Name: Analyseur portable à base dimpédance en temps réel comme un outil pour délimiter voies moléculaires impliquées dans la neurotoxicité et la neuroprotection dans une lignée cellulaire neuronale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Découvrez une technique d'impédance pour suivre en temps réel la cytoprotection dans des lignées cellulaires neuronales. Cette méthode permet d'étudier le rôle des voies de seconds messagers dans la neuroprotection.

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Le soutien financier des expériences présentées dans l’étude a été fourni par le programme Marie Heim-Vögtlin du Fonds national suisse de la recherche scientifique.
Nous remercions Mme Johanna Nyffeler d’avoir développé un ensemble de programmes MATLAB modifiés pour le dépistage des différences statistiquement significatives dans les données de l’analyseur de cellules en temps réel, et le Dr Yama Abassi pour sa discussion utile.

Préparation 1 <ol><li> Placez la station de la temps réel analyseur de cellules dans un incubateur de culture de tissu fixée à 37 ° C et 5% de CO 2. Effectuer toutes les manipulations de culture cellulaire et de traitements pharmacologiques dans une hotte de culture de tissu dans des conditions stériles. </li><li> NOTE: neuronale lignées cellulaires nécessitant différents réglages de température par rapport à des conditions normales de culture, doivent être ajustés en conséquence. Pour les lignées cellulaires faiblement adhérentes, utiliser les agents de revêtement pour faciliter l&#39;interaction des cellules avec les microélectrodes d&#39;or dans le fond des puits de la plaque E-96. </li><li> Préparer 1,000X solutions stock des composés pharmacologiques pour le traitement de culture cellulaire (agents neuroprotecteurs ou deuxième inhibiteurs de voies de messagerie dans le solvant approprié - diméthylsulfoxyde ou de l&#39;eau stérile) et de les stocker à -20 ° C. Utilisez le solvant comme véhicule dans les traitements suivants. </li><li> Culture des cellules de neuroblastome humain SK-N-SH dans du DMEM / F1Deux milieu supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) (milieu de prolifération) dans des flacons de culture cellulaire avec 175 cm 2 de surface de densité d&#39;environ 75%. Garder nombre de passage de cellules dans une plage (environ 10 passages) pour vérifier la cohérence entre les expériences en termes de taux de prolifération cellulaire et de la réponse de cytotoxicité. Les nombres inférieurs de passage sont préférés. </li><li> Laver la couche adhérente de cellules SK-N-SH avec du PBS, et trypsiniser avec une solution de trypsine-EDTA à 0,05% pendant 5 min à 37 ° C. Centrifuger les cellules à 170 xg pendant 5 min pour éliminer la trypsine. Remettre en suspension les cellules dans du milieu de prolifération de 10 ml. Compter les cellules avec Sceptre compteur de cellules et d&#39;ajuster le nombre de cellules à 300 000 cellules / ml en diluant les cellules avec un milieu de prolifération. </li></ol> 2. placage et la prolifération des cellules SK-N-SH <ol><li> Ajouter milieu de prolifération de 100 ul dans chaque puits de la plaque de E-96 et le laisser pendant 30 min dans la hotte de culture de tissu à la température ambiante pour équilibrer. Insérez le E-Plate 96 dans la station d&#39;analyse de cellules en temps réel dans l&#39;incubateur à CO2 à 37 ° C. </li><li> Démarrez le logiciel de l&#39;analyseur de cellules en temps réel. Sur la page Mise sélectionner les puits inclus dans l&#39;expérience et entrent dans les boîtes de saisie des informations sur le type de cellule, le nombre de cellules, les noms et les concentrations de composés chimiques utilisés pour le traitement des cellules. NOTE: Pour les fins du présent protocole au moins 4 répétitions sont recommandés pour chaque traitement. </li><li> Sur la page du logiciel de l&#39;annexe déterminer &quot;Steps&quot; inclus dans l&#39;expérience, en sélectionnant le nombre de balayages de mesure l&#39;indice cellulaire et l&#39;intervalle entre les balayages pour chaque étape. Depuis l&#39;étape 1 est prédéterminée pour la mesure de fond, sélectionnez «Ajouter une étape» et réglez l&#39;étape 2 pour mesurer l&#39;indice cellulaire toutes les 15 minutes pendant 96 heures. NOTE: Pour les traitements, dans lequel les effets avec une cinétique rapide sont attendus, mis balayages à intervalles plus rapprochés. </li><li> Cliquez sur Démarrer pour lancer l&#39;étape prédéterminée automatiquement 1et mesurer l&#39;impédance des supports de fond. Cette valeur est soustraite automatiquement par le logiciel au niveau de chaque point de données une fois que les cellules sont ajoutées aux puits. </li><li> Utilisation préparé précédemment dans l&#39;étape 1.5), suspension de cellules de 300 000 cellules / ml dans du milieu de prolifération. 