Name: Application de deux tétranyque Tetranychus urticae Détudes des plantes-parasites interaction (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Découvrez une méthode efficace pour collecter et appliquer Tetranychus urticae sur des plantes expérimentales. Ce protocole permet une quantification rapide des dommages par la méthode de la grille pour étudier les interactions plantes-parasites.

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Ce projet a été financé par le gouvernement du Canada par l’intermédiaire de Génome Canada et de l’Institut de génomique de l’Ontario (OGI-046), et du Fonds pour la recherche en Ontario – Leadership mondial en génomique et en sciences de la vie GL2-01-035 (à M.G. et V.G.). T.V.L. est boursier postdoctoral du Fonds pour la recherche scientifique en Flandre (FWO).

1. Maintien de la tétranyque population REMARQUE: Les acariens sont élevés sur la Californie de haricots rouges (Phaseolus vulgaris). <ol><li> Faire pousser des plantes à partir de graines de soja pour 2-3 semaines avant l&#39;infestation. </li><li> Intermix ces plantes avec les plantes infestées; acariens adultes seront rapidement coloniser matériel végétal frais. </li><li> Enlever les vieux plants de haricots infestés tous les 7-10 jours, pour les remplacer par des plantes fraîches. </li></ol> 2. Collecte femelle adulte acariens <ol><li> Mite Collection en utilisant la méthode de lavage <ol><li> Pour recueillir les acariens, placez un plant de haricot frais en contact avec les plantes infestées 1 à 2 jours avant l&#39;expérience. </li><li> Utilisez 20 à 30 plants de haricots frais pour recueillir 1.000 à 2.000 femmes adultes acariens. </li><li> Préparer une solution de Tween 20 à 0,001% en utilisant l&#39;eau du robinet à température ambiante. </li><li> Laver les plants de haricots infestés dans la solution de Tween 20, en utilisant 2 à 3 plantes à la fois. </li><li&gt; Chaque plante est lavée 2-3x pour recueillir tous les acariens de feuilles. </li><li> Terminé l&#39;étape 2.1.4 dans les 10 min pour éviter la mortalité des acariens. </li></ol></li><li> Isolation des adultes femelles acariens par filtration de la suspension Mite à travers des tamis de maillage défini <ol><li> Préparer tamis de la taille des mailles suivantes: 500 um (pour enlever les débris) et 300 um (pour recueillir les acariens femelles adultes) (figure 1A). </li><li> Filtrer la suspension à travers le tamis de 500 um. </li><li> ReFilter la suspension à travers le tamis de 300 um. Les femelles adultes seront conservés. </li><li> Trempez un tamis de 300 um d&#39;acariens femelles adultes dans l&#39;eau du robinet pour éliminer le Tween 20. </li><li> Etaler les acariens en une seule couche dans le bas du tamis. </li><li> Utilisez une serviette en papier pour enlever l&#39;excès d&#39;eau de la maille et les côtés du tamis. NOTE: Ceci est fait parce acariens doivent sécher rapidement afin de récupérer. </li><li> Préparer un ensemble tel que représenté sur la figure 1B; ce qui permettra acariens de se déplacer librement, mais les empêcher de s&#39;échapper. </li><li> Placer le tamis avec des acariens sur le dessus du tamis qui est utilisé en tant que support. </li><li> Entourez tamis de fond avec de l&#39;eau pour empêcher les acariens de se disperser. REMARQUE: Les acariens va commencer la récupération après environ 5 min. Après environ 30 min, le nombre d&#39;acariens mobiles est suffisant pour commencer la collection (figure 1D). Acariens doivent être recueillies dans 1 heure, car ils produisent de la soie qui va interférer avec la collection. </li></ol></li></ol> 3. Infestation des plantes par des acariens REMARQUE: Une fois les acariens femelles adultes ont récupéré, ils peuvent être utilisés pour l&#39;infestation de la plante. Il ya deux méthodes utilisées pour infester les plantes expérimentales avec les acariens femelles adultes: a) à l&#39;aide d&#39;un pinceau fin (section de protocole 3.1) et b) à l&#39;aide d&#39;une pompe ou d&#39;une ligne de vide (section du protocole 3.2). <ol><li> Infestation par les acariens à l&#39;aide d&#39;un pinceau REMARQUE: Araignée infestation par les acariensavec une brosse est utilisée pour l&#39;application d&#39;un maximum de 30 acariens par plant. <ol><li> Utilisez un cheveu doux ronde art pinceau de taille 00 ou plus fin. </li><li> Mouiller la brosse avec de l&#39;eau du robinet