Name: Une méthode dimmunofluorescence pour la caractérisation des cellules oesophage de Barrett (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Apprenez une méthode d'immunofluorescence pour caractériser les cellules de l'œsophage de Barrett et évaluer les effets des traitements médicamenteux sur la localisation des protéines et la morphologie cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du St, la Fondation Joseph (AJF, LJI) et l&#39;American Lung Association, RG-224607-N (LJI).

1. Entretien Cell ligne <ol><li> Humaine immortalisée BE dysplasiques de haut grade (CP-B, CP-C, CP-D) et métaplasique (CP-A) des lignées de cellules par transfection stable de la télomérase humaine transcriptase inverse (TERT) protéine 11. </li><li> Maintenir BE lignées cellulaires dans un milieu de kératinocytes supplémenté avec de l&#39;extrait de bovin pituitaire (BPE), le facteur de croissance épidermique (EGF), 5% de sérum bovin fœtal (FBS), acides aminés non essentiels (NEAA), de la pénicilline-streptomycine-néomycine (PSN), et la norme conditions de culture de tissus (37 ° C, 5% CO 2, 98% d&#39;humidité). </li></ol> 2. ÊTRE cellulaire Plaquage <ol><li> Préparation de 12 puits plaque / lamelles. Placez les lamelles 18 mm dans un plat et autoclave Petri verre. Transfert autoclavé 18 lamelles de verre mm dans une boîte de culture tissulaire à 12 puits en utilisant une pipette en verre stérile fixée à un tube à vide. Laver la lamelle avec du PBS stérile et médias. </li><li> Trypsiniser et compter les cellules d&#39;être immortalisé. Compter les cellules using un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre. Diluer les cellules dans un milieu de culture à une concentration de 20.000-40.000 cellules / ml. </li><li> Placer 1 ml de cellules dans chaque puits contenant une lamelle couvre-objet pour un nombre total de cellules de 20.000-40.000 cellules / puits. </li><li> Utilisation d&#39;une pointe de pipette stérile pour pousser doucement la lamelle au fond du puits afin d&#39;assurer que les cellules se fixent à la lamelle couvre-objet. </li></ol> 3. Traitement de la toxicomanie de cellules soient <ol><li> Diluer médicament sélectionné dans (37 ° C) médias chauds à la concentration souhaitée et bien mélanger en inversant le tube à plusieurs reprises ou en utilisant un mélangeur vortex. Concentrations de médicament déterminée empiriquement. Commencer le traitement 24 heures après l&#39;ensemencement initial des cellules BE pour permettre aux cellules de fixation sur la lamelle </li><li> A titre de comparaison et de contrôle, traiter une lamelle supplémentaire de cellules de BE avec 0,1% de véhicule (diméthylsulfoxyde [DMSO] ou agent utilisé pour solubiliser composé) dilué dans un milieu de culture. plaque d&#39;étiquettes avec un stylo de laboratoire pour identifier le médicament et vecule échantillons traités. Placez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire mis à 37 ° C, 5% de CO 2, 98% d&#39;humidité et incuber pendant des moments souhaités. </li></ol> 4. Immunofluorescence <ol><li> Fixation <ol><li> A la suite du temps d&#39;incubation désirée du traitement médicamenteux, aspirer le support et laver les lamelles rapidement avec 1x solution saline tamponnée phosphate (PBS) à température ambiante (TA, 25 ° C). </li><li> Aspirer le PBS et ajouter 1 ml de PBS contenant 4% de PFA [PFA à 4% / PBS] à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Aspirer le PFA 4% / PBS et laver le couvre-3x, 5 min chacun avec PBS à température ambiante. lamelles de magasins pour une semaine en PBS contenant 0,1% de PFA à 4 ° C si vous le souhaitez. </li></ol></li><li> Perméabilisation / blocage Perméabiliser les cellules PFA fixes pour permettre à l&#39;anticorps pour accéder aux cibles intracellulaires. Pour extracellulaire surface des protéines, effectuer toutes les étapes ultérieures sans saponine ajouté à la solution de BSA 1x PBS/0.5 de%. <ol><li> Réduire le fond par incubation avec 50 mM de NH 4 Cl dilué dans du PBS pendant 10 min à température ambiante et laver avec du PBS une fois que la température ambiante pendant 5 min. </li><li> Incuber être des cellules pendant 30 min à 100 à 300 pi de PBS contenant 0,1% de saponine et 0,5% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA). Diluer la saponine de filtre stérilisé 10% stock, préparé dans l&#39;eau et conservé à 4 ° C. </li></ol> NOTE: Ceci empêche la liaison non spécifique des anticorps dirigés contre des protéines cellulaires par des lamelles de blocage dus à l&#39;addition de 0,5% de