30 000 cellules / puits pour la toxicité cellulaire / études de neuroprotection et 15 000 cellules / puits pour des études de prolifération de cellules. Sortez le E-Plate et ajouter 100 suspension cellulaire par puits pour la toxicité cellulaire / études de neuroprotection et ajouter 50 ul suspension de cellules et milieu de prolifération de 50 pi par puits pour les études de la prolifération cellulaire. Le nombre de cellules étalées par puits doit être optimisée pour chaque lignée cellulaire de façon empirique. </li><li> Agitez doucement le E-Plate 96, même pour le placage des cellules. Laisser la plaque E-96 à 30 min dans la hotte de culture de tissu à la température ambiante pour permettre aux cellules de se déposent uniformément sur le fond des puits. </li><li> Insérez le E-Plate 96 dans la station d&#39;analyse cellulaire en temps réel et commencer à l&#39;étape 2 de l&#39;annexe pâge. Surveiller les valeurs de l&#39;indice de la cellule à travers l&#39;expérience en regardant les courbes de cellules sur la page de terrain et les données de l&#39;indice cellulaire premières sur la page Index portable du logiciel. </li></ol> 3. la privation de sérum <ol><li> 24 heures après l&#39;étalement des cellules, mettre en pause l&#39;expérience, et retirez le E-Plate 96 de la station d&#39;analyse cellulaire en temps réel. Diluer deuxième inhibiteurs de messager des stocks 1,000X avec un milieu sans sérum / DMEM F12 - 200 × la concentration finale. Traiter les cellules avec 1 pi inhibiteurs de la seconde piste de messagerie pour être testés pour leur implication dans la neurotoxicité / neuroprotection 30 min avant de commencer la cytotoxicité, pour inhiber les voies respectives. Retour le E-Plate 96 de la gare et reprendre les mesures expérimentales de l&#39;indice de la cellule. </li><li> Après 30 min de pause à nouveau l&#39;expérience. Retirez délicatement milieu de prolifération pleinement de l&#39;E-Plate 96 puits avec une pipette (ou multi-canal pipette), en prenant soin de ne pas perturber la couche de cellules adhérentesen orientant le bord de la pointe de la pipette à l&#39;angle du puits. Ajouter 200 pl / puits de DMEM sans sérum / milieu F12 (milieu de privation de sérum). Assurer un échange rapide d&#39;un milieu de culture cellulaire pour réduire au minimum l&#39;agitation mécanique des cellules. </li><li> Diluer les composés à tester pour leurs effets neuroprotecteurs de 1,000X actions avec le milieu DMEM / F12 sans sérum à 200 × la concentration finale. Ajouter 1 composés de pi à tester leurs effets neuroprotecteurs et 1 pi inhibiteurs de la seconde piste de messagerie dans les puits individuels selon le plan expérimental. </li><li> Dans les cellules pour des études de prolifération ne changez pas moyen. Diluer les composés à tester de 1,000X actions à 200 × la concentration finale dans le milieu de la prolifération, de traiter avec 1 l par puits et continuer à la culture en milieu de prolifération. </li><li> Reprendre l&#39;expérience pour poursuivre Index cellulaires mesures toutes les 15 minutes pendant 96 heures comme indiqué précédemment. </li></ol> 4. données Analyse <ol><li> Pour neurotoxicité / données de neuroprotection normaliser l&#39;indice cellulaire au dernier point de temps avant le traitement pharmacologique ou changement de milieu pour réduire les variations entre les expériences en sélectionnant &quot;Cell normalisée Index&quot; et &quot;normaliser Time&quot; sur la page de la parcelle. </li><li> Mettez en surbrillance les puits sur la page de la parcelle pour les conditions expérimentales d&#39;intérêt et cliquez sur &quot;Ajouter&quot; pour tracer les courbes normalisées de l&#39;indice de la cellule. Observer la cinétique de l&#39;effet neurotoxique / neuroprotecteur, ou de messagers deuxième inhibition que les courbes de l&#39;indice cellulaire normalisées en fonction du temps. </li><li> Respecter les courbes de l&#39;indice de portable pour les traitements médicamenteux testés en milieu de prolifération en fonction du temps d&#39;évaluer si un effet sur la prolifération est impliqué dans l&#39;effet neuroprotecteur / neurotoxique. </li><li> Exporter l&#39;info expérimental pour tous les points Cell temps Indice de la page du logiciel Indice de cellules dans un fichier Excel pour lancer l&#39;évaluation statistique des résultats <br/&gt; NOTE: Dans une première étape dans l&#39;analyse statistique, un ensemble de programmes MATLAB modifiés qui utilisent le test t de Welch, avec le p-valeur tracée semilogarithmically, utiliser axe inversé sur l&#39;échelle de temps (à condition que les fichiers de code supplémentaires). Ces programmes permettent la détection des valeurs de p au-dessus de l&#39;évolution temporelle de l&#39;ensemble de l&#39;expérience en temps réel de l&#39;analyseur de la cellule, et ainsi faciliter la sélection de points dans le temps pour l&#39;analyse statistique plus détaillée. Voir le matériel complémentaire pour des informations détaillées sur les programmes. </li><li> Pour l&#39;analyse statistique des différences cellulaires valeurs de l&#39;indice sous différentes conditions de traitement à des moments spécifiques, sélectionnez des valeurs de l&#39;indice cellulaire à des moments respectifs à partir du fichier Excel exporté. Analyser les valeurs de l&#39;indice de la cellule pour les points de temps choisis avec un sens ou dans les deux sens l&#39;analyse de variance (Anova) suivie d&#39;un test post-hoc en utilisant un logiciel statistique. </li></ol>