RT. </li><li> Ramasser délicatement les acariens de la tamis en utilisant la pointe du pinceau et de les transférer à l&#39;usine. </li></ol></li><li> Infestation par les acariens à l&#39;aide d&#39;une pompe REMARQUE: l&#39;infestation des plantes par les acariens recueillies par une ligne / pompe à vide est utilisé lorsque plus de 30 acariens sont appliquées. Par ce procédé, une pompe à vide pour le ramassage de composants microélectroniques ou une ligne de vide peut être utilisé. Il est important de maintenir constant le débit d&#39;air et d&#39;une résistance suffisante (2-4 psi). <ol><li> Attacher un embout de pipette de 1 ml pour le tube qui relie à la conduite de pompe à vide ou à l&#39;aide d&#39;une coupe de 1,5 ml de tube de centrifugation à fond comme un adaptateur entre le tube / pompe à vide et la pointe. </li><li> Placez un morceau de serviette en papier entre la pointe de la pipette et l&#39;adaptateur (1,5 ml de tube de centrifugation). NOTE: le but est de piéger les acariens à l&#39;intérieur til embout de pipette pendant le processus d&#39;aspiration et également de réduire le débit d&#39;air (figure 1C). </li><li> Collecter les acariens directement depuis le tamis à l&#39;aide de la pointe de pipette. </li><li> Sinon, recueillir les acariens un par un à partir de feuilles infestées à l&#39;aide d&#39;un stéréoscope. </li><li> Lorsque le nombre requis d&#39;acariens ont été recueillies, retirer l&#39;embout de la pipette à partir du tube, en s&#39;assurant que le morceau de serviette en papier à l&#39;arrière de la pointe de la pipette n&#39;est pas perturbé. </li><li> Collecter les acariens en tapant sur la pointe de la pipette et l&#39;agglutination des acariens ensemble. Ensuite, placez-les sur la feuille; quelques secondes, les acariens vont commencer à se disperser sur la feuille. </li></ol></li></ol> 4. Enregistrement et l&#39;évaluation des dommages plantes <ol><li> Dommages de l&#39;usine d&#39;enregistrement REMARQUE: Pour A. thaliana, dommages aux plantes est évaluée après 4 jours d&#39;acariens alimentation. Dommages est enregistré comme la surface totale des taches chlorotiques. Pour la mesure des dégâts, l&#39;ensemble de la rosette est coupé et balayé.paramètres d&#39;analyse décrites sont d&#39;un scanner Epson V30 mais agira comme un bon point de départ pour tout scanner à plat similaire. Gardez paramètres de balayage constant pour toutes les expériences permettant la comparaison entre les expériences individuelles pistes. <ol><li> Couvrir vitre du scanner avec une feuille de transparence pour éviter de contaminer la surface du scanner avec du matériel végétal. </li><li> Couper une rosette entière et les placer sur la vitre du scanner afin adaxial côté (supérieur) de feuilles sont confrontés à la source de lumière du scanner et de l&#39;élément de capture. Alternativement, si rosettes sont trop denses pour capturer feuilles individuelles sans chevauchement, disséquer la rosette en feuilles ou des groupes de feuilles non-chevauchement avec des ciseaux fins individuelles avant de placer sur la vitre du scanner. Rosettes multiples peuvent être analysés simultanément. </li><li> Couvrir rosettes ou des feuilles avec un morceau de papier blanc pour empêcher l&#39;adhésion et la contamination de la capot du scanner. </li><li> Fermer le couvercle du scanner et effectuer une analyse avec les paramètres suivants: Résolution: 1,200 dpi; Mode couleur: Adobe RVB; Luminosité: 25; Type de fichier: JPEG de qualité maximale. </li><li> Enregistrer des fichiers image pour une analyse ultérieure de dommages. </li></ol></li><li> Dommages de l&#39;usine de quantification REMARQUE: La zone de dégâts est calculé manuellement à l&#39;aide de Photoshop. En raison des grandes différences dans la forme des feuilles et de l&#39;intensité des couleurs et des symptômes à la suite de l&#39;alimentation des acariens, des méthodes automatiques ne sont pas fiables. Ainsi, une méthode de grille est utilisée pour évaluer les dégâts de la plante: <ol><li> Ouvrez l&#39;image de la plante avec Photoshop. </li><li> Créez un nouveau calque, puis superposer l&#39;image numérisée avec une grille de 0,25 mm x 0,25 mm divisions (Voir ou Affichage - Afficher - Grille, raccourci clavier Ctrl + &#39;). </li><li> Sur une couche de revêtement, marquer les zones de feuilles endommagées en utilisant un point (utiliser le &quot;Outil