BSA. En variante, substituer BSA avec du sérum de chèvre dilué à 5% pour réduire la liaison non spécifique d&#39;anticorps. </li><li> Préparation de la Chambre humain <ol><li> Préparer un plat carré d&#39;essai biologique en superposant le fond de la chambre avec des serviettes en papier humide et placez une couche de Parafilm sur le dessus. </li><li> Transférer délicatement les lamelles, les cellules orientées vers le haut, sur le Parafilm aide d&#39;une pince et une aiguille de seringue. </li><li> Marquer le Parafilm avec un stylo de laboratoire pour identifier les lamelles. </li></ol></li><li>Anticorps primaire incubation <ol><li> Diluer l&#39;anticorps primaire dans du PBS contenant à la fois 0,5% de BSA et 0,1% de saponine. </li><li> Épongez délicatement la solution de blocage à l&#39;aide d&#39;un tissu de laboratoire et ajouter 100 ul de la solution d&#39;anticorps primaire. Incuber l&#39;anticorps primaire sur les cellules de BE pendant une nuit à 4 ° C. </li></ol></li><li> Incubation de l&#39;anticorps secondaire <ol><li> Laver les lames 3x avec PBS/0.5% BSA/0.1% de saponine pour 5 min chacune à la température ambiante. </li><li> Diluer l&#39;anticorps secondaire conjugué à un marqueur fluorescent dans PBS/0.5% BSA/0.1% de saponine que l&#39;anticorps secondaire reconnaît l&#39;espèce dans laquelle l&#39;anticorps primaire a été soulevée. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;anticorps dilué à chaque lamelle. Incuber l&#39;anticorps secondaire pendant 2 h à température ambiante. </li></ol></li><li> Laver et montage de lamelles couvre- <ol><li> Laver le couvre-3x, 5 min chacun dans PBS/0.5% BSA/0.1% de saponine. Éliminer le tampon de lavage et ajouter 100 à 300 pi de PBS aux lamelles couvre-objet. REMARQUE: Pour une double lutte contrecoloration du corps, répétez les étapes 4.4 à 4.5 avec l&#39;anticorps primaire et secondaire supplémentaire souhaitée selon les modalités détaillées dans la discussion. </li><li> En utilisant des pinces, soulever délicatement la lamelle et éponger la PBS en utilisant un tissu de laboratoire ou une serviette en papier. </li><li> Ajouter 15 ul d&#39;un milieu de montage anti-décoloration approprié contenant 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour inverser la lamelle couvre-objet et la lamelle couvre-objet, des cellules vers le bas, sur une lame de microscope en verre. </li><li> Placer les lames dans un dossier de la lame et incuber abri de la lumière directe du jour au lendemain à la température ambiante pour permettre le support anti-décoloration dur mis à guérir, selon les instructions du fabricant. Une fois le support anti-décoloration a mis, diapositives peuvent être conservées à 4 ° C ou -20 ° C jusqu&#39;à ce que la visualisation microscopique. </li></ol></li></ol> 5. Visualisation microscopique des lamelles couvre- Les cellules colorées peuvent être visualisés par l&#39;intermédiaire soit microscopie confocale ou un SI microscop verticale capablee. Bien que la microscopie confocale fournit des images haute résolution à des profondeurs discrètes, un microscopique verticale est capable de produire des images utiles plus rapidement. Par souci de concision, un procédé d&#39;imagerie souillé BE cellules par microscopie norme est présentée. En général, à l&#39;image de l&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou similaires fluorophores (par exemple la protéine verte fluorescente), le rouge Texas et DAPI, nécessite un microscope avec des filtres capables de discriminer ces fluorophores. Vérifiez le microscope avant de commencer le protocole pour déterminer fluorophores compatibles. <ol><li> Imagerie sur un microscope standard IF <ol><li> Retirer stockées diapositives / lamelles couvre-objet à partir de -20 ° C ou à 4 ° C et leur permettre de se réchauffer jusqu&#39;à la température ambiante. Mise sous tension et microscope lampe à arc au mercure. </li><li> Placez lame de microscope avec lamelle orientée vers l&#39;objectif sur la platine du microscope. Pour l&#39;utilisation d&#39;un objectif à immersion d&#39;huile, ajouter une goutte d&#39;huile d&#39;immersion sur la lamelle. </li><li> Sélectionnez le filtre DAPI et ouvrir l&#39;obturateur. </li&gt; <li> Concentrer l&#39;objectif tout en regardant à travers les oculaires jusqu&#39;à ce que l&#39;image apparaît. Comme toutes les cellules se colorent au DAPI, les noyaux doivent être facilement observable. </li><li> Recueillir des images en utilisant un logiciel de traitement d&#39;image respective. </li></ol></li></ol>