<ol><li>Cavallucci, V., D'Amelio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matter+of+life+and+death%3A+the+pharmacological+approaches+targeting+apoptosis+in+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases.</a> Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).</li>
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<li>Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xCELLigence+system+for+real-time+and+label-free+monitoring+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability.</a> Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).</li>
<li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability%2C+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLoS One. 7 (10), e46536(2012).</li>
<li>Diemert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+measurement+for+real-time+detection+of+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death.</a> J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).</li>
<li>Kustermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+label-free%2C+impedance-based+real+time+assay+to+identify+drug-induced+toxicities+and+differentiate+cytostatic+from+cytotoxic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects.</a> Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).</li>
<li>Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT2A+serotonin+receptor+agonist+DOI+alleviates+cytotoxicity+in+neuroblastoma+cells%3A+role+of+the+ERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neuropsychopharmacol.+Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).</li>
<li>González-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens+recruit+specific+cortical+5-HT%282A%29+receptor-mediated+signaling+pathways+to+affect+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior.</a> Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).</li>
<li>Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+%285-HT%29+induces+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+%28GDNF%29+mRNA+expression+via+the+transactivation+of+fibroblast+growth+factor+receptor+2+%28FGFR2%29+in+rat+C6+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells.</a> J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).</li>
<li>Galante, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+toxicity%2C+conformation+and+morphology+of+typical+initial+aggregation+states+of+A%CE%B21-42+and+A%CE%B2py3-42+beta-amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).</li>
<li>Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+or+target+deprivation-induced+neuronal+death+causes+oxidative+neuronal+accumulation+of+Zn2%2Band+loss+of+NAD%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).</li>
</ol>

Les frais de publication de la vidéo-article en cours ont été parrainés par &quot;ACEA Biosciences&quot;.

Le protocole actuel présente l&#39;utilité d&#39;une cellule d&#39;analyse en temps réel pour évaluer de façon continue et dans des conditions sans étiquette / les effets neuroprotecteurs des composés neurotoxiques dans des lignées cellulaires neuronales et pour mieux comprendre les secondes voies de messagers impliqués dans l&#39;effet. Même si l&#39;utilité du temps réel analyseur de cellules pour étudier la cytotoxicité et les effets des médicaments sur la prolifération cellulaire est gén...

