Un test comportemental simple pour tester la fonction visuelle dans Xenopus laevis

L’objectif global de cette procédure est de tester la fonction visuelle des têtards en enregistrant le temps que l’animal passe sur la moitié du réservoir d’essai qui est recouverte de noir. Pour ce faire, on élève d’abord les têtards aux stades 45 à 50. La deuxième étape consiste à installer un réservoir moitié noir, moitié blanc ainsi qu’une caméra pour le test de comportement.

Ensuite, placez un deuxième réservoir avec un têtard dans le réservoir extérieur. Pour chaque enregistrement de têtard, le comportement guidé par la vision en tant qu’arrière-plan dans son environnement est modifié. La dernière étape consiste à effectuer une sodomie rétinienne sur les têtards, puis à répéter le test de comportement.

En fin de compte, les données de ce test simple et peu coûteux sont utilisées pour montrer que les têtards préfèrent nager d’un côté du réservoir plutôt que de l’autre, dans le cadre de tests de vision photosupérieure. Le principal avantage de l’utilisation de cette méthode par rapport à d’autres techniques comme la réponse cinétique optique ou le test du tail flip, est qu’il s’agit d’une méthode simple et peu coûteuse qui utilise un équipement facilement disponible dans la plupart des laboratoires opus. Pour préparer les têtards, obtenez d’abord des embryons de xénope fécondés, mettez des marquants, des bagues modifiées ou du MMR dilué par un facteur de 10 dans des boîtes de Pétri de 60 millimètres avec 50 microgrammes par millilitre.

Gentamycine antibiotique placer blastula aux embryons au stade de plaque neurale. Étapes deux à 15 à 18 degrés Celsius dans les boîtes de Pétri. Une fois que les embryons atteignent une nouvelle tasse au stade favorable d’environ 27 à 30, passez-les à 0,1 XMMR sans antibiotiques pour permettre la croissance bactérienne intestinale.

Lorsque les têtards atteignent le stade d’alimentation vers le stade 45, déplacez-les dans des boîtes de Pétri de 100 millimètres avec 0,1 XMMR. Le lendemain, donnez-leur du surnageant de poudre d’ortie. Après une semaine dans la boîte de Pétri de 100 millimètres, remplissez un réservoir d’un demi-gallon avec de l’eau de grenouille.

Déplacez les animaux dans l’aquarium et continuez le programme d’alimentation du surnageant de poudre d’ortie, mais ne changez l’eau que deux à trois fois par semaine. Lorsque les animaux sont dans des réservoirs d’un demi-gallon, maintenez-les dans un cycle de lumière de 12 heures, d’obscurité de 12 heures avec les lumières allumées à 6h00 Avant le test, placez le réservoir d’un demi-gallon avec les sujets de test sur une surface blanche pendant la nuit pendant au moins 12 heures avant le test. Le test de comportement doit être effectué dans une zone calme et à faible trafic avec un éclairage fluorescent standard.

Préparez deux réservoirs d’essai d’un demi-gallon emboîtables dans les coins extérieurs de ce qui sera le réservoir intérieur. Utilisez un Sharpie pour marquer la ligne de flottaison à cinq centimètres au-dessus du fond. Également pour le réservoir intérieur, identifiez les divots à l’intérieur.

Remplissez-les d’un composé inerte pour éviter que les têtards ne s’y attardent. Portez maintenant l’attention sur le deuxième réservoir extérieur. Pour l’étape suivante, procurez-vous du ruban isolant noir et du papier de soie blanc.

Utilisez le ruban adhésif pour couvrir l’extérieur d’une moitié du réservoir et le papier de soie pour couvrir l’extérieur de l’autre, comme illustré ici. Une fois les réservoirs préparés, installez un plateau tournant d’inoculation et placez-y les réservoirs emboîtés. Positionnez un trépied et une webcam de manière à ce que la caméra puisse imager l’intérieur des réservoirs d’en haut.

Connectez la webcam à un ordinateur à l’aide d’un logiciel de capture et de lecture vidéo. Allumez l’appareil photo et préparez-vous à faire un nouvel enregistrement vidéo. Ensuite, drapez un chiffon en coton léger sur l’appareil photo et les réservoirs.

Pour réduire les indices externes aux têtards, utilisez un luminancemètre et vérifiez que la luminance sous le tissu est comprise entre 35 et 50 bougies par mètre carré. Commencez l’analyse du comportement en récupérant le réservoir d’essai intérieur. Remplissez-le d’eau de grenouille jusqu’à la marque des cinq centimètres.