Crayon&quot;, raccourci clavier B). Utiliser un seul point pour chaque carré de la grille au-dessous de laquelle il ya des dommages couvrant plus de la moitié de l&#39;unité de grille. La taille du point est définie en pixels (par exemple, </em&gt; 52 pixels par point). </li><li> Lorsque toutes les cases de la grille présentant des défauts de l&#39;usine couvrant au moins la moitié de l&#39;unité de grille sont marqués d&#39;un point, utilisez l&#39;outil de l&#39;histogramme (Fenêtre - histogramme) pour déterminer le nombre total de pixels sur la couche. L&#39;outil de l&#39;histogramme permet de se mesurer le nombre de pixels. Etant donné que chaque point est représenté par un nombre constant et connu de pixels, l&#39;outil d&#39;histogramme mesurer le nombre total de pixels, représentant le nombre total de points, et, par extension, le nombre total de carrés marqués. </li><li> Calculer le nombre de &quot;points&quot; marqués à l&#39;aide de la formule: Nombre de points = nombre total de pixels / nombre de pixels par point. </li><li> Calculer la surface totale de dommages en multipliant le nombre de points marqués sur l&#39;image de la zone d&#39;une place de la grille, comme un point correspond à une case de la grille. </li></ol></li></ol>

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<li>Kliebenstein, D., Pedersen, D., Barker, B., Mitchell-Olds, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+quantitative+trait+loci+controlling+glucosinolates%2C+myrosinase+and+insect+resistance+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of quantitative trait loci controlling glucosinolates, myrosinase and insect resistance in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 161, 325-332 (2002).</li>
<li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+jasmonate+in+response+and+tolerance+of+Arabidopsis+to+thrip+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Function of jasmonate in response and tolerance of Arabidopsis to thrip feeding.</a> Plant & cell physiology. 49, 68-80 (2008).</li>
<li>Whiteman, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+plant-herbivore+interface+with+a+leafmining+Drosophila+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+ecology%22%5BJournal%5D)">Mining the plant-herbivore interface with a leafmining Drosophila of Arabidopsis.</a> Molecular ecology. 20, 995-1014 (2011).</li>
<li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4674-4677 (2012).</li>
<li>Kim, J. H., Lee, B. W., Schroeder, F. C., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+indole+glucosinolate+breakdown+products+with+antifeedant+effects+on+Myzus+persicae+%28green+peach+aphid%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid).</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 54, 1015-1026 (2008).</li>
<li>Adio, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+defensive+function+of+Ndelta-acetylornithine%2C+a+jasmonate-induced+Arabidopsis+metabolite%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and defensive function of Ndelta-acetylornithine, a jasmonate-induced Arabidopsis metabolite.</a> Plant Cell. 23, 3303-3318 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tomato+homolog+of+CORONATINE-INSENSITIVE1+is+required+for+the+maternal+control+of+seed+maturation%2C+jasmonate-signaled+defense+responses%2C+and+glandular+trichome+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development.</a> Plant Cell. 16, 126-143 (2004).</li>
<li>Kant, M. R., Ament, K., Sabelis, M. W., Haring, M. A., Schuurink, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+timing+of+spider+mite-induced+direct+and+indirect+defenses+in+tomato+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential timing of spider mite-induced direct and indirect defenses in tomato plants.</a> Plant Physiol. 135, 483-495 (2004).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cette vidéo montre protocoles utilisés pour isoler et à infester les plantes avec un grand nombre d&#39;acariens femelles adultes. Bien que nous avons présenté ce protocole en utilisant A. thaliana, il peut être utilisé pour n&#39;importe quel système d&#39;interaction plante-araignée acariens et est actuellement appliquée avec succès aussi sur la tomate et la vigne (Vitis vinifera) plantes. Les rendements de protocole résultats reproductibles, ce qui indique que les acariens sont collectées de l&#39;é...