La mort cellulaire neuronale joue un rôle critique dans la pathophysiologie de nombreux troubles liés au cerveau 1. La disponibilité d&#39;informations fiables et à haut débit dans des tests de toxicité in vitro est essentiel d&#39;avoir un meilleur aperçu des mécanismes de la neurotoxicité et d&#39;aider à sélectionner des molécules neuroprotectrices comme candidats thérapeutiques dans le développement de médicaments 2. Cependant, il ya beaucoup de limitations à la plus largement utilisée in vitro neurotoxicité assays.They évaluer la neurotoxicité / neuroprotection à un seul point dans le temps ne permet pas la résolution cinétique; utilisent souvent l&#39;étiquette ou de la sonde qui peut interférer avec les voies de signalisation et de limiter d&#39;autres études dans la même population de cellules, et sont souvent de main-d&#39;œuvre, et dans de nombreux cas ne fournit pas une approche mécanistique. Dans la présente étude, nous avons démontré l&#39;utilité d&#39;une cellule d&#39;analyse en fonction de l&#39;impédance en temps réel afin de déterminer la neurotoxicité et de neuroprotection dans une lignée cellulaire neuronale, en temps réel et sans marqueur sousconditions et permettent de mieux comprendre les mécanismes en aval à travers l&#39;analyse de la seconde piste de messagerie impliqués dans l&#39;effet. Des études antérieures ont confirmé la validité de la cellule d&#39;analyse en temps réel afin de déterminer la cytotoxicité, ainsi que les effets sur la prolifération cellulaire dans les lignées cellulaires par comparaison avec des techniques classiques 3,4,5,6. Par exemple, une bonne corrélation a été observée entre les lectures de la norme viabilité cellulaire WST-1 essai et cellulaires valeurs de l&#39;indice à plusieurs points dans le temps dans des conditions de prolifération basale et après deux paradigmes différents toxiques dans les cellules HeLa 3. Dans A549 et MDA-MB-231 cellules prolifération et la cytotoxicité provoquée par le paclitaxel de stabilisation des microtubules ont montré des valeurs très similaires lors de l&#39;évaluation par la mesure de l&#39;indice cellulaire et la sulforhodamine utilisé en standard B (SRB) essai 4. Dans la lignée cellulaire neuronale de neurones de l&#39;hippocampe immortalisés Index HT-22 cellulaires mesures ont été validés pour leur capacité to détecter la prolifération cellulaire, la cytotoxicité et la glutamate cytoprotection contre le 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl) largement utilisé du 2,5-diphényl-bromure (MTT) 5. Dans la même étude, les résultats d&#39;analyse de MTT et les mesures de l&#39;indice cellulaire aussi bien corrélées à la mesure neuronale des cellules progénitrices prolifération, cytotoxicité après les facteurs de croissance privation et de sauvetage de la cytotoxicité par le pan-caspase inhibiteur QVD 5. La cytotoxicité induite dans des cellules NIH 3T3 par Vandetanib (récepteur du facteur de croissance de l&#39;endothélium vasculaire et d&#39;un inhibiteur du récepteur du facteur de croissance épidermique) a montré des résultats similaires avec des valeurs mesurées de l&#39;indice cellulaire ou neutre essai d&#39;absorption rouge 6. Récemment, nous avons utilisé le système d&#39;analyse de cellules en temps réel pour évaluer les effets neuroprotecteurs de la figure 2A de la sérotonine (5-HT 2A) agoniste du récepteur de chlorhydrate de (±) -2,5-diméthoxy-4-iodoamphétamine (DOI) dans une lignée cellulaire neuronale ( cellules SK-N-SH) et criblés pour la participation du second voies de messagerie par le biais de la surveillance de l&#39;effet de leur inhibition chimique sur la neuroprotection observée 7. Fait intéressant, le récepteur 5-HT 2A a agonistes fois hallucinogènes et nonhallucinogenic (comme DOI et lisuride, respectivement), ce qui peut activer les deux secondes voies de messagerie communs et distincts 8. Les avantages de la technique présentée est qu&#39;il permet de recueillir des informations en temps réel sur la survie des cellules au cours de jours, pour délimiter les voies de seconds messagers impliqués, afin d&#39;évaluer la contribution possible des effets de prolifération à la neuroprotection, et pour sélectionner un temps optimal des études supplémentaires de point final sur la même population de cellules. Un diagramme schématique du flux de travail dans le protocole actuel est présenté sur la figure 1.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence&nbsp ; Ensemble de système SP RTCA</td><td>ACEA Biosciences</td><td>N° : 00380601030</td><td>Se compose d’un analyseur RTCA, d’une station SP RTCA et d’une unité de contrôle RTCA</td></tr><tr><td>E-plate 96</td><td>N° ACEA Biosciences</td><td>N° : 05232368001</td><td>Pour la culture des cellules, insérées dans la station SP RTCA</td></tr> CELLULES <tr><td>SK-N-SH ATCC</td><td>(EN PARTENARIAT AVEC LGC Standards)</td><td>HTB-11</td><td>Peut être remplacé par une autre lignée cellulaire neuronale adhérente d’intérêt</td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Life Technologies</td><td>16140-063</td><td>Suppléments de prolifération, mais pas de milieu de privation sérique</td></tr><tr><td>Fiole de culture tissulaire T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.302</td><td>Pour la culture de cellules, qui seront ensuite plaquées sur la E-Plate 96</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td>Pour la trypsinisation de cellules cultivées dans des flacons de culture tissulaire</td></tr><tr><td>Compteur de cellules Scepter 2.0 Compteur de cellules</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC20060</td><td>Compteur de cellules automatisé</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>Pour le lavage des cellules</td></tr> <tr><td>(&plusmn ;)-Chlorhydrate DOI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D101</td><td>5-HT2A agoniste pour le traitement par culture cellulaire</td></tr><tr><td>LY-294002</td><td>Inhibiteur de PI3-K</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L9908</td> pour le traitement par culture cellulaire.</tr><tr><td>Maléate de lisuride</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4052</td><td>Composé à activité agoniste 5-HT2A pour le traitement de la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>Pour dissoudre le LY-294002 et le maléate de lisuride</td></tr></tbody></table>

