ne pas couper la veine, qui se trouve à côté du nerf optique, atteindre soigneusement dans le trou avec # 5 pinces, couper le nerf optique et le retourner à l&#39;écart. Si il ya une hémorragie sévère en raison de la biopsie accidentellement l&#39;artère, puis placer rapidement l&#39;animal dans 2% tricaïne à euthanasier. ATTENTION: solution de tricaine 2% peut provoquer un engourdissement dans les humains. Cette solution doit être manipulé avec des gants. </li><li> Pour récupérer l&#39;animal après la chirurgie, placer l&#39;animal dans 100 mm boîte de Petri avec 0.7X ROR et 50 pg / ml de gentamicine pendant 20 min. Next, transfert têtard à la cuve de récupération d&#39;eau de grenouille. Laisser reposer animale O / N. </li><li> Le lendemain matin, tester la fonction visuelle comme décrit ci-dessus (étapes 3.1 à 3.9). </li></ol> 5. Analyser les résultats <ol><li> Après les essais sont terminés, mesurer la quantité de temps le têtard reste sur le côté noir de la cuve. <ol><li> Voir manuellement les vidéos en utilisant un logiciel qui affiche l&#39;heure et permet des pauses fréquentes. Regardez le temps d&#39;affichage de la vidéo. Notez le début du procès de deux minutes, ce qui est quand le réservoir interne niche avec succès à l&#39;intérieur du réservoir externe et est carré en vue de la caméra. </li><li> Utilisez la position des yeux du têtard à définir de quel côté de la cuve les animaux nagent sur. Définir la traversée d&#39;un côté de la cuve à l&#39;autre que lorsque les deux yeux ont franchi la ligne noir / blanc. </li></ol></li><li> Notez le début et la fin de chaque intervalle (en secondes) que l&#39;animal passe sur le côté noir. Faites une pause et reenrouler la vidéo pour assurer l&#39;exactitude. Additionner le sec dans chaque essai. </li><li> Entrée ces nombres dans la feuille de calcul du comportement joint. La feuille de calcul calcule le rapport entre le temps que l&#39;animal a passé sur le côté blanc en soustrayant le temps passé sur le côté noir de la cuve de l&#39;essai sec 120 au total et le diviser par le temps total en secondes [(120 - nombre total de secondes consacrées à le côté noir) / 120 sec]. Les moyennes de feuille de calcul de ce ratio sur l&#39;ensemble des 10 essais. </li><li> Utilisez le T-test de Student, jumelé, distribution bilatérale afin de déterminer si les essais entre les jours sont significatives (P ≤ 0,05). </li></ol>

<ol><li>Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+zebrafish+oculomotor+behavior+to+model+human+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders.</a> Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).</li>
<li>Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+temporal+properties+of+the+rod+pathway+in+larval+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus.</a> J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).</li>
<li>Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preference+for+background+color+of+the+Xenopus+laevis+tadpole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole.</a> J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7 (8), (2009).</li>
<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
<li>Viczian, A. S., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+determination+using+the+animal+cap+transplant+%28ACT%29+assay+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis.</a> J Vis Exp. 16 (39), (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29+%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).</li>
<li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second-generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+molecularly-tractable+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms.</a> PLoS One. 5 (12), (2010).</li>
<li>Rosemberg, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+spatio-temporal+behavior+of+zebrafish+in+the+open+tank+paradigm+after+a+short-period+confinement+into+dark+and+bright+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li>
<li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Avoidance+in+Xenopus+Tadpoles+is+Correlated+With+the+Maturation+of+Visual+Responses+in+the+Optic+Tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum.</a> J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+In+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).</li>
<li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous rapportons ici un test de comportement guidé par la vision simple qui peut être facilement réalisée en moins d&#39;une semaine par le personnel de laboratoire une formation minimale. Alors que d&#39;autres tests nécessitent un équipement spécialisé et de l&#39;expertise en comportement animal, ce test permet un test rapide pour déterminer la fonction visuelle. Un autre essai de comportement, le test d&#39;évitement visuel, a été développé pour déterminer comment le tectum contribue à la perception visuelle chez <em...

