Une procédure de petit volume pour la concentration virale de l'eau
3 février 2015
Une approche a été développée pour identifier les conditions optimales de concentration virale pour des échantillons d’eau de petit volume à l’aide de pointes d’adénovirus humains. Les techniques décrites ici sont utilisées pour identifier les paramètres de concentration d’autres cibles virales et appliquées à l’expérimentation de concentration virale à grande échelle.
L'objectif général de l'expérience suivante est d'optimiser la récupération de virus à partir de l'eau en utilisant une technique à petite échelle initialement conçue pour optimiser la concentration des virus. Un filtre en cellulose de verre s'est révélé être le meilleur filtre électropositif pour concentrer l'adénovirus à partir de l'eau. Pour l'élution secondaire, une technique de concentration secondaire utilisant de la célite s'est avérée la plus efficace pour éliminer l'adénovirus des surfaces du filtre. La technique résultante permet de récupérer le plus grand nombre d'adénovirus à partir d'eau du robinet, en se basant sur les pourcentages de récupération les plus élevés observés parmi toutes les combinaisons de filtres et d'élutions testées.
Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la concentration volumétrique à grande échelle, est qu'elle utilise des volumes d'échantillon plus faibles, permettant ainsi d'évaluer rapidement et facilement une multitude de variables de concentration.
Lors de la préparation de ce protocole, tenez prêts tous les solutions nécessaires, y compris la solution virale filtrée à 0,22 micron à une concentration de 10 à 100 000 MPN par millilitre.
Commencez par mesurer un litre d'eau du robinet stérile. Transférez-le dans un bécher de deux litres contenant une barre aimantée. Sous agitation, ajoutez 0,7 gramme de thiosulfate de sodium et laissez-le se dissoudre complètement. Ensuite, ajustez le pH entre 7 et 7,5 en ajoutant goutte à goutte des solutions mères d'acide ou de base à une molaire. Puis, ajoutez le virus à l'eau. Incorporez un millilitre complet de la solution virale préparée. Recouvrez le flacon d'un film stérile et laissez le virus se mélanger à l'eau pendant 10 minutes.
Pendant ce temps, préparez le filtre Millipore. Commencez par l'extraire de son emballage et assurez-vous qu'il s'ajuste bien entre le bol supérieur et le tamis inférieur. Vérifiez ensuite que le matériau en liège du filtre s'adapte étroitement au bord d'un flacon à col latéral d'un litre. Retirez maintenant le bol supérieur du filtre et, à l'aide de pinces, placez un disque de filtration électropositif de 47 millimètres bien au centre du tamis filtrant. Replacez ensuite le bol et fixez-le en tournant dans le sens inverse des aiguilles d'une montre.
Prélvez 100 millilitres d'eau du robinet contaminée à l'aide d'un cylindre stérile. Ensuite, transférez l'eau dans le logement de filtre préparé sur le flacon de deux litres. Le disque électropositif du filtre peut être en verre-cellulose plissé ou en fibre de verre nano-alumineuse. Un vide doux peut être utilisé pour faire passer l'eau résiduelle à travers le filtre.
Maintenant, déplacez le logement du filtre vers un ballon à col latéral de 250 millilitres. Prélèvez 100 millilitres d'extrait de viande et versez-les lentement sur le filtre. Laissez l'extrait passer lentement et utilisez un vide doux pour faire passer le résidu.
Procédez ensuite avec l'une des deux options de concentration secondaire.
Pour concentrer le virus à l'aide de célite, transférez le contenu du flacon de 250 millilitres, qui contient le virus, sur un agitateur magnétique. À l’aide d’un barreau aimanté, créez un petit vortex. Ensuite, ajoutez 0,1 gramme de poudre de célite à 100 millilitres d’extrait de viande. Laissez la célite se disperser et préparez-vous à ajuster le pH de la solution. En ajoutant goutte à goutte de l’acide chlorhydrique 0,1 molaire, abaissez le pH à 4,0.
Ensuite, laissez le mélange réagir pendant 10 minutes. Pendant le mélange, fixez votre filtre préalable de 47 millilitres sur un flacon de deux litres. Versez maintenant 100 millilitres du mélange extrait de viande-célite à travers le préfiltre. Un léger vide peut être utilisé pour terminer.
Ensuite, placer une pince en métal sur l'extrémité du bec d'un logement de filtre. Fixer à la pince un tube de collecte stérile en polypropylène de 15 millilitres, puis réassembler le filtre sur le flacon.