Interaction plante-ravageur est un sujet de grande importance scientifique et économique. Il a été historiquement étudiée en utilisant les deux plantes de culture (comme la tomate) et la plante modèle, R. thaliana. Dans les deux cas, la sensibilité de la plante à herbivore peut être mesuré soit directement par l&#39;évaluation du phénotype de la plante après herbivore attaque ou indirectement par le biais de l&#39;évaluation de la performance des ravageurs. Les mesures directes de la sensibilité de la plante ont été utilisées précédemment pour un certain nombre d&#39;espèces d&#39;insectes nuisibles en utilisant une gamme de méthodes. Par exemple, le broutage des larves de lépidoptères est mesurée comme une estimation de la partie du tissu de la plante consommée soit par Plutella xylostella (teigne) ou Trichoplusia ni (arpenteuse du chou) à l&#39;œil nu à l&#39;aide d&#39;une grille 12. En outre, il existe des méthodes qui utilisent l&#39;imagerie numérique de l&#39;endommagement de la feuille postérieure avec une analyse quantitative de l&#39;image. Ces méthodes ont été utilisées dansétudes de A. interaction thaliana avec Frankliniella occidentalis (les thrips des petits fruits) 13, Scaptomyza flava (drosophile feuille-mines) 14, et T. ni 15. Les mesures indirectes de la sensibilité de la plante sont largement utilisés dans les études d&#39;interaction plante-parasite. Par exemple, la sensibilité de A. thaliana à Myzus persicae puceron herbivores est généralement évaluée par l&#39;analyse de la fécondité des ravageurs et la description de la morphologie d&#39;une plante après interaction 16,17. Un autre indicateur indirect typique de A. thaliana sensibilité à un parasite est une évaluation du poids sec ou humide de la herbivore. Ce paramètre est couramment utilisé pour caractériser les herbivores de lepidoterans, Pieris rapae tels que (petit blanc), P. xylostella, ou T. ni à leur larves ou des pupes en scène 15,17. Les acariens sont des cellules contenu feeders. Dommages aux acariens est reconnu comme une collection de taches chlorotiques dont la couleur va du blanc au vert pâle. La sensibilité d&#39;une plante hôte à tétranyque herbivores a déjà été évalué, soit indirectement par le biais de l&#39;analyse de jours de performance de tétranyque post-infestation 18,19, ou directement en utilisant morphologie des plantes semaines post-infestation 18 ou en utilisant un appareil d&#39;imagerie numérique de feuilles exposées aux acariens pour les jours à la suite l&#39;analyse automatique d&#39;image 19. Ces méthodes ont été mises au point et utilisées pour des études d&#39;interactions entre les plants de tomates et T. urticae, et généralement utilisé un petit nombre de tétranyques (5-15 par traitement) qui ont été collectées à partir de la population d&#39;acariens mixte et ont été placés sur la surface de la feuille à l&#39;aide d&#39;une brosse à poils doux. Cependant, ces procédés ne conviennent pas pour des études où un plus grand nombre d&#39;acariens doivent être appliquées. En outre, alors que le traitement direct des images de feuilles dans le logiciel d&#39;analyse d&#39;imagetels que Adobe Photoshop (San Jose, CA) ou ImageJ 20 peuvent être utilisés pour l&#39;analyse des dommages de tomate, ces protocoles doivent être modifiés pour être appliquée à des feuilles qui ont une plus grande réflectivité de la surface ou sont légèrement colorés et avoir trichomes très visibles ( par exemple, A. thaliana) qui interfèrent avec