Xenopus laevis ont été utilisés comme un organisme modèle pour étudier la formation des yeux. Les yeux se développent rapidement, de plus en plus de maturité dans moins d&#39;une semaine des gènes ou des voies d&#39;essai qui ont un effet sur le développement et la fonction visuelle. Pour tester la fonction visuelle, la réponse optocinétique et optomoteur a été utilisée dans le poisson-zèbre et les têtards de Xenopus, respectivement 1,2. Parce que les yeux de têtards de Xenopus sont relativement plus petit que le poisson-zèbre, ce test nécessite l&#39;utilisation d&#39;équipement spécialisé et de personnel qualifié pour détecter le comportement subtil queue-flip et mouvements oculaires chez Xenopus. Un comportement plus robuste chez Xenopus est la préférence pour la natation dans un réservoir avec un fond blanc, ce qui est décrit ici 3. Lorsque vous placez un têtard dans un réservoir à moitié noir / moitié blanc, le têtard pré-métamorphique nage rapidement sur le côté blanc de la cuve. Nous avons déjà utilisé ce test pour déterminer si pluripotentes dérivé des cellulesyeux étaient fonctionnels 4. Nous rapportons ici une version détaillée de ce test, qui peut être utilisé pour tester la fonction visuelle des têtards de Xenopus prémétamorphique. Ce test est plus simple que le test de réponse optomoteur, car il ne nécessite un caméscope monté numérique, logiciel d&#39;appareil photo numérique et un équipement standard dans la plupart des laboratoires de Xenopus. En outre, la réponse enregistrée ne nécessite aucune formation particulière aux résultats de pointage. Nos résultats représentatifs montrent que le même groupe de têtards, ayant subi deux axotomy rétinienne, nagent aléatoirement autour du réservoir. Nous avons également inclus les résultats d&#39;analyse du comportement d&#39;un têtard représentant, en montrant comment un oeil peut être testé pour la réponse visuelle. Une feuille de calcul a été inclus afin que les numéros acquises au cours de l&#39;essai peuvent être insérés et analysés. Cette feuille peut être utilisée pour déterminer si les têtards testés ont une réponse visuelle.

<table><tbody><tr><td>1/2 gallon Flex-Tank avec couvercle</td><td>eNasco</td><td>SB19271M</td><td>Taille : 5-3/8 » x 7 » x 3-3/4</td></tr>"<tr><td>Ruban</td><td></td><td></td><td></td>électrique noir</tr><tr><td>Papier</td><td></td><td></td><td></td>de soie blanc</tr><tr><td>Grand plateau tournant d’inoculation</td><td>VWR</td><td>50809-022</td><td>Taille : Dia 114.3 x&nbsp ; H 76,2 mm (4 1/2 x 3 »)</td></tr><tr><td>Sous-matelas Durasorb</td><td>VWR</td><td>82004-836</td><td>Taille : 43,2 x 60,1 cm (17 x 24 »)</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1945-34155-CS</td><td></td></tr><tr><td>Trépied</td><td></td> standard <td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>appareils photo ou webcam iSight</td><td>Apple</td><td>M8817LL/A</td><td>Bon pour les plus gros têtards mais les petits sont difficiles à voir</td></tr><tr><td>Ordinateur portable</td><td>Apple/PC</td><td>Divers</td><td>Nous avons utilisé un MacBook 13", Intel Core 2 Duo 2 GHz fonctionnant sous MacOSX Lion 10.7.5</td></tr><tr><td>MiniDV caméscope handycam</td><td>SONY</td><td>DCR-HC42</td><td>Connecté par FireWire à l’ordinateur à l’aide d’un câble alpha FireWire 400 à 6 conducteurs et 4 conducteurs.</td></tr><tr><td>Station Handycam</td><td>SONY</td><td>DCRA-C121</td><td>Peut être utilisé pour connecter le fil de feu à la caméra</td></tr><tr><td>Logiciel QuickTime Player</td><td>Quicktime</td><td>Version 10.1</td><td></td></tr><tr><td>26 G Aiguille (longueur 5/8") VWR</td><td></td> <td>BD305115</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de gentamicine [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-528Z</td><td>Stocké à</td></tr><tr><td>RT Sylgard 184 Élastomère de silicone</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>Solution mère = 100 g/L stocké à RT</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0876</td><td>Solution mère = 0,4 M stocké à RT</td></tr><tr><td>In vitro embryons fécondés</td><td>eNasco</td><td>LM00490MX</td><td>100 embryons/unité</td></tr></tbody></table>