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<li>Nam, J. -S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+Family+Kinase+Inhibitor+PP2+Restores+the+E-Cadherin%2FCatenin+Cell+Adhesion+System+in+Human+Cancer+Cells+and+Reduces+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).</li>
<li>Chu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p27+phosphorylation+by+Src+regulates+inhibition+of+cyclin+E-Cdk2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2.</a> Cell. 128, 281-294 (2007).</li>
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<li>Gan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+ERK+and+Akt+pathways+in+regulation+of+EGFR-mediated+signaling+and+motility+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells.</a> Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous avons décrit une méthode pour l&#39;application de l&#39;IF de cellules de BE à élucider les effets physiologiques des thérapies ciblées sur ces cellules. Alors que nous avons décrit l&#39;utilisation de ces procédures à l&#39;égard des cellules de BE, nous avons constaté que ces procédés sont également applicables à une variété de types cellulaires différents 13,17,18. En outre, ces procédures peuvent être modifiées de plusieurs façons d&#39;optimiser coloration pour des objectifs spécifiques. <p cl...

L&#39;oesophage de Barrett (BE) est un changement de métaplasie de l&#39;épithélium malpighien normal de l&#39;œsophage et une conséquence de l&#39;exposition chronique à du contenu gastrique résultant de la maladie de reflux gastro-œsophagien (RGO) 1. BE est pensé pour être un mécanisme de protection en réponse à la DIRD, mais la présence de BE confère un risque accru d&#39;adénocarcinome de l&#39;œsophage (EAC), une maladie qui porte un faible taux de survie significativement 1. Les estimations actuelles indiquent que jusqu&#39;à 5,6% de la population américaine ont BE, mais comme BE est souvent asymptomatique, on pense que la majorité des BE reste non diagnostiquée 2. Comme les taux des deux RGO et EAC incidence ont connu une croissance continue 3, il est devenu important de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression de BE à EAC, surtout en ce qui pourrait fournir des approches thérapeutiques vers la prévention de la progression de la BE à l&#39;EAC. 1. L&#39;inflammation chronique, des blessures et des dommages génotoxiques résultant d&#39;une exposition prolongée à contenu gastrique exercent une pression sélective sur la lésion BE promouvoir la progression néoplasique à CAE. Un certain nombre de modifications génétiques ont été identifiées pendant BE à la progression de la CAE. Cependant, malgré cela, il ya un manque de compréhension des changements exacts dans la signalisation cellulaire et les effets subséquents sur la structure et la fonction des cellules. Immortalisées dans des lignées cellulaires in vitro sont des outils utiles pour étudier les effets de la signalisation cellulaire, en particulier dans l&#39;étude des effets des composés thérapeutiques ciblés. La récente disponibilité commerciale de BE lignées cellulaires immortalisées permet à de telles études. Bien tests à haut débit, tels que les tests de viabilité largement utilisés, peuvent être utiles pour évaluer les effets des thérapies ciblées sur la prolifération cellulaire et survival 4-6, ces dosages ne sont pas utiles pour interroger les effets de la signalisation cellulaire sur la morphologie des cellules. Immunofluorescence (IF) est une technique utile pour étudier les effets des thérapies ciblées sur les caractéristiques morphologiques, la croissance et la survie des cellules et des protéines qui sont impliquées. Notre laboratoire a adapté ces méthodes vers des lignes BE cellulaires immortalisées, en utilisant SI pour évaluer les effets d&#39;un médicament cliniquement disponibles sur des lignées cellulaires de BE dans l&#39;espoir de délimiter un éventuel traitement chimiopréventifs et biomarqueur pour le traitement de la drogue 7. De même, l&#39;application de ces techniques dans la CAE, BE et les lignées cellulaires immortalisées de l&#39;œsophage a délimité conclusions critiques concernant BE à la progression de la CAE 8-10. Nous trouver si l&#39;analyse de cellules être traités avec des thérapies ciblées a de la valeur, ce qui permet pour la caractérisation des changements dans la structure de la cellule et la localisation des protéines. Ici, nous présentons nos méthodes de SI de immortalisées être des cellules à characterize traitement de la toxicomanie.