la sélection automatique des taches chlorotiques qui marquent dommages aux plantes. En outre, le stade de développement des acariens qui peuvent être facilement utilisés avec les méthodes précédentes est limitée aux femmes adultes les plus répandues et facilement identifiables et s&#39;oppose à l&#39;utilisation d&#39;autres stades de développement. La première étape critique vers l&#39;analyse à haut débit de l&#39;usine-acarien interaction est d&#39;établir des protocoles simples et robustes et reproductibles pour contester les plantes avec les acariens et fiable d&#39;évaluer les résultats d&#39;interaction. Dans cette vidéo, une méthode efficace pour la collecte rapide et facile d&#39;un grand nombrenombre d&#39;acariens femelles adultes, leur application sur une plante hôte expérimental, et l&#39;évaluation des dommages de l&#39;usine en raison de l&#39;acarien alimentation sont décrits. Le protocole présenté permet la collecte rapide et efficace de centaines de personnes à tous les stades de développement (œufs, larves, nymphes, adultes mâles et les femelles) qui peut être utilisé pour l&#39;application expérimentale ultérieure. En outre, ces protocoles peuvent être appliqués à n&#39;importe quelle plante acarien hôte, mais sont particulièrement démontré dans le cas de A. thaliana.

<table><tbody><tr><td>Matériel végétal :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Haricot rouge de Californie</td><td>Stokes, Thorold, ON, Canada</td><td></td><td>âgé de 2 semaines, bien infesté de tétranyques 2 ou 3 jours avant utilisation. D’autres cultivars de Phaseolus vulgaris peuvent être utilisés.</td></tr><tr><td>Produits chimiques :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td> La <td>solution mère à 1 % est préparée pour simplifier l’aliquote Eau</td></tr><tr><td></td><td></td><td>du robinet</td><td>À température ambiante, les chocs thermiques et froids affectent le taux de survie et les performances des acariens</td></tr><tr><td>Autres matériaux et équipements :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plateau</td><td></td><td></td><td></td>en plastique</tr><tr><td>Ensemble de ciseaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Béchers</td><td></td><td></td><td></td>de 2 L</tr><tr><td>Essuie-tout</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeux de tamis</td><td>Fabriqué en interne</td><td></td><td>Des instructions détaillées sont disponibles</td></tr><tr><td>Brosse</td><td></td><td></td><td></td>fine</tr><tr><td>Pipettes Pointes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>de pipette</td><td>0,2 et 1 ml</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 1,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompe à</td><td></td><td></td> air <td>Pompe de type aquarium avec flux d’air inversé. Une ligne de vide peut être utilisée. La perte de charge requise est d’environ 2 à 4 psi</td></tr><tr><td>Scanner stéréoscopique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Epson</td><td>V30</td><td>N’importe quel scanner à plat permettant le degré de contrôle nécessaire sur la qualité de numérisation. Nous utilisons Epson V30 pour nos expériences.</td></tr><tr><td>Ordinateur</td><td></td><td></td><td>Windows ou OS X PC compatible avec le matériel de numérisation et le logiciel Adobe Photoshop.</td></tr><tr><td>Logiciel Adobe Photoshop</td><td>Adobe Systems Inc., San Jose, CA, États-Unis</td><td>divers</td><td>Toute version avec outil d’histogramme inclus.</td></tr></tbody></table>

