Marqueur de surface cellulaire Purification médiation de iPS intermédiaires cellulaires à partir d'un modèle reprogrammable souris

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les rares intermédiaires de reprogrammation à partir de cultures de fibroblastes embryonnaires de souris en reprogrammation. Ceci est accompli en dérivant d’abord des fibroblastes embryonnaires de souris à partir d’embryons E 13.5 d’une souche de souris reprogrammable. Dans la deuxième étape, les fibroblastes embryonnaires de souris à faible passage sont ensemencés dans des milieux cellulaires souches pluripotents induits ou IPS complétés par de la doxycycline pour initier le processus de reprogrammation.

Ensuite, les cellules sont récoltées à des moments sélectionnés lors de la reprogrammation et marquées avec des anticorps contre des marqueurs de surface cellulaires spécifiques. En fin de compte, les rares intermédiaires de reprogrammation peuvent être isolés par des faits pour une analyse expérimentale plus approfondie. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que des études mécanistes peuvent être effectuées sur les rares intermédiaires de reprogrammation en l’absence de cellules réfractaires au processus de reprogrammation, qui constituent la majeure partie de la population. Pour générer des embryons de souris, des fibroblastes ou des me, commencez par transférer une corne utérine embryonnaire de 13,5 jours dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres contenant 10 millilitres de PBS stérile.

Ensuite, utilisez des ciseaux chirurgicaux stérilisés pour couper la corne en morceaux individuels, chacun contenant un embryon. Ensuite, sous un microscope de dissection dans une hotte de culture tissulaire, utilisez une pince stérilisée pour retirer soigneusement l’enveloppe utérine et la membrane embryonnaire supplémentaire entourant chaque embryon et transférez chaque embryon dénudé dans des boîtes individuelles de 10 centimètres avec 10 millilitres de PBS frais. Ensuite, procédez en retirant la tête, les membres, la queue et les organes internes de chaque embryon à l’aide d’une pince.

Congelez les têtes dans des tubes individuels de 1,5 millilitre pour le génotypage si nécessaire. Transférez chaque torse dans de nouvelles plaques individuelles de 10 centimètres et utilisez deux lames chirurgicales pour hacher chaque embryon pendant deux minutes. Digérez les morceaux de tissu dans 200 microlitres de trypsine EDTA pendant trois à cinq minutes à température ambiante, suivis de deux minutes supplémentaires de hachage.

Ensuite, inactivez l’essai avec deux millilitres de méthamphétamine et transférez la boue cellulaire dans un tube de 15 millilitres à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres. Dissociez mécaniquement le tissu à l’aide d’un pipetage doux, puis transférez la solution cellulaire dans une boîte de 10 centimètres recouverte de gélatine. Ajoutez 10 millilitres supplémentaires de méthamphétamine à la culture.

Après 24 à 48 heures, la plaque doit être densément recouverte de MEF pour reprogrammer les MEF, d’abord décongeler une culture de méthamphétamine congelée à faible passage dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, puis transférer le contenu dans un tube contenant 10 millilitres de méthamphétamine préchauffé. Après avoir fait tourner les cellules, remettez la pastille en suspension dans 12 millilitres de méthamphétamine fraîche et transférez la suspension cellulaire dans un récipient de culture T 75 enrobé de gélatine. Après une période de récupération de 24 à 48 heures, lavez les MEF avec du PBS, puis détachez les cellules avec trois millilitres de trypsine EDTA pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, arrêtez la digestion enzymatique avec cinq millilitres de méthamphétamine et dissociez davantage les cellules en les mélangeant doucement avec une pipette de 10 millilitres. Ensuite, reprogrammez les métas en ensemencant les cellules sur de nouvelles fioles T 75 enrobées de gélatine à 6,7 fois 10 au tiers des cellules par centimètre carré dans 12 millilitres de milieu IPSC contenant deux microgrammes par millilitre de doxycycline pendant les six premiers jours. Remplacer le milieu tous les deux jours par un milieu IPSE frais enrichi en doxycycline, en récoltant les intermédiaires de reprogrammation aux points temporels requis par détachement de trypsine EDTA, comme cela vient d’être démontré pour chaque suspension intermédiaire récoltée.

Lavez les cellules dans du PBS. Puis réanimation. Mettez les pastilles en suspension dans les supports de télécopie pour le marquage des anticorps afin d’établir des cultures IPSC entièrement reprogrammées.