Utilisez un filet pour transférer un animal de son contenant d’un demi-gallon au réservoir d’essai intérieur de l’ordinateur. Assurez-vous que le logiciel d’enregistrement est ouvert et qu’il enregistre la zone de test pour la tenue des registres. Écrivez le nom de l’animal, la date et l’heure sur une feuille de papier.

Placez-le sous la caméra pour l’enregistrement. Une fois cela fait, préréglez une minuterie sur deux minutes. Ensuite, orientez le réservoir extérieur sur la plaque tournante, de sorte que le côté noir soit à droite.

Placez maintenant le réservoir d’essai dans le réservoir extérieur. Dans la zone d’enregistrement, fermez le rideau et utilisez l’écran de l’ordinateur pour vous assurer de l’orientation du réservoir extérieur. Assurez-vous que la vidéo est en cours d’enregistrement et démarrez le minuteur.

Lorsque la minuterie émet un bip, maintenez le rideau en position et retirez le réservoir d’essai intérieur. Ensuite, faites pivoter le réservoir extérieur de 180 degrés de sorte que le côté noir soit maintenant sur la gauche. Remettez le réservoir d’essai dans le réservoir extérieur et démarrez la minuterie de deux minutes.

Encore une fois, retirez le réservoir intérieur. Faites pivoter le réservoir extérieur de 180 degrés et remplacez le réservoir intérieur toutes les deux minutes pour un total de 10 fois. Lorsque vous avez terminé, arrêtez l’enregistrement vidéo.

Remettez le têtard dans son réservoir d’un demi-gallon. Préparez un microscope pour effectuer l’ex-sodomie au rétinol. Remplissez une boîte de Pétri de 60 millimètres avec 1 %aros fondu dans 0,1 XMMR et laissez-la se solidifier.

Retirez un petit morceau rectangulaire de l’aros de la taille du têtard. Lorsque vous êtes prêt à continuer, récupérez l’animal de test et placez-le dans 0,02 % Trica. Continuez lorsqu’il ne répond pas à un pincement de la queue avec la pince numéro trois.

Transférez ensuite l’animal dans le plat. Procédez en montant la boîte de Pétri sur le microscope. Préparez-vous à caler l’animal avec une pince d’un côté.

Du côté opposé, utilisez une aiguille de calibre 25 pour percer la peau derrière la région dorsale de l’œil à un angle de 45 degrés, atteignez soigneusement le trou avec le numéro cinq, forceps et coupez le nerf optique tout en évitant la veine à côté. Retournez le nerf et rétractez les forceps après la chirurgie. Récupérez l’animal en le plaçant dans une boîte de Pétri de 100 millimètres avec 0,7 XMMR et 50 microgrammes par millilitre.

Gentamycine pendant 20 minutes. Après cela, transférez le têtard dans un réservoir de récupération avec de l’eau de grenouille. Placez le réservoir sur une surface blanche en préparation du test.

Laissez l’animal se reposer pendant la nuit. Le lendemain matin, utilisez le test comportemental pour tester la fonction visuelle. Cette vidéo présente des données représentatives de l’expérience.

À gauche, les animaux avant l’opération, à droite, les mêmes animaux après la sectionnement des axones rétiniens des deux yeux. Ceci est indiqué par le schéma dans les coins inférieurs. L’eau a été perturbée pour montrer que rien n’a été ajouté pour repousser les animaux du côté noir ou les attirer du côté blanc.

Les têtards pré-opératoires réagissent à la couleur de fond en moins de 30 secondes tandis que les têtards aveugles nagent sans but autour du réservoir. Ce graphique montre le pourcentage de temps passé dans les régions blanche et noire pour un seul animal dans trois conditions. Tout d’abord, l’animal a été observé avant toute intervention chirurgicale à l’aide du test.

Deux jours consécutifs après la sectionnement du nerf optique droit, son comportement a été observé pendant deux jours de tests. Enfin, après que les deux nerfs optiques aient été sectionnés, il y a eu deux autres jours d’observation avec le test. L’animal a passé plus de jours sur le côté blanc de l’aquarium lorsqu’au moins un nerf optique était intact.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de tester la vision des têtards à l’aide de réactifs et d’équipements simples trouvés dans la plupart des laboratoires de grenouilles. Bonne chance dans vos expériences.