<table><tbody><tr><td>CP-A (lignée cellulaire métaplasique)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4027</td><td></td></tr><tr><td>CP-B (lignée cellulaire dysplasique de haut grade)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4028</td><td></td></tr><tr><td>CP-C (lignée cellulaire dysplasique de haut grade)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4029</td><td></td></tr><tr><td>CP-D (lignée cellulaire dysplasique de haut grade)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4030</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte-SFM (1x), Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % trypsine-EDTA (1x), rouge de phénol</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal, qualifié, HI</td><td>Life Technologies</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>mélange d’antibiotiques PSN</td><td>Life Technologies</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-Buffered</td><td>Saline Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Pro-long Gold Antifade Reagent avec DAPI&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle circulaire en verre 18 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-183-86</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-caténine Anticorps primaire (lapin)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9562S</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (anti-lapin de chèvre)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Boîte PS traitée TC 10 cm, stérile</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>Plaque PS traitée TC 12 puits, stérile</td><td>USA Scientific</td><td>5666-5180</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine - Fraction V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>SKI-606 (Bosutinib)</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1014</td><td></td></tr><tr><td>Plat carré de bioessai&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>240835</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>82024-546</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur jetables, verre blanc</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Nexcelom Mini compteur de cellules</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambres de comptage de cellomètre</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-014</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Zeiss Apotome&nbsp ;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode d&#39;immunofluorescence pour la caractérisation des cellules oesophage de barrett

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Adénocarcinome oesophagien (EAC) a un taux de survie global de moins de 17% et l&#39;incidence de la CAE a augmenté de façon spectaculaire au cours des deux dernières décennies. L&#39;un des principaux facteurs de risque de la CAE est l&#39;oesophage de Barrett (BE), un changement de métaplasie épidermoïde de l&#39;œsophage normale en réponse à des brûlures d&#39;estomac chroniques. Malgré la connexion bien établie entre CAE et BE, interrogation des événements moléculaires, en particulier les voies de signalisation altérées impliquant progression de BE à EAC, sont mal compris. Beaucoup de ceci est dû à l&#39;absence d&#39;convenable dans des modèles in vitro disponibles pour étudier ces maladies. Récemment, les lignes BE cellulaires immortalisées sont devenus disponibles dans le commerce permettant des études in vitro de BE. Ici, nous présentons une méthode de coloration par immunofluorescence de lignes BE cellulaires immortalisées, permettant la caractérisation in vitro de la signalisation cellulaire et de la structure après exposition à des composés thérapeutiques. L&#39;application de ces techniques se help développer comprendre les mécanismes impliqués dans la progression BE EAC et de fournir des pistes potentielles pour le traitement et la prévention de l&#39;EAC.