un test comportemental simple pour tester la fonction visuelle dans<em&gt; xenopus laevis</em

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Mesure de la fonction visuelle chez les têtards de la grenouille Xenopus laevis, permet le dépistage de la cécité chez les animaux vivants. La réponse optocinétique est un comportement réfléchi basé sur la vision qui a été observée chez tous les vertébrés testés. Tadpole yeux sont petits, la réponse queue de bascule a été utilisé comme mesure de rechange, ce qui nécessite un technicien qualifié pour enregistrer la réponse subtile. Nous avons développé un test de comportement alternatif basé sur le fait que les têtards préfèrent nager sur le côté blanc d&#39;un réservoir lorsqu&#39;il est placé dans une cuve avec des côtés à la fois en noir et blanc. L&#39;analyse présentée ici est une alternative simple peu coûteux qui crée une réponse qui est facilement mesurable. L&#39;installation se compose d&#39;un trépied, d&#39;une webcam et bacs de test imbriqués, facilement disponibles dans la plupart des laboratoires de Xenopus. Cet article comprend un film montrant le comportement des têtards, avant et après le sectionnement du nerf optique. Afin de tester la fonction d&#39;un oeil, on inclut également reprérésultats représentatifs d&#39;un têtard dans lequel chaque œil a subi axotomy rétinienne sur plusieurs jours consécutifs. Les études futures pourraient développer une version automatisée de ce test pour tester la vision de nombreux têtards à la fois.

Les rapports précédents ont montré que les têtards de Xenopus prémétamorphique préfèrent nager sur le côté blanc d&#39;un réservoir noir / blanc et a appelé cet essai, l&#39;arrière-plan de couleur préférée de dosage 3 Nous avons changé ce test afin de tester la fonction visuelle des deux yeux de têtards dans moins d&#39;une semaine. De cette manière, les yeux peuvent être collectées pour un examen histologique. Nous montrons ici comment la réponse est due à des indices v...

Têtards de Xenopus laevis préfèrent nager sur le côté blanc d&#39;un réservoir noir / blanc. Ce comportement est guidé par la vision. Sur la base de ce comportement, nous présentons un test simple pour tester la fonction visuelle des têtards.

Un test comportemental simple pour tester la fonction visuelle dans<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