Éluerez maintenant le virus des particules de Celite dans cinq millilitres de PBS 1X à un pH de neuf. Laissez la majeure partie du PBS s'écouler par gravité dans le tube de 15 millilitres et aspirez le résidu à l’aide d’un léger vide. Pour concentrer le virus par floculation organique, transférez le contenu du flacon de 250 millilitres contenant le virus sur une plaque agitatrice. À l’aide d’un barreau aimanté, créez un petit vortex. Ajustez le pH de la solution à 3,5 en ajoutant goutte à goutte de l’acide chlorhydrique un molaire. Laissez ensuite le mélange agiter pendant une demi-heure. Transférez ensuite la solution dans un tube conique stérile de 250 millilitres pour centrifugeuse. Faites centrifuger la solution à 2 500 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, manipulez les tubes avec précaution afin de ne pas perturber le culot. Décantez soigneusement le surnageant et resuspendez le culot dans cinq millilitres de PBS à pH neuf. Assurez-vous que le culot est complètement dissous. Centrifugez ensuite la suspension à 4 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Récupérez maintenant le surnageant, qui contient le virus concentré. Le culot peut être mis au rebut.
Lors de l'optimisation de ce protocole, trois types de célite ont été comparés. Une célite de granulométrie plus grande a entraîné des rendements plus faibles pour les deux ADV 40 et ADV 41.
L'élution du filtre a été testée à un pH compris entre 7,5 et 12 afin de déterminer la valeur la plus efficace pour la récupération des particules de ADV à partir des filtres. Le rendement le plus élevé a été obtenu avec un filtre en verre-cellulose combiné à un extrait de viande de bœuf à pH 10 et à la kieselguhr. Le résultat était identique avec ADV 40 et ADV 41.
L'extrait de viande à pH 10 s'est révélé supérieur à la floculation organique.
La méthode optimisée a été comparée à l'ajout de 25 % de trypsine et à la supplémentation de l'extrait de bœuf avec 0,1 % de polyphosphate de sodium. Aucun des deux traitements n'a amélioré de manière significative la récupération du ADV.
Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 45 minutes si elle est effectuée correctement.
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Aperçu
Cette étude présente une méthode d'optimisation de la récupération de virus à partir d'échantillons d'eau de petit volume, en se concentrant spécifiquement sur l'adénovirus humain. L'approche utilise un filtre en cellulose de verre et une technique de concentration secondaire afin d'améliorer les taux de récupération.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Virologie
- Sciences de l'environnement
- Qualité de l'eau
Contexte
- La concentration de virus à partir d'échantillons d'eau est essentielle pour la surveillance environnementale.
- Les méthodes existantes nécessitent souvent de grands volumes d'échantillons, ce qui limite leur efficacité.
- L'optimisation des techniques de récupération peut améliorer la détection et l'analyse des agents pathogènes viraux.
- L'adénovirus humain sert de modèle pour tester les méthodes de concentration.
Objectif de l'étude
- Développer une technique permettant d'identifier les conditions optimales de concentration virale.
- Évaluer diverses combinaisons de filtration et d'élution pour la récupération d'adénovirus.
- Permettre une évaluation rapide des variables de concentration en utilisant de petits volumes d'échantillon.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'un filtre en cellulose de verre pour la concentration d'adénovirus.
- Application d'une technique de concentration secondaire à l'aide d'une lumière marine pour l'élution.
- Comparaison de différentes combinaisons de filtration et d'élution.
- Évaluation des taux de récupération à partir d'échantillons d'eau du robinet.
Résultats principaux
- Le filtre en verre de cellulose a démontré les taux de récupération les plus élevés pour l'adénovirus.
- La technique de concentration secondaire Sea Light a efficacement éluté le virus.
- De petits volumes d'échantillon ont permis une évaluation rapide de plusieurs paramètres de concentration.
- La méthode s'est révélée supérieure aux techniques traditionnelles de concentration à grand volume.
Conclusions
- Cette technique offre un moyen plus efficace de récupérer des virus à partir d'échantillons d'eau.
- Elle permet un test rapide de diverses conditions de concentration.
- L'approche peut être adaptée à d'autres cibles virales en dehors de l'adénovirus.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les professionnels
L'optimisation de la récupération de virus à partir d'échantillons d'eau de petit volume permet un criblage rapide des paramètres de concentration, soutenant le développement précoce des dosages en virologie environnementale. La méthode offre une approche évolutible et rentable pour évaluer les combinaisons de filtration et d'élution, réduisant la consommation de ressources dans les flux de travail de détection préclinique des agents pathogènes. En identifiant les conditions optimales de concentration des adénovirus, la technique améliore la fiabilité prédictive des applications de détection en aval.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'évaluer l'efficacité de récupération virale selon les types de filtres et les conditions d'élution, afin d'appuyer la validation ciblée dans la détection de pathogènes environnementaux.