Un exemple des résultats obtenus à partir de l&#39;application des procédures décrites, est illustrée sur les figures 1A-D. Lamelles couvre avec CP-D et cellules BE CP-C ont été traités pendant 24 heures avec 1 uM de l&#39;inhibiteur de Src de la famille, SKI-606, ou d&#39;un véhicule (DMSO) et colorées en utilisant les procédures ci-dessus pour la jonctions adhérentes et signalisation Wnt protéine, β -caténine. Visualisation de β-caténine a été obtenue par marquage avec un anticorps anti-IgG de lapin c...

Il est nécessaire d&#39;améliorer l&#39;information visible sur les moteurs moléculaires de l&#39;oesophage de Barrett. Immunofluorescence est une technique utile pour comprendre les effets de la signalisation cellulaire sur la morphologie cellulaire. Nous présentons un protocole simple et efficace pour l&#39;utilisation de la coloration par immunofluorescence pour évaluer le traitement thérapeutique dans les cellules oesophage de Barrett.

Une méthode d&#39;immunofluorescence pour la caractérisation des cellules oesophage de Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer les effets d'un traitement médicamenteux sur la structure cellulaire et la localisation des protéines dans les cellules BE. Ceci est réalisé en incubant les cellules BE cultivées sur des lamelles de verre avec un médicament choisi, dans des conditions standard de culture cellulaire. Dans une deuxième étape, incubez les cellules BE traitées avec un fixateur, qui préserve la structure et la localisation des protéines.Les cellules fixées sont ensuite incubées successivement avec un anticorps primaire et un anticorps secondaire marqué par un fluorochrome afin de visualiser les modifications du protéine cible sélectionnée par microscopie de fluorescence ; les résultats obtenus montrent comment le traitement médicamenteux des cellules influence la localisation protéique et la structure cellulaire, en se basant sur la visualisation de la coloration immunofluorescente. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l’œsophage de Barrett, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, notamment les cellules cancéreuses et normales. Commencez cette procédure en plaçant les lamelles de 18 millimètres dans une boîte

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Nous avons décrit une procédure pour la désagrégation du cancer colorectal (CCR) pour produire des cellules viables unique, qui sont ensuite saisies sur biopuces d'anticorps reconnaissant les antigènes de surface sur mesure (CRC DotScan micropuce). Les sous-populations de cellules lié à la puce peut être profilée par multiplexage de fluorescence à l'aide d'anticorps monoclonaux marqués avec des colorants fluorescents.

Colorectal Cancer Cell Surface Protein profilage utilisant une biopuces d&#39;anticorps et de multiplexage par fluorescence

Cette vidéo illustre une méthode basée sur l’immunofluorescence pour visualiser les cellules de touffes intestinales dans des cryosections de jéjunum de souris flottantes. Dans les villosités intestinales, la co-localisation de la fluorescence verte à l’extrémité luminale avec une masse radiculaire rouge étendue indique la présence de cellules touffues.

Procédé basé sur l’immunofluorescence pour visualiser des cellules de touffe dans des cryosections de jéjunum

Source : Ear, P. H., et. al. Etablissement et caractérisation des sphéroïdes tumoraux neuroendocriniens de l’intestin grêle. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre la coloration par immunofluorescence des sphéroïdes tumoraux neuroendocriniens de l’intestin grêle. Les sphéroïdes sont fixés, perméabilisés et bloqués, puis sont incubés avec des anticorps primaires et secondaires. Un colorant est ajouté pour colorer les noyaux avant de les monter et de les visualiser au microscope fluorescent.

Caractérisation des sphéroïdes tumoraux neuroendocriniens de l’intestin grêle à l’aide de l’immunofluorescence

Vital-colorant amélioré l'imagerie de fluorescence (VFI) est un roman de la technique in vivo qui combine épithéliale imagerie à haute résolution avec exogène contraste fluorescent actualité pour mettre en évidence la morphologie glandulaire et de délimiter la néoplasie (dysplasie de haut grade et le cancer) dans l'oesophage distal.

