Une méthode d'immunofluorescence pour la caractérisation des cellules oesophage de Barrett

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer les effets d'un traitement médicamenteux sur la structure cellulaire et la localisation des protéines dans les cellules BE. Ceci est réalisé en incubant les cellules BE cultivées sur des lamelles de verre avec un médicament choisi, dans des conditions standard de culture cellulaire. Dans une deuxième étape, incubez les cellules BE traitées avec un fixateur, qui préserve la structure et la localisation des protéines.

Les cellules fixées sont ensuite incubées successivement avec un anticorps primaire et un anticorps secondaire marqué par un fluorochrome afin de visualiser les modifications du protéine cible sélectionnée par microscopie de fluorescence ; les résultats obtenus montrent comment le traitement médicamenteux des cellules influence la localisation protéique et la structure cellulaire, en se basant sur la visualisation de la coloration immunofluorescente. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l’œsophage de Barrett, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, notamment les cellules cancéreuses et normales. Commencez cette procédure en plaçant les lamelles de 18 millimètres dans une boîte de Pétri en verre et en les autoclavant.

Ensuite, transférez les lamelles stérilisées au autoclave dans une boîte de culture tissulaire de 12 puits à l’aide d’une pipette en verre stérile fixée à un tube sous vide. Puis rincez les lamelles avec du PBS stérile et du milieu de culture. Ensuite, la trypsine.

Les cellules immortalisées sont comptées à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre, puis diluées dans le milieu de culture à une concentration de 20 000 à 40 000 cellules par millilitre. Ensuite, déposer un millilitre de cellules dans chaque puits contenant un lamelle. Pour un nombre total de cellules compris entre 20 000 et 40 000 par puits, utiliser une pointe de pipette stérile pour pousser délicatement le lamelle jusqu’au fond du puits afin de s’assurer que les cellules s’attachent au lamelle.

Pour traiter les cellules BE, diluer le médicament sélectionné dans du milieu à 37 degrés Celsius jusqu'à la concentration souhaitée, puis bien mélanger en retournant le tube plusieurs fois ou à l'aide d'un vortex. Commencer le traitement 24 heures après la mise en place initiale des cellules BE afin de permettre l'attachement cellulaire sur le lamelle. Étiqueter désormais au stylo de laboratoire les plaques d'échantillons traités au médicament et au véhicule afin de distinguer les groupes comparatifs et témoins. Traiter un lamelle supplémentaire de cellules BE avec 0,1 % de véhicule dilué dans le milieu de culture.

Ensuite, placer les cellules dans une étuve à culture cellulaire à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 98 % d'humidité. Après le temps d'incubation souhaité de traitement par le médicament, aspirer le milieu et rincer rapidement les lamelles avec un X PBS à température ambiante. Puis aspirer le PBS et ajouter un millilitre de PBS contenant 4 % de PFA dans chaque puits, et incuber à température ambiante pendant 30 minutes.

Ensuite, aspirez la PFA à 4 % dans du PBS. Lavez les lamelles trois fois, cinq minutes à chaque fois, avec du PBS à température ambiante. Conservez les lamelles pendant une semaine dans du PBS contenant 0,1 % de PFA à quatre degrés Celsius si désiré. Pour rendre perméables les cellules fixées à la PFA afin de permettre aux anticorps d'accéder aux cibles intracellulaires, incubez les cellules avec du chlorure d'ammonium à 50 millimolaire dilué dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, lavez-les une fois avec du PBS à température ambiante pendant cinq minutes. Cela réduira le fond non spécifique afin d'empêcher la liaison non spécifique des anticorps aux protéines cellulaires. Incubez les cellules BE pendant 30 minutes dans 100 à 300 microlitres de PBS contenant 0,1 % de troponine et 0,5 % de BSA.

Préparez ensuite un plat carré pour bioessai en recouvrant le fond de la chambre avec des serviettes en papier humides et en plaçant une couche de parfum par-dessus. Marquez le parfum au stylo de laboratoire afin d'identifier les lamelles. Transférez délicatement les lamelles, les cellules orientées vers le haut, sur le parfum à l’aide de pinces et d’une aiguille de seringue.

À présent, diluez l'anticorps primaire dans du PBS contenant à la fois 0,5 % de BSA et 0,1 % de saponine. Épongez délicatement la solution de blocage à l’aide d’un papier absorbant de laboratoire, puis ajoutez 100 microlitres de la solution d’anticorps primaire et incubez les cellules toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain.

Lavez les lames trois fois avec du PBS contenant 0,5 % de BSA et 0,1 % de troponine, cinq minutes à chaque fois, à température ambiante. Ensuite, diluez l'anticorps secondaire conjugué à une étiquette fluorescente dans du PBS contenant 0,5 % de BSA et 0,1 % de ponent. Ajoutez 100 microlitres d'anticorps dilué sur chaque lame et incubez les cellules pendant deux heures à température ambiante après deux heures.

Lavez les lamelles trois fois, cinq minutes à chaque fois, dans du PBS contenant 0,5 % de BSA et 0,1 % de troponine. Éliminez le tampon de lavage et ajoutez 100 à 300 microlitres de PBS sur les lamelles. Soulevez délicatement la lamelle à l’aide de pinces et essuyez le PBS avec un mouchoir en papier ou un papier absorbant de laboratoire.

Ensuite, ajoutez 15 microlitres d'un milieu de montage Antifa approprié contenant du DPI sur la lame couvre-objet. Placez la lame couvre-objet retournée sur une lame de microscope en verre, les cellules orientées vers le bas. Placez ensuite les lames dans un classeur à lames et conservez-les à l'abri de la lumière directe, pendant la nuit et à température ambiante, afin de permettre au milieu Antifa de polymériser.

Une fois que le milieu Antifa est solidifié, les lames peuvent être conservées à quatre degrés Celsius ou à moins vingt degrés Celsius jusqu'à l'observation microscopique. À cette étape, retirez les lames de stockage de moins vingt degrés Celsius ou de quatre degrés Celsius et laissez-les atteindre la température ambiante. Allumez le microscope et la lampe à arc au mercure.

Placez une lame de microscope avec la lamelle orientée vers l'objectif sur la platine du microscope. Ensuite, sélectionnez le filtre DAPI et ouvrez l'obturateur. Régler l'objectif en regardant à travers les oculaires jusqu'à ce que l'image apparaisse.

Étant donné que toutes les cellules ont été colorées au dpi, les noyaux doivent être facilement observables. Acquérir les images à l’aide d’un logiciel de traitement d’image approprié ; dans cette figure, les lamelles contenant CPC et CPD ont été traitées avec un véhicule ou un micromolaire de l’inhibiteur de SRC, SKI 6 0 6, pendant 24 heures, puis les cellules ont été fixées et colorées.

Selon le protocole décrit, la bêta-caténine indiquée en vert a été visualisée à l'aide d'un anticorps spécifique et d'un anticorps secondaire couplé au LOR 4 88, tandis que le noyau a été coloré avec le DPI indiqué en bleu. Remarquez le changement de localisation de la bêta-caténine, passant du noyau à la membrane cellulaire, après traitement avec le SKI 6 0 6.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une coloration immunofluorescente de l'œsophage de Barrett afin d'étudier la localisation des protéines ou la structure cellulaire.