analyseur portable à base d&#39;impédance en temps réel comme un outil pour délimiter voies moléculaires impliquées dans la neurotoxicité et la neuroprotection dans une lignée cellulaire neuronale

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

De nombreux troubles liés au cerveau ont mort des cellules neuronales impliquées dans leur physiopathologie. Amélioration des modèles in vitro pour étudier les effets neuroprotecteurs ou neurotoxiques de drogues et les voies en aval concernés aiderait mieux comprendre les mécanismes moléculaires de neuroprotection / neurotoxicité et pourrait faciliter le développement de médicaments. Cependant, de nombreux tests in vitro existantes sur la toxicité comportent des limites importantes - plus évaluer la neurotoxicité et la neuroprotection à un seul point du temps, ne permettant pas d&#39;observer l&#39;évolution temporelle et la cinétique de l&#39;effet. En outre, la possibilité de recueillir des informations sur les voies de signalisation impliquées dans la neuroprotection aval en temps réel serait d&#39;une grande importance. Dans le protocole en vigueur, nous décrivons l&#39;utilisation d&#39;une cellule d&#39;analyse en fonction de l&#39;impédance en temps réel pour déterminer les effets neuroprotecteurs de la serotonine 2A (5-HT 2A) des agonistes du récepteur dans une lignée de cellules neuronales dans le cadre sans marquage et en temps réel conditions à l&#39;aide de mesures d&#39;impédance. De plus, nous démontrons que les inhibiteurs de la seconde piste de messagerie peuvent être utilisés pour délimiter les molécules en aval impliqués dans l&#39;effet neuroprotecteur. Nous décrivons également l&#39;utilité de cette technique pour déterminer si un effet sur la prolifération cellulaire contribue à un effet neuroprotecteur observé. Le système utilise des plaques spéciales microélectroniques dénommé E-plaques qui contiennent alternance réseaux de microélectrodes d&#39;or sur la surface inférieure des puits, servant de capteurs cellulaires. L&#39;affichage de l&#39;impédance est modifiée par le nombre de cellules adhérentes, la viabilité des cellules, la morphologie, et l&#39;adhérence. Un paramètre sans dimension appelé l&#39;indice cellulaire est dérivé à partir des mesures d&#39;impédance électrique et est utilisée pour représenter l&#39;état de la cellule. Dans l&#39;ensemble, le temps réel analyseur de cellules à base d&#39;impédance permet en temps réel, l&#39;évaluation sans étiquette de la neuroprotection et la neurotoxicité, et l&#39;évaluation de la deuxième participation de voies de messagerie, contribuant à plusévaluation détaillée et à haut débit de composés neuroprotecteurs potentiels in vitro, pour la sélection des candidats thérapeutiques.

