Analyseur portable à base d'impédance en temps réel comme un outil pour délimiter voies moléculaires impliquées dans la neurotoxicité et la neuroprotection dans une lignée cellulaire neuronale

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser une technique basée sur l’impédance pour suivre la protection cyto en temps réel d’une lignée cellulaire neuronale afin de délimiter l’implication des voies de second messager dans le processus de protection. Ceci est accompli en cultivant d’abord une lignée cellulaire neuronale dans des conditions prolifératives dans un analyseur de cellules en temps réel basé sur l’impédance. Dans un deuxième temps, potentiellement pertinent.

Deuxièmement, les voies messagères sont inhibées pharmacologiquement avant de soumettre la lignée cellulaire à des traitements neuroprotecteurs. Ensuite, l’état de la lignée cellulaire neuronale est suivi à l’aide d’un analyseur de cellules en temps réel dans les différentes conditions expérimentales. En fin de compte, l’analyse statistique peut être utilisée pour évaluer l’implication en temps réel des voies de second messager dans la protection cyto des cellules neuronales.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les tests de neurotoxicité des points finaux, est qu’elle permet d’évaluer la protection et la toxicité de Tito dans des lignées cellulaires neuronales en temps réel et dans des conditions sans marquage. Cette méthode peut aider à répondre à des questions rapides dans le domaine de la neurobiologie moléculaire en contribuant à une évaluation à plus haut débit des composés neuroprotecteurs potentiels in vitro, et en fournissant un aperçu des mécanismes moléculaires impliqués dans la neuroprotection. Par exemple, ici, les cellules S-K-N-S-H du neuroblastome humain sont utilisées avec le PBS, puis la trypsine dans les cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Retirer la trypsine par centrifugation puis remettre en suspension les cellules dans 10 millilitres de milieu de prolifération. Après avoir compté les cellules, diluez-les à une concentration de trois fois 10 à cinq cellules par millilitre avec plus de milieu de prolifération, puis équilibrez chaque puits d’un EPL 96 avec 100 microlitres de milieu de prolifération dans une hotte de culture tissulaire à température ambiante. Après 30 minutes, insérez l’EPL 96 dans une station d’analyse de cellules en temps réel dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius et démarrez le logiciel d’analyse de cellules en temps réel.

Ensuite, sur la page de mise en page, sélectionnez les puits appropriés pour l’expérience et entrez le type de cellule, le numéro de cellule et les noms et concentrations des composés chimiques d’intérêt dans les cases d’édition de la page du logiciel de planification, car la première étape est prédéfinie. Pour la mesure en arrière-plan, sélectionnez Ajouter une étape et définissez la deuxième étape pour mesurer l’index de cellule toutes les 15 minutes pendant 96 heures. Cliquez ensuite sur Démarrer pour lancer la première étape et mesurer l’impédance d’arrière-plan du support.

Retirez maintenant l’EPL et ajoutez 100 microlitres de suspension de cellules de neuroblastome. Pour chaque puits expérimental, faites tourner doucement l’EPL 96 pour enrober uniformément les puits, puis incubez la plaque à température ambiante dans le capot de culture tissulaire pour permettre aux cellules de se stabiliser après une demi-heure, chargez l’EPL 96 dans la station d’analyse de cellules en temps réel et commencez la deuxième étape. Pour surveiller les valeurs d’index de cellule tout au long de l’expérience, affichez les courbes de cellule sur la page de graphique et les données brutes d’index de cellule sur la page d’index de cellule 24 heures.

Après avoir plaqué les cellules, mettez l’expérience en pause et retirez la plaque de la station d’analyse de cellules en temps réel. Versez un microlitre des inhibiteurs d’intérêt fraîchement dilués dans chaque puits, puis, après avoir rechargé l’EPL 96, reprenez les mesures expérimentales de l’indice cellulaire après 30 minutes, interrompez à nouveau l’expérience et retirez rapidement mais soigneusement le milieu de prolifération de chaque puits en dirigeant le bord de la pointe de la pipette vers le coin du puits pour éviter de perturber la couche cellulaire adhérente. Ensuite, ajoutez immédiatement 200 microlitres de milieu de privation sérique dans chaque puits, un microlitre des composés neuroprotecteurs d’intérêt fraîchement dilués et un microlitre d’inhibiteurs de la deuxième voie messagère d’intérêt dans les puits appropriés.

Continuez ensuite avec les mesures de l’indice de cellule toutes les 15 minutes pendant 96 heures comme précédemment défini pour analyser les données, sélectionnez maintenant les fonctions d’indice de cellule normalisé et de temps normalisé sur la page de tracé pour normaliser l’indice de cellule jusqu’au dernier point temporel avant les modifications de la culture cellulaire. Réduire la variation entre les expériences. Mettez en surbrillance les puits sur la page du graphique pour les conditions expérimentales d’intérêt et cliquez sur ajouter pour tracer les courbes d’indice de cellule normalisées.

Exportez ensuite les données expérimentales pour tous les points temporels de l’index cellulaire de la page du logiciel d’index cellulaire dans un fichier tableur pour l’analyse statistique des différences entre les valeurs de l’indice cellulaire dans les différentes conditions de traitement à des moments spécifiques. Sélectionnez les valeurs d’index de cellule à leurs points temporels respectifs dans le fichier de feuille de calcul exporté. Enfin, analysez les valeurs de l’indice cellulaire pour les points temporels sélectionnés avec une ou deux voies de l’analyse de la variance, suivie d’un test post hoc À l’aide d’un logiciel statistique. Les stimuli neurotoxiques pour les cellules conduisent à une diminution des valeurs de l’indice cellulaire ici, une augmentation de l’indice cellulaire lorsque les cellules S-K-N-S-H sont cultivées dans un milieu de prolifération et la baisse de l’indice cellulaire suivie d’une stabilisation aux nouveaux niveaux inférieurs après Le passage des cellules au milieu de privation sérique est illustré dans ces graphiques.

L’effet neuroprotecteur de deux agonistes des récepteurs de la sérotonine a cinq micromolaires, DOI et 20 micromolaires IDE ajoutés lorsque les cellules ont été nourries avec une privation sérique, moyen peut être observé. Une question importante dans les études de neuroprotection est de savoir si un effet sur la prolifération cellulaire contribue à l’effet composé observé sur la survie cellulaire. Dans ce graphique, l’absence d’effet du traitement DOI à cinq micromolaires sur la prolifération cellulaire de SKNS est montrée, ce qui suggère que la prolifération ne contribue pas à l’effet neuroprotecteur observé.

Dans ce dernier graphique, on peut observer l’effet du traitement par 10 micromolaires de l’inhibiteur initial de la phosphatidyle à trois kinases LY 2 9 4 0 0 2 sur la survie cellulaire et l’effet neuroprotecteur du DOI sur les cellules SK NSH privées de sérum et de leur système sérique. LY 2 9 4 0 0 2 a empêché l’effet neuroprotecteur du DOI pendant la phase de privation sérique, mais a également montré un effet toxique qui lui est propre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de suivre la protection contre les CTO dans une lignée cellulaire neuronale à l’aide d’un analyseur de cellules en temps réel, et de délimiter l’implication des voies de second messager dans la protection.