L'objectif général de cette procédure est de tester la fonction visuelle des têtards en enregistrant la durée pendant laquelle l'animal reste dans la moitié du réservoir d'essai recouverte de noir. Cette étape est réalisée en premier lieu en élevant les têtards jusqu'aux stades 45 à 50. La deuxième étape consiste à mettre en place un réservoir divisé en une moitié noire et une moitié blanche, ainsi qu'une caméra pour le test comportemental.Placez ensuite un deuxième réservoir contenant une têtard dans le réservoir extérieur. Pour chaque têtard, enregistrez le comportement guidé par la vision lorsque le fond de son environnement est modifié. La dernière étape consiste à réaliser une ex-sodomie rétinienne sur les têtards, puis à répéter le test de comportement.En fin de compte, les données issues de cet essai simple et peu coûteux permettent de démontrer que les têtards présentent une préférence pour nager d'un côté du récipient plutôt que de l'autre lors de tests de vision phototopique. Le principal avantage de cette méthode par rapport à d'autres techniques, telles que la réponse optocinétique ou l'essai du réflexe de flexion caudale, réside dans sa simplicité et son faible coût, ainsi que dans l'utilisation d'équipements facilement accessibles dans la plupart des laboratoires d'opus. Pour préparer les têtards, commencez par obtenir des embryons de xenopus fécondés, puis placez-les dans des boîtes de Pétri de 60 millimètres contenant du ringer modifié de Mark, ou MMR dilué au dixième, avec 50 microgrammes par millilitre.Placer les embryons, du stade blastula au stade plaque neurale, dans de l'antibiotique gentamicine. Stades deux à 15 à 18 degrés Celsius dans les boîtes de Pétri. Une fois que les embryons atteignent le stade cup nouveau, d'environ 27 à 30, les transférer dans du MMR 0,1 X sans antibiotique afin de permettre la croissance bactérienne intestinale.Lorsque les têtards atteignent le stade d’alimentation, vers le stade 45, transférez-les dans des boîtes de Pétri de 100 millimètres contenant du MMR 0,1 X. Le jour suivant, nourrissez-les avec le surnageant de poudre d'ortie. Après une semaine dans la boîte de Pétri de 100 millimètres, remplissez un aquarium d’un demi-gallon avec de l’eau pour grenouilles.Déplacer les animaux dans le réservoir et poursuivre l'administration du surnageant de poudre d'ortie, mais changer l'eau seulement deux à trois fois par semaine. Lorsque les animaux sont placés dans des réservoirs d'un demi-gallon, maintenir un cycle de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité, avec allumage des lumières à 6h00 du matin. Avant les tests, placer le réservoir d'un demi-gallon contenant les sujets d'essai sur une surface blanche pendant la nuit, au moins 12 heures avant le test. Le test comportemental doit être effectué dans un endroit calme, peu fréquenté, éclairé par une lumière fluorescente standard.Préparez deux réservoirs d'essai de demi-gallon pour nids aux coins extérieurs de ce qui sera le réservoir intérieur. Utilisez un feutre indélébile pour marquer la ligne d'eau à cinq centimètres au-dessus du fond. Pour le réservoir intérieur également, repérez toutes les imperfections à l'intérieur.Remplissez-les avec un composé inerte afin d'empêcher les têtards de s'y attarder. Portez maintenant votre attention sur le deuxième réservoir extérieur. Pour l'étape suivante, procurez-vous du ruban adhésif électrique noir et du papier de soie blanc.Utilisez le ruban adhésif pour couvrir l'extérieur de la moitié du réservoir et le papier essuie-tout pour couvrir l'extérieur de l'autre moitié, comme illustré ici. Une fois les réservoirs préparés, installez un tour rotatif d'ensemencement et placez les réservoirs emboîtés dessus. Positionnez un trépied et une webcam de manière à ce que la caméra puisse filmer l'intérieur des réservoirs par le haut.Connectez la webcam à un ordinateur disposant d'un logiciel d'acquisition et de lecture vidéo. Allumez la caméra et préparez-vous à enregistrer un nouveau film. Ensuite, placez un tissu en coton léger sur la caméra et les réservoirs.Pour réduire les stimuli externes perçus par les têtards, utilisez un luxmètre et vérifiez que l'éclairement sous le tissu se situe entre 35 et 50 bougies par mètre carré. Commencez le test comportemental en récupérant le réservoir