application de deux tétranyque<em&gt; tetranychus urticae</em&gt; d&#39;études des plantes-parasites interaction

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Le tétranyque à deux points, Tetranychus urticae, est un herbivore polyphage arthropodes omniprésente qui se nourrit d&#39;une remarquable large éventail d&#39;espèces, avec plus de 150 de la valeur économique. Il est un ravageur important des cultures de serre, en particulier dans les solanacées et les cucurbitacées (par exemple, les tomates, aubergines, poivrons, concombres, courgettes) et les plantes ornementales (par exemple, roses, chrysanthèmes, œillets), les cultures annuelles (telles que le maïs, le coton, soja et la betterave à sucre), et dans des cultures pérennes (luzerne, fraises, raisins, agrumes, et les prunes) 1,2. En plus de la polyphagie extrême qui en fait un nuisible agricole importante, T. urticae a tendance à développer une résistance à un large éventail d&#39;insecticides et acaricides qui sont utilisés pour le contrôle 3-7. T. urticae est un excellent organisme expérimental, car elle a un cycle de vie rapide (7 jours à 27 ° C)et peut être facilement maintenue à une densité élevée dans le laboratoire. Méthodes de dosage de l&#39;expression du gène (y compris l&#39;hybridation in situ et dans la coloration des anticorps) et pour inactiver l&#39;expression de gènes endogènes de tétranyques en utilisant l&#39;interférence de l&#39;ARN ont été mis au point 10.8. Récemment, la séquence complète du génome de T. urticae a été rapporté, la création d&#39;une opportunité de développer ce ravageur herbivore comme un organisme modèle de ressources génomiques équivalentes qui existent déjà dans certains de ses plantes hôtes (Arabidopsis thaliana et la tomate Solanum lycopersicum) 11. Ensemble, ces organismes modèles pourraient fournir des indications sur les bases moléculaires des interactions plante-parasite. Ici, une méthode efficace pour la collecte rapide et facile d&#39;un grand nombre d&#39;acariens femelles adultes, leur application sur une plante hôte expérimental, et l&#39;évaluation des dommages de l&#39;usine en raison de l&#39;acarien alimentation sont décrits. Le protocole présenté enables collection rapide et efficace de centaines de personnes à tous les stades de développement (œufs, larves, nymphes, adultes mâles et les femelles) qui peut être utilisé pour l&#39;application expérimentale ultérieure.

Utilisation de 20 à 30 plants de haricots infestés, on peut recueillir près de 2.000 femmes adultes acariens en utilisant des tamis. Le temps nécessaire pour infester 10 plantes avec 20 acariens par plant est d&#39;environ 15 min si vous utilisez une brosse à transférer les acariens. Combinaisons de collecte et les méthodes d&#39;application sont présentés dans la figure 2. Ce protocole génère des résultats reproductibles de dégâts à la plante, ce qui démontre que les acarie...

Protocoles pour la préparation efficace des échantillons homogènes de tétranyques, l&#39;infestation de plantes expérimentales et l&#39;évaluation des dommages aux plantes, tel que requis pour les études d&#39;interaction plante-ravageur ont été développés.

Application de deux tétranyque<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; D&#39;études des plantes-parasites interaction

The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae, is a ubiquitous polyphagous arthropod herbivore that feeds on a remarkably broad array of species, with ...

