Réalisé neurone dopaminergique différenciation de cellules pluripotentes humaines souches

L'objectif général de cette procédure est d'induire une différenciation très efficace de neurones dopaminergiques in vitro. Cela est réalisé en préparant d'abord une culture d'adhérence en cellules uniques de cellules souches pluripotentes humaines.

À la deuxième étape, le milieu de culture cellulaire est remplacé par un milieu d'induction neuronale afin d'induire les progéniteurs de la plaque du plancher. Ensuite, les neurones dopaminergiques sont cultivés dans un milieu de maturation. Puis, finalement, les progéniteurs de neurones dopaminergiques unicellulaires sont cultivés sur des plaques recouvertes de poly-L-ornithine et de laminine, dans le milieu de maturation pendant 30 jours.

En fin de compte, la microscopie en immunofluorescence peut être utilisée pour évaluer l'expression de marqueurs importants des neurones dopaminergiques. Cette technique présente un avantage supérieur par rapport au protocole existant de neurosphères à l'acide neuro. Elle permet de générer une population double neuronale plus homogène avec une efficacité accrue.

Quatre jours après le passage, aspirez le milieu des cultures cellulaires. Détachez les cellules avec un millilitre d'Accutase par puits et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pendant l'incubation, ajoutez un millilitre de gélatine dans chaque puits d'une plaque à six puits, puis placez la plaque ainsi que les plaques fraîchement préparées recouvertes de Matrigel dans l'incubateur.

Lorsque les cellules sont devenues semi-flottantes, les pipeter plusieurs fois de haut en bas pour obtenir une suspension monocellulaire. Ensuite, transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres et les centrifuger pendant trois minutes à 258 G et à température ambiante. Resuspendre le culot dans la quantité appropriée de milieu de culture de cellules souches pluripotentes humaines enrichi de sérum, puis ajouter de la thioredoxine à une concentration finale de deux millimolaires.

Ensuite, incuber les cellules dans les plaques revêtues de gélatine à un ratio de un pour un à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour éliminer les cellules nourricières au méthanol, transférer ensuite les cellules dans un nouveau tube de 15 millilitres. Les diluer dans un milieu pour cellules souches pluripotentes humaines, complété avec du sérum, puis les compter après une nouvelle centrifugation ; redisperser les cellules dans le milieu MT.SR un avec thias Ivan à une concentration de 180 000 cellules par millilitre.

Ensuite, aspirez le Matrigel des plaques revêtues et distribuez deux millilitres de cellules par puits. 48 heures. Après le repiquage des cellules dans les plaques de Matrigel.

Aspirez le milieu de chaque puits et lavez les cellules une fois avec du PBS. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu de différenciation KSR, complété avec SB 431542 et LDN 193189, aux cellules, en renouvelant le milieu chaque jour de J0 à J20, comme indiqué dans le tableau. Au jour 20, aspirez le milieu de différenciation et détachez les cellules avec un millilitre d’Acutase par puits à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Pendant l’incubation, réchauffez les plaques de poly-L-ornithine, de laminine ou de fibronectine dans l’incubateur.

Ensuite, après le rétablissement de la suspension, en maintenant les cellules détachées sous forme de suspension monocellulaire, diluez les cellules dans un milieu basique neurobasal. Après numération, centrifugez les cellules et remettez en suspension le culot dans le milieu de différenciation contenant du B-27, à une concentration d'un million de cellules par millilitre. Puis aspirez la fibronectine à partir des plaques de laminine polyornithine-fibronectine.

Les laver deux fois avec du PBS et transférer 400 microlitres de cellules dans chaque puits. Enfin, changer le milieu après les premières 24 heures, puis tous les deux jours jusqu'au point final de l'expérience, afin d'éliminer les cellules mortes non attachées. Comme illustré sur ces images, les cultures de cellules souches pluripotentes humaines monocellulaires replatées s'étendront sous forme d'agglomérats durant les premières 48 heures de différenciation, atteignant environ 70 % de confluence.

Après la différenciation, les cellules atteignent une confluence complète en seulement trois à quatre jours. Au jour 20, les cellules différenciées s'attachent et se développent en petits agrégats. Au cours des cinq jours suivants, des axones et des neurites beaucoup plus denses et morphologiquement intacts apparaissent au sein des agrégats, établissant certaines connexions entre eux.

Après 11 jours de différenciation, les cellules souches pluripotentes humaines peuvent être efficacement converties en précurseurs de la plaque du plancher. Comme le montrent ces images, presque toutes les cellules expriment les marqueurs cellulaires des précurseurs de la plaque du plancher, NESTIN et FOXA2, et plus de 90 % des cellules expriment CORIN, OTX2 et LMX1A. Après une différenciation supplémentaire, les cellules précurseurs de la plaque du plancher se spécialisent en neurones dopaminergiques exprimant TUJ1 et TH. Ces neurones dopaminergiques présentent une identité de type mésencéphalique, car ils expriment EN1 et sont négatifs pour la calbindine. Des expériences de coloration immunohistochimique montrent également l'absence d'astrocytes GFAP positifs et la présence de très peu de neurones GABAergiques, indiquant que la différenciation est exclusivement spécifique à la lignée des neurones dopaminergiques.

Lors des tests de cette procédure, il est important de maintenir une constance dans la culture cellulaire quotidienne et de s'assurer que le milieu est préparé fraîchement avec les ingrédients corrects.