- Valeur opérationnelle : Utilise de petits volumes d'échantillon (1 à 10 L simulés avec 100 mL) pour tester rapidement plusieurs variables, accélérant ainsi la formulation d'hypothèses en vue de l'optimisation de la concentration virale.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives de récupération (pourcentage de récupération d'AdV40 et d'AdV41) afin d'informer la standardisation des tests et la reproductibilité des plateformes de détection virale.
- Valeur opérationnelle : Prépare des systèmes biologiques validés (virus concentré dans un volume de 5 à 30 mL) pour des applications en aval telles que les tests d'infectiosité ou l'analyse génomique.
- Valeur stratégique : Facilite la préparation au dépistage en permettant la comparaison rapide de filtres électropositifs (verre/cellulose contre nano-alumine/verre) et de techniques secondaires de concentration (célite contre floculation organique).
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Utilise l'adénovirus humain comme modèle pertinent pour évaluer la performance des méthodes de concentration, soutenant ainsi le développement translationnel de biomarqueurs pour les agents pathogènes hydriques.
- Valeur opérationnelle : Assure la continuité entre la phase de découverte et la validation préclinique en fournissant un virus concentré adapté à une caractérisation ultérieure.
- Valeur stratégique : Facilite les décisions d'avancement ajustées au risque en identifiant des combinaisons filtre-élution à forte récupération (filtre en cellulose de verre avec extrait de viande à pH 10 et lumière de mer).
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test initial d'hypothèses à l'identification de candidats prometteurs dans la détection des agents pathogènes environnementaux, permettant une itération rapide sur les variables de concentration avant un passage à des volumes plus importants.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur les variables de filtration et d'élution afin de clarifier les mécanismes de libération des virus à partir de surfaces et d'optimiser l'efficacité de récupération.
- Dépistage : Fournit des concentrés de virus prêts à être analysés (5-30 mL) avec des résultats quantitatifs (pourcentage de récupération) pour comparer les conditions entre différents types de filtres et additifs d'élution.
- Analytique : Permet de mesurer des variables dépendantes (récupération virale par qPCR ou infectiosité) afin d'évaluer statistiquement l'impact de variables indépendantes (type de filtre, pH d'élution, taille des particules de kieselguhr).
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en fournissant un adénovirus concentré adapté à une validation ultérieure dans des cultures cellulaires ou des modèles animaux.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité réutilisable pour optimiser la concentration de virus sur plusieurs cibles virales au-delà de l'adénovirus, réduisant ainsi les développements méthodologiques redondants.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive des méthodes de récupération des virus en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à une évaluation systématique des paramètres de filtration et d'élution.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation et la reproductibilité par des étapes définies (élution à l'extrait de viande, concentration secondaire par Sea Light, ajustement du pH à 4,0) et des critères quantifiables (pourcentage de récupération des AdV40 et AdV41).
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt dans le développement des tests de détection des pathogènes en identifiant les conditions optimales (filtre en cellulose de verre, extrait de viande à pH 10, Sea Light) offrant la récupération la plus élevée observée.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque des méthodes de concentration pour les programmes de surveillance environnementale, réduisant ainsi les échecs en phase avancée des procédés de détection des pathogènes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en virologie, en techniques de filtration et en manipulation précise de liquides pour les étapes de fortification en virus, d'assemblage des filtres et de centrifugation.
- Dépend d'instruments tels que des systèmes de filtration sous vide, des agitateurs magnétiques, des pH-mètres, des centrifugeuses (capables de 2 500 G et 4 000 G) ainsi que des tubulures stériles et des tubes de collecte.
- Exige une standardisation interéquipes des préparations de solutions (extrait de bœuf, célite, HCl, PBS) et des contrôles environnementaux (centrifugation à 4 °C, conditions stériles) afin d'assurer la reproductibilité.
- Implique des adaptations à envisager lors de l'application de la méthode à différents types de virus ou matrices aqueuses, car le rendement de récupération peut varier selon les propriétés virales (par exemple, le sérotype d'adénovirus) et la composition de l'échantillon (eau du robinet par rapport à des sources environnementales).
- Les limites pratiques incluent la nécessité d'une technique aseptique lors de la manipulation des virus et la variabilité potentielle des performances d'un lot de filtres à l'autre, ce qui pourrait affecter la reproductibilité de l'élution.