L'objectif général de cette procédure est de collecter rapidement et de manière fiable des acariens à un stade de développement donné. Cette opération s'effectue tout d'abord en faisant se développer les acariens sur des plants de haricot. Ensuite, la plante expérimentale est infestée avec des femelles à l’aide d’un pinceau ou d’une pompe, selon le nombre d’acariens à appliquer sur une seule plante.La dernière étape consiste en une quantification manuelle des dégâts causés aux plantes à l'aide de la méthode de la grille dans un logiciel de retouche d'images. Enfin, une analyse statistique est utilisée pour montrer la susceptibilité différentielle des lignées ou écotypes végétaux à l'acarien tisserand. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans sa capacité à fournir une méthode efficace pour la collecte rapide et facile d'un grand nombre d'acariens femelles adultes, leur application sur un hôte végétal expérimental, ainsi que l'évaluation des dégâts causés aux plantes par l'alimentation des acariens.Le protocole présenté permet la collecte rapide et efficace de centaines d'individus à n'importe quelle étape du développement, pouvant être utilisés pour des applications expérimentales ultérieures. Commencez par faire pousser des plants de haricot rouge de Californie à partir de graines pendant deux à trois semaines avant l'infestation, puis mélangez ces plants avec des plants infestés. Les acariens adultes coloniseront rapidement le matériel végétal frais.Retirez les anciennes plantes de haricot infestées toutes les sept à dix jours et remplacez-les par des plantes fraîches afin de collecter les acariens à l’aide de la méthode de lavage. Placez une plante de haricot fraîche en contact avec les plantes infestées un à deux jours avant l’expérience. Utilisez 20 à 30 plantes de haricot fraîches pour collecter de 1000 à 2000 femelles adultes d’acariens.Le jour de l'expérience, couper l'acarien. Placer les plants de haricot infestés à la base, puis laver les plants infestés deux à trois plants à la fois dans une solution de Tween 20 à 0,001 %. Chaque plante est lavée deux à trois fois afin de recueillir tous les acariens présents sur les feuilles.Travailler dans un délai de 10 minutes afin d'éviter la mortalité des acariens. Ensuite, préparer un tamis de 500 micromètres pour éliminer les débris et un tamis de 300 micromètres pour recueillir les femelles adultes. Filtrer la suspension à travers le tamis de 500 micromètres, puis remplir à nouveau la suspension à travers le tamis de 300 micromètres.Les femelles adultes de tétranyques sont retenues si trop d'écume s'est accumulée dans le tamis. À l'aide d'un filet d'eau à température ambiante, il est possible de rincer délicatement les tétranyques. Plongez un tamis de 300 micromètres contenant des femelles adultes de tétranyques dans de l'eau du robinet propre afin d'éliminer le Tween 20, puis répartissez les tétranyques en une seule couche au fond du tamis.Utilisez une serviette en papier pour éliminer l'excès d'eau du tamis et des parois du tamis, afin que les acariens puissent sécher rapidement et se rétablir. Ensuite, placez un tamis contenant les acariens au-dessus du tamis utilisé comme support. Entourez le tamis inférieur d'eau pour empêcher les acariens de se disperser.Cela permettra aux acariens de se déplacer librement, tout en les empêchant de s'échapper. L'infestation par les tétranyques à l'aide d'un pinceau sert à appliquer jusqu'à 30 acariens par plante. Utilisez un pinceau rond à poils souples de taille zéro, zéro ou plus fine.Mouillez le pinceau avec de l’eau du robinet à température ambiante. Ramassez délicatement les acariens du tamis à l’aide de la pointe du pinceau et transférez-les sur la plante. Lorsque plus de 30 acariens sont appliqués, l’infestation de la plante est réalisée à l’aide d’acariens collectés par une ligne de vide aspirée par pompe.Pour cette méthode, fixez une pipette d'un millilitre à un tube reliant la pompe ou la ligne sous vide à l'aide d'un tube de centrifugation de 1,5 millilitre. Coupez le fond du tube pour en faire un adaptateur entre le tube sous vide de la pompe et la pipette, puis placez un morceau de papier essuie-tout entre la pipette et l'adaptateur. L'objectif est de piéger les acariens à l'intérieur de la pipette durant le processus d'aspiration, tout en réduisant le débit d'air, afin de collecter directement les acariens à partir du tamis à l'aide de la pipette.Alternativement, recueillir les acariens un par un à partir des feuilles