Le diagnostic de néoplasie dans l&#39;oesophage de Barrett en utilisant Vital-colorant amélioré imagerie de fluorescence

Nous présentons un protocole pour générer des cultures primaires de cellules stromales œsophagiennes murines et humaines avec un phénotype de myofibroblastes. Les cellules cultivées ont une morphologie en forme de fuseau, expriment l’α-SMA et la vimentine, et manquent de marqueurs de surface épithéliaux, hématopoïétiques et endothéliaux. Les cellules stromales caractérisées peuvent être utilisées dans des études fonctionnelles des interactions épithéliales-stromales.

Isolement de myofibroblastes de Mouse et œsophage humain

Ce manuscrit décrit la production, la caractérisation et les utilisations potentielles d'une ingénierie tissulaire de construction de l'œsophage 3D préparé à partir de fibroblastes humains primaires normale de l'œsophage et les cellules épithéliales squameuses ensemencées dans un échafaudage porcine de-cellularisée. Les résultats mettent en évidence la formation d'un épithélium stratifié mûr similaire à l'oesophage humain normal.

Production, la caractérisation et utilisations potentielles d&#39;un humain de l&#39;oesophage muqueux modèle 3D de l&#39;ingénierie tissulaire

L'immunohistochimie à fluorescence multiparamètre peut être utilisée pour évaluer le nombre, la répartition relative et la localisation des populations de cellules immunitaires dans le micro-environnement de la tumeur. Ce manuscrit décrit l'utilisation de cette technique pour analyser les sous-populations de cellules T dans le cancer de l'oropharynx.

Immunohistochimie à fluorescence à quatre couleurs des sous-populations de lymphocytes T dans des échantillons de carcinome épidermique humain ou opharyngé humain fixé à la formaline, à base de formaline

L’analyse d’images de codes à barres multiplexés a récemment amélioré la caractérisation du microenvironnement tumoral, permettant des études approfondies de la composition cellulaire, de l’état fonctionnel et des interactions cellule-cellule. Nous décrivons ici un protocole de coloration et d’imagerie utilisant le codage à barres d’anticorps conjugués oligonucléotidiques et l’imagerie cyclique, qui permet l’utilisation d’une technique d’analyse d’images de haute dimension.

Analyse d’images de codes à barres multiplexés pour l’immunoprofilage et la caractérisation de la cartographie spatiale dans l’analyse unicellulaire d’échantillons de tissus de paraffine

Les co-cultures organoïdes-fibroblastes fournissent un modèle pour étudier la niche des cellules souches in vivo . Ici, un protocole pour les co-cultures organoïdes-fibroblastes œsophagiennes est décrit. De plus, l’imagerie de monture entière est utilisée pour visualiser l’interaction fibroblaste-organoïde.

Caractérisation fonctionnelle et visualisation de fibroblastes œsophagiens à l’aide de co-cultures organoïdes

Le présent protocole décrit l’établissement et l’analyse histologique de modèles d’organoïdes œsophagiens qui représentent différents stades de la progression tumorale. Cette méthode permet aux chercheurs d’étudier les changements dans la morphologie cellulaire, l’organisation spatiale et les modèles d’expression des marqueurs moléculaires pendant la transition des tissus normaux aux tissus cancéreux.

Etablissement et analyse histologique d’organoïdes œsophagiens modélisant la progression des tissus normaux aux tissus cancéreux

Ce protocole décrit une méthode permettant d’isoler simultanément les organoïdes cancéreux, les fibroblastes associés au carcinome (CAF) et les fibroblastes (CF) non associés à la tumeur chez le même patient atteint d’un carcinome épidermoïde œsophagien (ESCC). L’utilisation de ces documents correspondant aux patients pourrait éviter les problèmes liés à la variabilité entre patients et offrir une plateforme expérimentale appropriée pour la recherche sur les CCES.

Établissement d’organoïdes tumoraux, de fibroblastes associés au carcinome et de fibroblastes équivalents provenant du même patient atteint de cancer de l’œsophage

Apprenez une méthode d'immunofluorescence pour caractériser les cellules de l'œsophage de Barrett et évaluer les effets des traitements médicamenteux sur la localisation des protéines et la morphologie cellulaire.

Une méthode d'immunofluorescence pour la caractérisation des cellules oesophage de Barrett

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