<html> Privation de sérum conduit à diminuer dans les piles valeurs de l&#39;indice, qui peuvent être surveillés en permanence avec la cellule d&#39;analyse en temps réel Stimuli neurotoxiques aux cellules conduisent à une diminution de cellulaires valeurs de l&#39;indice, qui peut être surveillé en temps réel avec la technique présentée et dont la dynamique dépend de la relance neurotoxique spécifique et le type de cellule étudiée. Figure 2 montre l&#39;augm...

Des tests de neurotoxicité in vitro améliorés aideraient à identifier de nouveaux composés neuroprotecteurs. L’utilité d’un analyseur de cellules basé sur l’impédance en temps réel pour déterminer la cytotoxicité et la cytoprotection dans les lignées cellulaires neuronales et pour délimiter l’implication des secondes voies messagères, permettant ainsi de mieux comprendre le mécanisme de la neuroprotection, est présentée.

Analyseur portable à base d&#39;impédance en temps réel comme un outil pour délimiter voies moléculaires impliquées dans la neurotoxicité et la neuroprotection dans une lignée cellulaire neuronale

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser une technique basée sur l'impédance pour suivre en temps réel la cytoprotection d'une lignée cellulaire neuronale afin de préciser le rôle des voies de messagerie secondaire dans le processus de protection. Ceci est réalisé en premier lieu en cultivant une lignée cellulaire neuronale dans des conditions prolifératives dans un analyseur cellulaire en temps réel basé sur l'impédance. Dans la deuxième étape, potentiellement pertinente.Les voies de messagerie secondaire sont inhibées pharmacologiquement avant de soumettre la lignée cellulaire à des traitements neuroprotecteurs. Ensuite, l'état de la lignée cellulaire neuronale est suivi à l'aide d'un analyseur cellulaire en temps réel dans différentes conditions expérimentales. Enfin, une analyse statistique peut être utilisée pour évaluer l'implication en temps réel des voies de messagerie secondaire dans la cytoprotection des cellules neuronales.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les tests de neurotoxicité en point final, est qu'elle permet d'évaluer en temps réel et dans des conditions sans marquage la protection Tito et la toxicité Tito dans des lignées cellulaires neuronales. Cette méthode peut aider à répondre rapidement à des questions dans le domaine de la neurobiologie moléculaire en contribuant à une évaluation plus performante de composés neuroprotecteurs potentiels in vitro, et en fournissant des informations sur les mécanismes moléculaires impliqués dans la neuroprotection. Commencez par laver une couche de lignée cellulaire neuronale adhérente. Par exemple ici, des cellules de neuroblastome humain S-K-N-S-H sont utilisées avec du PBS, puis les cellules sont traitées à la trypsine pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.Éliminer la trypsine par centrifugation, puis resuspendre les cellules dans 10 millilitres de milieu de prolifération. Après avoir dénombré les cellules, les diluer à une concentration de trois fois 10 à la puissance 5 cellules par millilitre à l’aide de milieu de prolifération supplémentaire, puis équilibrer chaque puits d’une plaque EPL 96 avec 100 microlitres de milieu de prolifération dans une hotte de culture cellulaire à température ambiante. Après 30 minutes, insérer la plaque EPL 96 dans une station d’analyse en temps réel des cellules placée dans un incubateur à dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius et démarrer le logiciel d’analyse en temps réel des cellules.Ensuite, sur la page de disposition, sélectionnez les puits appropriés pour l'expérience et saisissez le type cellulaire, le nombre de cellules ainsi que les noms et concentrations des composés chimiques d'intérêt dans les zones de saisie de la page du logiciel de programmation, car l'étape un est prédéfinie. Pour la mesure du fond, sélectionnez ajouter une étape et réglez l'étape deux pour mesurer l'indice cellulaire toutes les 15 minutes pendant 96 heures. Cliquez ensuite sur démarrer pour lancer l'étape un et mesurer l'impédance de fond du milieu.Retirez maintenant l'EPL et ajoutez 100 microlitres de la suspension de cellules de neuroblastome. Pour chaque puits expérimental, agitez doucement l'EPL 96 afin de recouvrir uniformément les puits, puis incubez la plaque à température ambiante dans la