Analyseur portable à base d'impédance en temps réel comme un outil pour délimiter voies moléculaires impliquées dans la neurotoxicité et la neuroprotection dans une lignée cellulaire neuronale

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser une technique basée sur l'impédance pour suivre en temps réel la cytoprotection d'une lignée cellulaire neuronale afin de préciser le rôle des voies de messagerie secondaire dans le processus de protection. Ceci est réalisé en premier lieu en cultivant une lignée cellulaire neuronale dans des conditions prolifératives dans un analyseur cellulaire en temps réel basé sur l'impédance. Dans la deuxième étape, potentiellement pertinente.

Les voies de messagerie secondaire sont inhibées pharmacologiquement avant de soumettre la lignée cellulaire à des traitements neuroprotecteurs. Ensuite, l'état de la lignée cellulaire neuronale est suivi à l'aide d'un analyseur cellulaire en temps réel dans différentes conditions expérimentales. Enfin, une analyse statistique peut être utilisée pour évaluer l'implication en temps réel des voies de messagerie secondaire dans la cytoprotection des cellules neuronales.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les tests de neurotoxicité en point final, est qu'elle permet d'évaluer en temps réel et dans des conditions sans marquage la protection Tito et la toxicité Tito dans des lignées cellulaires neuronales. Cette méthode peut aider à répondre rapidement à des questions dans le domaine de la neurobiologie moléculaire en contribuant à une évaluation plus performante de composés neuroprotecteurs potentiels in vitro, et en fournissant des informations sur les mécanismes moléculaires impliqués dans la neuroprotection. Commencez par laver une couche de lignée cellulaire neuronale adhérente. Par exemple ici, des cellules de neuroblastome humain S-K-N-S-H sont utilisées avec du PBS, puis les cellules sont traitées à la trypsine pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Éliminer la trypsine par centrifugation, puis resuspendre les cellules dans 10 millilitres de milieu de prolifération. Après avoir dénombré les cellules, les diluer à une concentration de trois fois 10 à la puissance 5 cellules par millilitre à l’aide de milieu de prolifération supplémentaire, puis équilibrer chaque puits d’une plaque EPL 96 avec 100 microlitres de milieu de prolifération dans une hotte de culture cellulaire à température ambiante. Après 30 minutes, insérer la plaque EPL 96 dans une station d’analyse en temps réel des cellules placée dans un incubateur à dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius et démarrer le logiciel d’analyse en temps réel des cellules.

Ensuite, sur la page de disposition, sélectionnez les puits appropriés pour l'expérience et saisissez le type cellulaire, le nombre de cellules ainsi que les noms et concentrations des composés chimiques d'intérêt dans les zones de saisie de la page du logiciel de programmation, car l'étape un est prédéfinie. Pour la mesure du fond, sélectionnez ajouter une étape et réglez l'étape deux pour mesurer l'indice cellulaire toutes les 15 minutes pendant 96 heures. Cliquez ensuite sur démarrer pour lancer l'étape un et mesurer l'impédance de fond du milieu.

Retirez maintenant l'EPL et ajoutez 100 microlitres de la suspension de cellules de neuroblastome. Pour chaque puits expérimental, agitez doucement l'EPL 96 afin de recouvrir uniformément les puits, puis incubez la plaque à température ambiante dans la hotte de culture tissulaire pour permettre aux cellules de se déposer. Après une demi-heure, replacez l'EPL 96 dans la station de l'analyseur cellulaire en temps réel et démarrez l'étape deux. Pour surveiller les valeurs de l'indice cellulaire tout au long de l'expérience, consultez les courbes cellulaires sur la page de graphique et les données brutes de l'indice cellulaire sur la page de l'indice cellulaire 24 heures.

Après avoir ensemencé les cellules, interrompez l'expérience et retirez la plaque du poste d'analyse en temps réel des cellules. Ajoutez un microlitre des inhibiteurs d'intérêt fraîchement dilués dans chaque puits, puis, après avoir rechargé l'EPL 96, reprenez les mesures d'indice cellulaire après 30 minutes. Interrompez à nouveau l'expérience et retirez rapidement mais soigneusement le milieu de prolifération de chaque puits en orientant le bord de la pointe de pipette vers l'angle du puits afin d'éviter de perturber la couche de cellules adhérentes. Ajoutez ensuite immédiatement 200 microlitres de milieu de privation de sérum dans chaque puits, un microlitre des composés neuroprotecteurs d'intérêt fraîchement dilués, et un microlitre des inhibiteurs d'intérêt ciblant les voies des seconds messagers dans les puits appropriés.

Ensuite, poursuivez les mesures de l'indice cellulaire toutes les 15 minutes pendant 96 heures comme précédemment configuré pour analyser les données. Sélectionnez maintenant les fonctions d'indice cellulaire normalisé et de temps normalisé sur la page du graphique afin de normaliser l'indice cellulaire par rapport au dernier point temporel avant les modifications apportées à la culture cellulaire, afin de réduire la variabilité entre les expériences. Mettez en surbrillance les puits sur la page du graphique correspondant aux conditions expérimentales d'intérêt, puis cliquez sur « ajouter » pour tracer les courbes d'indice cellulaire normalisé.

Ensuite, exporter les données expérimentales pour tous les points temporels de l'indice cellulaire à partir de la page du logiciel d'indice cellulaire vers un fichier de feuille de calcul afin d'effectuer une analyse statistique des différences entre les valeurs d'indice cellulaire sous différentes conditions de traitement à des points temporels spécifiques. Sélectionner les valeurs d'indice cellulaire à leurs points temporels respectifs dans le fichier de feuille de calcul exporté. Enfin, analyser les valeurs d'indice cellulaire pour les points temporels sélectionnés à l'aide d'une analyse de variance à un ou deux facteurs, suivie d'un test post hoc. À l'aide d'un logiciel statistique, les stimuli neurotoxiques appliqués aux cellules entraînent une diminution des valeurs d'indice cellulaire ; ici, une augmentation de l'indice cellulaire lorsque les cellules S-K-N-S-H sont cultivées en milieu de prolifération, ainsi qu'une baisse de l'indice cellulaire suivie d'une stabilisation à de nouveaux niveaux inférieurs après le passage des cellules en milieu sans sérum, sont illustrées sur ces graphiques.

L'effet neuroprotecteur de deux agonistes du récepteur sérotoninergique 2A, l'IDO à cinq micromolaires et l'IDE à 20 micromolaires, ajoutés lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu sans sérum, peut être observé. Une question importante dans les études de neuroprotection est de savoir si un effet sur la prolifération cellulaire contribue à l'effet observé du composé sur la survie cellulaire. Sur ce graphique, l'absence d'effet du traitement par l'IDO à cinq micromolaires sur la prolifération des cellules SKNS est montrée, suggérant que la prolifération n'est pas impliquée dans l'effet neuroprotecteur observé.

Dans ce dernier graphique, on peut observer l'effet d'un traitement par 10 micromolaire de l'inhibiteur de la phosphatidylinositol 3-kinase LY 294002 sur la survie cellulaire ainsi que l'effet neuroprotecteur de la DOI sur les cellules SK-N-SH privées de sérum. Le LY 294002 a empêché l'effet neuroprotecteur de la DOI durant la phase de privation de sérum, mais a également présenté un certain effet toxique propre. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment suivre la protection contre la CTO dans une lignée cellulaire neuronale à l'aide d'un analyseur cellulaire en temps réel, et comment préciser l'implication des voies de messagers secondaires dans cette protection.