Une méthode d'immunofluorescence pour la caractérisation des cellules oesophage de Barrett

L’objectif général de l’expérience suivante est d’évaluer les effets du traitement médicamenteux sur la structure cellulaire et la localisation des protéines dans les cellules BE. Ceci est réalisé en incubant les cellules BE cultivées sur les lamelles de verre avec un médicament choisi dans des conditions de culture cellulaire standard. Dans un deuxième temps, incubez les cellules traitées avec un fixateur, qui préserve la structure et la localisation des protéines.

Ensuite, les cellules be fixes sont incubées séquentiellement avec des anticorps primaires et secondaires marqués par fluorescence afin de visualiser les changements dans la protéine cible sélectionnée via la microscopie à fluorescence Les résultats obtenus montrent comment le traitement médicamenteux des cellules be modifie la localisation des protéines et la structure cellulaire sur la base de la visualisation de la coloration immunofluorescente. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’œsophage de Barrett, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, y compris le cancer et les cellules normales. Commencez cette procédure en plaçant les lamelles de 18 millimètres dans une boîte de Pétri en verre et autoclavez-les.

Transférez ensuite les lamelles de l’autoclave dans une boîte de culture tissulaire à 12 puits à l’aide d’une pipette en verre stérile fixée à un tube à vide. Après ce lavage, la housse glisse avec du PBS et des milieux stériles. Ensuite, la trypsine.

Les cellules immortalisées comptent les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre, puis diluent les cellules dans des milieux de culture jusqu’à une concentration de 20 000 à 40 000 cellules par millilitre. Placez ensuite un millilitre de cellules dans chaque puits contenant un bordereau de couverture. Pour un nombre total de cellules de 20 000 à 40 000 cellules par puits, utilisez une pointe de pipette stérile pour pousser doucement la lamelle au fond du puits afin de vous assurer que les cellules se fixent à la lamelle.

Pour traiter les cellules EB, diluez le médicament sélectionné dans un milieu à 37 degrés Celsius jusqu’à la concentration souhaitée, mélangez bien en inversant le tube à plusieurs reprises ou à l’aide d’un mélangeur vortex. Commencer le traitement 24 heures après la mise en place initiale des cellules BE pour permettre la fixation des cellules sur le couvercle. Glisser avec un stylo de laboratoire les plaques d’échantillons de médicaments et de véhicules maintenant pré-étiquetées. Traiter une lamelle supplémentaire de cellules avec 0,1 % de véhicule dilué dans le milieu de culture.

Ensuite, placez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 98 % d’humidité. Maintenant, après le temps d’incubation souhaité du traitement médicamenteux, aspirez le milieu et lavez rapidement les lamelles de couverture avec un XPBS à température ambiante. Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez un millilitre de PBS contenant 4 % de PFA dans chaque puits et incubez à température ambiante pendant 30 minutes.

Ensuite, aspirez les 4 % P-F-A-P-B-S Lavez les lamelles de couverture trois fois cinq minutes à chaque fois avec du PBS à température ambiante. Conservez les lamelles pendant une semaine dans du PBS et 0,1 % PFA à quatre degrés Celsius si vous le souhaitez. Pour perméer les yeux les cellules PFA fixées afin de permettre à l’anticorps d’accéder aux cibles intracellulaires, incubez les cellules avec 50 millimolaires de chlorure d’ammonium dilué dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, lavez-les avec du PBS à température ambiante une fois pendant cinq minutes. Cela réduira le bruit de fond pour empêcher la liaison non spécifique des anticorps aux protéines cellulaires. Incuber les cellules BE pendant 30 minutes dans 100 à 300 microlitres de PBS contenant 0,1 % de troponine et 0,5 % de BSA.

Préparez ensuite un plat carré de biodosage en superposant le fond de la chambre avec du papier absorbant humide et en plaçant une couche de parfum sur le dessus. Marquez le parfum avec un stylo de laboratoire pour identifier les lamelles. Transférez doucement les cellules des cales de couverture vers le haut sur le paramètre à l’aide d’une pince et d’une aiguille de seringue.

Maintenant, diluez l’anticorps primaire dans du PBS contenant à la fois 0,5 % de BSA et 0,1 % de saponine, épongez doucement la solution de blocage. À l’aide d’un mouchoir de laboratoire, ajoutez 100 microlitres de la solution d’anticorps primaire et incubez les cellules pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain.

Lavez les lames trois fois avec du PBS contenant 0,5 % de BSA et 0,1 % de troponine pendant cinq minutes, chaque fois à température ambiante. Diluez ensuite l’anticorps secondaire conjugué à un marqueur fluorescent dans du PBS contenant 0,5 % de BSA et 0,1 % de ponent. Ajoutez 100 microlitres d’anticorps dilués dans chaque lamelle et incubez les cellules pendant deux heures à température ambiante après deux heures.

Lavez les lamelles trois fois cinq minutes à chaque fois dans du PBS contenant 0,5 % de BSA et 0,1 % de troponine. Retirez le tampon de lavage et ajoutez 100 à 300 microlitres de PBS dans les lamelles. Soulevez doucement la lamelle à l’aide d’une pince et épongez le PBS à l’aide d’un mouchoir de laboratoire ou d’une serviette en papier.

Ajoutez ensuite 15 microlitres d’un support de montage Antifa approprié contenant des DPI sur la lamelle. Placez la lamelle inversée sur une lame de microscope en verre, les cellules vers le bas. Ensuite, placez les lames dans un dossier de diapositives et conservez-les à l’abri de la lumière directe pendant la nuit à température ambiante pour permettre au milieu Antifa de durcir.

Une fois que le support Antifa a pris, les lames peuvent être stockées à quatre degrés Celsius ou à moins 20 degrés Celsius jusqu’à une visualisation microscopique. Au cours de cette étape, retirez les lames de stockage à moins 20 degrés Celsius ou quatre degrés Celsius et laissez-les se réchauffer à température ambiante. Allumez le microscope et la lampe à arc au mercure.

Placez une lame de microscope avec la lamelle vers l’objectif sur la platine du microscope. Ensuite, sélectionnez le filtre DAPI et ouvrez l’obturateur. Faites la mise au point de l’objectif tout en regardant à travers les oculaires jusqu’à ce que l’image apparaisse.

Comme toutes les cellules ont été colorées avec du dpi, les noyaux devraient être facilement observés. Recueillir des images à l’aide d’un logiciel de traitement d’image approprié dans cette figure Les lamelles avec CPC et CPD ont été traitées avec un véhicule ou une micromolaire de l’inhibiteur de la SRC. Pendant 24 heures, les cellules ont ensuite été fixées et colorées.

Selon le protocole décrit, la bêta-caténine indiquée en vert a été visualisée à l’aide d’un anticorps spécifique et d’un anticorps secondaire couplé à LOR 4 88 tandis que le noyau a été coloré avec DPI indiqué en bleu. Notez le changement d’emplacement de la bêta-caténine du noyau à la membrane cellulaire. Après le traitement par SKI 6 0 6.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de colorer immunofluorescent l’œsophage de Barrett pour étudier la localisation des protéines ou la structure cellulaire.