hotte de culture tissulaire pour permettre aux cellules de se déposer. Après une demi-heure, replacez l'EPL 96 dans la station de l'analyseur cellulaire en temps réel et démarrez l'étape deux. Pour surveiller les valeurs de l'indice cellulaire tout au long de l'expérience, consultez les courbes cellulaires sur la page de graphique et les données brutes de l'indice cellulaire sur la page de l'indice cellulaire 24 heures.Après avoir ensemencé les cellules, interrompez l'expérience et retirez la plaque du poste d'analyse en temps réel des cellules. Ajoutez un microlitre des inhibiteurs d'intérêt fraîchement dilués dans chaque puits, puis, après avoir rechargé l'EPL 96, reprenez les mesures d'indice cellulaire après 30 minutes. Interrompez à nouveau l'expérience et retirez rapidement mais soigneusement le milieu de prolifération de chaque puits en orientant le bord de la pointe de pipette vers l'angle du puits afin d'éviter de perturber la couche de cellules adhérentes. Ajoutez ensuite immédiatement 200 microlitres de milieu de privation de sérum dans chaque puits, un microlitre des composés neuroprotecteurs d'intérêt fraîchement dilués, et un microlitre des inhibiteurs d'intérêt ciblant les voies des seconds messagers dans les puits appropriés.Ensuite, poursuivez les mesures de l'indice cellulaire toutes les 15 minutes pendant 96 heures comme précédemment configuré pour analyser les données. Sélectionnez maintenant les fonctions d'indice cellulaire normalisé et de temps normalisé sur la page du graphique afin de normaliser l'indice cellulaire par rapport au dernier point temporel avant les modifications apportées à la culture cellulaire, afin de réduire la variabilité entre les expériences. Mettez en surbrillance les puits sur la page du graphique correspondant aux conditions expérimentales d'intérêt, puis cliquez sur « ajouter » pour tracer les courbes d'indice cellulaire normalisé.Ensuite, exporter les données expérimentales pour tous les points temporels de l'indice cellulaire à partir de la page du logiciel d'indice cellulaire vers un fichier de feuille de calcul afin d'effectuer une analyse statistique des différences entre les valeurs d'indice cellulaire sous différentes conditions de traitement à des points temporels spécifiques. Sélectionner les valeurs d'indice cellulaire à leurs points temporels respectifs dans le fichier de feuille de calcul exporté. Enfin, analyser les valeurs d'indice cellulaire pour les points temporels sélectionnés à l'aide d'une analyse de variance à un ou deux facteurs, suivie d'un test post hoc. À l'aide d'un logiciel statistique, les stimuli neurotoxiques appliqués aux cellules entraînent une diminution des valeurs d'indice cellulaire ; ici, une augmentation de l'indice cellulaire lorsque les cellules S-K-N-S-H sont cultivées en milieu de prolifération, ainsi qu'une baisse de l'indice cellulaire suivie d'une stabilisation à de nouveaux niveaux inférieurs après le passage des cellules en milieu sans sérum, sont illustrées sur ces graphiques.L'effet neuroprotecteur de deux agonistes du récepteur sérotoninergique 2A, l'IDO à cinq micromolaires et l'IDE à 20 micromolaires, ajoutés lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu sans sérum, peut être observé. Une question importante dans les études de neuroprotection est de savoir si un effet sur la prolifération cellulaire contribue à l'effet observé du composé sur la survie cellulaire. Sur ce graphique, l'absence d'effet du traitement par l'IDO à cinq micromolaires sur la prolifération des cellules SKNS est montrée, suggérant que la prolifération n'est pas impliquée dans l'effet neuroprotecteur observé.Dans ce dernier graphique, on peut observer l'effet d'un traitement par 10 micromolaire de l'inhibiteur de la phosphatidylinositol 3-kinase LY 294002 sur la survie cellulaire ainsi que l'effet neuroprotecteur de la DOI sur les cellules SK-N-SH privées de sérum. Le LY 294002 a empêché l'effet neuroprotecteur de la DOI durant la phase de privation de sérum, mais a également présenté un certain effet toxique propre. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment suivre la protection contre la CTO dans une lignée cellulaire neuronale à l'aide d'un analyseur cellulaire en temps réel, et comment préciser l'implication des voies de messagers secondaires dans cette protection.

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