Réalisé neurone dopaminergique différenciation de cellules pluripotentes humaines souches

L’objectif global de cette procédure est d’induire une différenciation très efficace des neurones dopaminergiques. In vitro. Ceci est accompli en préparant d’abord une culture d’adhésion cellulaire unique de cellules souches pluripotentes P humaines.

Dans la deuxième étape, le milieu de culture cellulaire est remplacé par un milieu d’induction neuronale pour induire les progéniteurs de la plaque de sol. Ensuite, les neurones dopaminergiques sont cultivés dans des milieux de maturation. Et enfin, les progéniteurs des neurones dopaminergiques unicellulaires sont cultivés sur des plaques de fibronectine stratifiées poly L ornithine et des milieux de maturation pendant 30 jours.

En fin de compte, la microscopie d’immunofluorescence peut être utilisée pour évaluer l’expression d’importants marqueurs neuronaux dopaminergiques. Cette technique présente un plus grand avantage par rapport au protocole existant de la neurosphère sur les neuroacides. Il peut générer une population neuronale double plus homogène avec une efficacité plus élevée.

Quatre jours après le passage, aspirez le milieu des cultures cellulaires. Détachez les cellules avec un millilitre d’Accutane par puits et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pendant l’incubation, ajoutez un millilitre de gélatine dans chaque puits d’une plaque à six puits, puis placez la plaque avec des plaques fraîchement préparées enrobées de matri gel dans l’incubateur.

Lorsque les cellules sont devenues semi-flottantes, pipetez-les de haut en bas plusieurs fois pour former une suspension unicellulaire. Ensuite, tirez les cellules dans un tube de 15 millilitres et centrifugez-les pendant trois minutes. À 258 g et à température ambiante, remettre la pastille en suspension dans la quantité appropriée de milieu de culture de cellules souches pluripotentes humaines complétée par du sérum et ajouter cette vivine à une concentration finale de deux millimolaires.

Ensuite, incubez les cellules dans les plaques enrobées de gélatine dans un rapport de un pour un à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour retirer les mangeurs de méthamphétamine, transférez les cellules dans un nouveau tube de 15 millilitres. Diluez-les dans un milieu de cellules souches pluripotentes humaines, complété par du sérum, et comptez-les après avoir fait tourner à nouveau les cellules, puis suspendez les cellules dans MT.SR un milieu avec thias Ivan à une concentration de 180 000 cellules par millilitre.

Ensuite, aspirez le matrigel des plaques enrobées et distribuez deux millilitres de cellules par puits. 48 heures. Après avoir replaqué les cellules dans les plaques de matrigel.

Aspirez le milieu de chaque puits et lavez les cellules une fois avec du PBS. Ajoutez ensuite deux millilitres de différenciation KSR, milieu complété par SB 4 31, 50 42 et L DN 1 9 3 1 8 9 aux cellules en changeant le milieu chaque jour de D zéro à D 20 comme indiqué dans le tableau du jour 20, aspirez le milieu de différenciation et détachez les cellules d’un millilitre de 37 degrés Celsius acutus par puits à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pendant l’incubation, réchauffez les plaques de fibronectine de poly orine laminine dans l’incubateur.

Ensuite, après Resus, en suspendant les cellules détachées en une suspension unicellulaire, diluez les cellules dans le milieu neurobasal. Après le comptage, faites tourner les cellules et remettez en suspension la pastille dans le milieu de différenciation B 27 à une concentration de 1 million de cellules par millilitre. Ensuite, aspirez la fibronectine des plaques de fibronectine de polyol orine laminine.

Lavez-les deux fois avec du PBS et transférez 400 microlitres de cellules dans chacun. Enfin, changez de milieu après les premières 24 heures, puis tous les deux jours jusqu’au point final expérimental pour éliminer toutes les cellules mortes non attachées. Comme illustré sur ces images, les cultures de cellules souches pluripotentes humaines unicellulaires replaquées se développeront en grappes au cours des 48 premières heures de différenciation, atteignant environ 70 % de confluence.

Après la différenciation, les cellules atteignent leur pleine confluence en aussi peu que trois à quatre jours. Au 20e jour, les cellules différenciées se fixent et se développent en petits amas. Au cours des cinq jours suivants, des axones et des neurites beaucoup plus intensifs et morphologiquement intacts apparaissent à l’intérieur des amas, formant des connexions entre les amas.

Après 11 jours de différenciation, les cellules souches pluripotentes humaines peuvent être efficacement converties en précurseurs de plaque de sol. Comme le montrent ces images, presque toutes les cellules expriment le précurseur de la plaque de sol, les marqueurs cellulaires s’emboîtent et le renard A deux et plus. 90 % des cellules expriment Corin O OTX deux et LM X un A.Après une différenciation plus poussée, les cellules précurseurs de la plaque de sol se spécialisent dans les neurones dopaminergiques qui expriment TUJ one et TH. Ces neurones dopaminergiques ont une identité neuf car ils expriment GK deux et sont négatifs pour la calbindine Les expériences d’immunocoloration démontrent également qu’il n’y a pas d’astrocytes GFAP et très peu de neurones GABAergiques, indiquant que la différenciation est exclusivement spécifique pour la lignée des neurones dopaminergiques.

Lors de la mise à l’essai de cette procédure, il est important de maintenir une cohérence dans la culture cellulaire quotidienne et de s’assurer que le milieu est fraîchement préparé avec les bons ingrédients.