Cultivez les cellules dans un milieu IPSC sans doxycycline pendant quatre à sept jours supplémentaires pour marquer les cellules reprogrammées. Étiquetez les produits intermédiaires récoltés avec les anticorps d’intérêt appropriés. Après 10 minutes, tapotez doucement les tubes pour remettre les cellules en suspension, puis placez les tubes sur de la glace pendant 10 minutes supplémentaires.

Après la deuxième incubation, lavez les cellules dans 10 millilitres de PBS froid par tube. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et remettez les pastilles en suspension dans un volume approprié de support de marquage complété par une strippin P taille sept sur de la glace. Après 20 minutes, lavez les cellules dans 10 autres gouttes de PBS froid et remettez en suspension les pastilles cellulaires dans un milieu de marquage complété par de l’iodure de propidium.

Filtrez les amas de cellules en faisant passer la suspension à travers une crépine de 70 micromètres, puis transférez les cellules dans les tubes de télécopie correspondants appropriés sur de la glace. Pour les contrôles de compensation. Resus suspend un flacon cryo de cellules IPS maintenu sur des mes irradiés dans 800 microlitres de tampon de marquage.

Réserve de 200 microlitres de cellules pour le contrôle non étiqueté. Ensuite, divisez la suspension cellulaire restante entre trois tubes de 15 millilitres pour les contrôles monocolores et étiquetez les échantillons comme cela vient d’être démontré pour analyser les intermédiaires par cytométrie en flux. Commencez par placer une barrière dans le nuage de points avant par côté pour exclure les débris.

Utilisez ensuite la hauteur de diffusion vers l’avant en fonction de la zone de diffusion vers l’avant pour exclure les agrégats et le canal PI par rapport à la diffusion vers l’avant. Pour se connecter aux cellules vivantes PI négatives. Utilisez les cellules non marquées pour ajuster les tensions des sept canaux FITC et PSI bleu Pacifique.

Positionner idéalement la population cellulaire à l’extrémité inférieure du canal respectif. Ensuite, réglez les portes avec les cellules de contrôle non marquées pour subfractionner les cultures de reprogrammation aux jours trois, six et neuf. Populations de SSEA : une cellule TH 1.2 positive négative, SSEA une cellule négative TH 1.2 négative et les intermédiaires de reprogrammation SSEA une cellule TH 1.2 négative positive.

Ensuite, subdivisez davantage le SSEA du neuvième jour, un positif TH 1,2 fraction négative avec le graphique SSEA un par rapport au graphique EPAM. À l’aide du contrôle non étiqueté, dessinez des portes autour des cellules positives EPAM et des cellules négatives EPAM, comme illustré ici. Enfin, collectez les cellules dans un à deux millilitres de milieu cellulaire IPS.

Lors de l’induction de la doxycycline, les mythes de reprogrammation subissent des changements morphologiques distincts vers le sixième jour. Des colonies précoces commencent à émerger et continuent à croître en taille au fur et à mesure de la culture. Une bonne expérience de reprogrammation aboutira à plus de 500 colonies par T 75 initialement ensemencées de cinq fois 10 à la cinquième cellule, et les cultures IPS établies posséderont des colonies caractéristiques en forme de dôme et seront pour la plupart dépourvues de cellules différenciées.

Les changements morphologiques et moléculaires au cours de la reprogrammation se reflètent dans les changements dans l’expression de la surface cellulaire de la cuisse 1,2, de SSEA un et, finalement, de l’epca. Alors que le MES est principalement positif pour la cuisse 1,2 et négatif pour les autres marqueurs, au troisième jour, une grande proportion de cellules ont commencé à réguler à la baisse l’expression de la cuisse 1,2, et un très petit sous-ensemble est devenu SSEA un positif. L’intermédiaire de reprogrammation réel pour ce point de temps les jours six et neuf, un pourcentage accru de cellules positives à SSEA un, généralement bien supérieur à 10 %, peut être détecté vers le 12e jour.

Un sous-ensemble de cellules positives à SSEA one peut être détecté qui sont également positives. Pour epca. Les cultures cellulaires IPS authentiques établies seront fortement positives.

Pour SSEA one et EPCA Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de n’utiliser que des cartes de passage bas qui ont été correctement génotypées au préalable.