interne de test. Remplissez-le d’eau pour grenouilles jusqu’au repère de cinq centimètres.Utilisez un filet pour transférer un animal depuis son récipient d'un demi-gallon vers le réservoir interne de test à l'ordinateur. Assurez-vous que le logiciel d'enregistrement est ouvert et enregistre la zone de test pour la conservation des données. Notez le nom de l'animal, la date et l'heure sur un morceau de papier.Placez ceci sous la caméra pour l'enregistrement. Une fois cette étape terminée, réglez un minuteur sur deux minutes. Ensuite, orientez le réservoir externe sur la platine tournante de manière à ce que le côté noir soit à droite.Placez maintenant le réservoir d'essai dans le réservoir externe. Dans la zone d'enregistrement, fermez le rideau et utilisez l'écran d'ordinateur pour vérifier l'orientation du réservoir externe. Assurez-vous que l'enregistrement vidéo est en cours et démarrez le chronomètre.Lorsque la minuterie sonne, maintenez le drap en place et retirez le réservoir interne de test. Ensuite, faites pivoter le réservoir externe de 180 degrés afin que le côté noir se trouve désormais à gauche. Replacez le réservoir de test dans le réservoir externe et démarrez la minuterie de deux minutes.Retirez à nouveau le réservoir intérieur. Faites pivoter le réservoir extérieur de 180 degrés et remplacez le réservoir intérieur toutes les deux minutes, pour un total de 10 fois. Une fois terminé, arrêtez l'enregistrement vidéo.Replacer le têtard dans son aquarium d'un demi-gallon. Préparer un microscope pour effectuer l'exsodomy de la rétinol. Remplir une boîte de Pétri de 60 millimètres avec 1 % d'aros fondu dans du 0,1 XMMR et laisser durcir.Retirez un petit morceau rectangulaire de l’aro de la taille du têtard. Lorsque vous êtes prêt à continuer, récupérez l’animal d’essai et placez-le dans du Trica à 0,02 %. Poursuivez lorsque l’animal ne réagit plus à une pincée de la queue avec une pince n°3.Transférez ensuite l'animal dans la boîte. Procédez ensuite en montant la boîte de Pétri sur le microscope. Préparez-vous à maintenir l'animal avec une pince d'un côté.De l'autre côté, utiliser une aiguille de calibre 25 pour percer la peau derrière la région dorsale de l'œil selon un angle de 45 degrés, puis atteindre délicatement l'ouverture avec une pince n°5 et sectionner le nerf optique en évitant la veine adjacente. Repousser le nerf sur le côté et retirer la pince après l'intervention. Réanimer l'animal en le plaçant dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant du XMMR 0,7 X et 50 microgrammes par millilitre.Gentamycine pendant 20 minutes. Ensuite, transférez la têtard dans un aquarium de récupération contenant de l'eau pour grenouilles. Placez l'aquarium sur une surface blanche en prévision du test.Laissez l'animal se reposer pendant la nuit. Le lendemain matin, utilisez le test comportemental pour évaluer la fonction visuelle. Ce film montre des données représentatives pour l'expérience.À gauche se trouvent les animaux avant la chirurgie, à droite les mêmes animaux après la section des axones rétiniens provenant des deux yeux. Cela est indiqué par le schéma dans les coins inférieurs. L'eau a été agitée pour montrer qu'aucune substance n'a été ajoutée pour repousser les animaux du côté noir ou les attirer vers le côté blanc.Les têtards avant la chirurgie réagissent à la couleur de fond en moins de 30 secondes, tandis que les têtards aveugles nagent sans but autour du réservoir. Ce graphique montre le pourcentage de temps passé dans les zones blanche et noire pour un animal unique sous trois conditions. Premièrement, l'animal a été observé avant toute chirurgie à l'aide du test.Pendant deux jours consécutifs après la section du nerf optique droit, son comportement a été observé sur deux journées de test. Enfin, après la section des deux nerfs optiques, deux nouvelles journées d'observation ont été réalisées avec le test. L'animal a passé davantage de journées du côté blanc du réservoir lorsqu'au moins un nerf optique était intact.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de tester la vision des têtards en utilisant des réactifs et un matériel simples disponibles dans la plupart des laboratoires d'étude des amphibiens. Bonne chance dans vos expériences.

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