infestées à l’aide d’un stéréomicroscope. Une fois le nombre requis d’acariens collecté, retirer l’embout de la pipette du tube, en veillant à ne pas déranger le morceau de papier essuie-tout situé à l’arrière de l’embout.Recueillez les acariens en tapotant l'extrémité de la pipette et en les regroupant. Ensuite, déposez-les sur la feuille. En quelques secondes, les acariens commenceront à se disperser sur la feuille.Pour enregistrer les dégâts sur la plante, recouvrez le plateau du scanner d'une feuille transparente afin d'éviter de contaminer la surface du scanner. Avec le matériel végétal, coupez une rosette entière et placez-la sur le plateau du scanner.Ainsi, la face adaxiale des feuilles est orientée vers le scanner. Grâce à la source lumineuse et à l’élément de capture, plusieurs rosettes peuvent être numérisées simultanément. Sinon, si les rosettes sont trop denses pour permettre la capture de feuilles individuelles sans chevauchement, disséquez la rosette en feuilles individuelles ou en groupes de feuilles non superposées à l’aide de ciseaux fins avant de les placer sur le scanner.Couvrez les rosettes ou les feuilles du lit de culture avec une feuille de papier blanc afin d'éviter qu'elles n'adhèrent au capot du scanner et ne le contaminent. Fermez le capot du scanner et effectuez une numérisation avec une résolution de 1 200 ppp, une luminosité réglée à +25 et un type de fichier en jpeg de qualité maximale. Enregistrez les fichiers d'image pour une analyse ultérieure des dommages.Pour quantifier les dégâts subis par la plante, ouvrez l'image de la plante avec Photoshop. Créez un nouveau calque. Superposez ensuite l'image scannée avec la grille constituée de points espacés de 25 millimètres.Des divisions de 25 millimètres sur une couche superposée. Indiquez les zones de feuilles endommagées à l’aide d’un point tracé avec l’outil crayon. Utilisez un seul point pour chaque carré de la grille ci-dessous où les dégâts couvrent plus de la moitié de l’unité de la grille.La taille du. est définie en pixels. Lorsque toutes les cases de la grille montrant des dommages aux plantes couvrant au moins la moitié de l'unité de la grille sont marquées d'un point, utilisez un outil d'histogramme pour déterminer le nombre de pixels sur le calque représentant le nombre de points, et par conséquent le nombre total de cases marquées.Calculez le nombre de points marqués en divisant le nombre total de pixels par le nombre de pixels par point. Calculez la surface totale des dégâts en multipliant le nombre de points marqués sur l'image par la surface d'un carré de la grille, un point correspondant à un carré de la grille. Ce graphique affiche la surface des dégâts mesurée sur des plantes AANA âgées de trois semaines.Quatre jours après l'application de 20 femelles d'acariens tisserands. Les résultats des dégâts sur la plante sont reproductibles, ce qui démontre que les acariens collectés sont dans un état physiologique similaire et adaptés aux études sur les interactions plante-acarien tisserand. Ce graphique présente la surface endommagée mesurée sur des plantes AANA âgées de trois semaines, quatre jours après l'application de 20 femelles d'acariens tisserands.À titre d'exemple d'application expérimentale, la variation naturelle et la sensibilité à l'acarien tisserand, ou orry, ont été évaluées chez trois essences de aana en appliquant 20 femelles d'acariens par plante à l'aide d'un pinceau humide et en notant les dégâts quatre jours après l'infestation. La quantification des données de dégâts peut être présentée sous forme de graphique en barres ou de boîte à moustaches, puis analysée à l'aide de la méthode statistique appropriée. Dans cet exemple, la sensibilité à l'acarien tisserand ou bry varie significativement selon les essences.L'isolement et les étapes d'infestation peuvent être réalisés en moins de 30 minutes, selon le nombre d'échantillons et le choix du protocole. Il est important de se rappeler que les acariens ne doivent pas être immergés dans la solution à 20 % plus de 10 minutes. L'isolement à l'aide du système à graines peut être utilisé pour obtenir des fractions d'acariens à différents stades de développement, qui peuvent être utilisées pour diverses expériences, non seulement dans le domaine des interactions ravageurs-plantes, mais aussi en physiologie du développement et en biologie moléculaire.

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Application de deux tétranyque

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