Les enregistrements simultanés à long terme à deux étapes de traitement neuronal à se conduire abeilles

L’objectif global de cette procédure est d’étudier le revêtement olfactif et la formation de la mémoire en utilisant l’accès à long terme à deux étapes de traitement neuronal indépendantes chez les abeilles domestiques. Ceci est accompli en assemblant d’abord des électrodes multicanaux à faible coût à partir de microfils de cuivre isolés et de supports sur mesure. L’étape suivante consiste à préparer une abeille vivante en retirant une section de sa capsule corale pour insérer deux électrodes traitées avec un colorant fluorescent dans le cerveau exposé.

La troisième étape consiste à enregistrer à partir des deux neuropilules ou tractus indépendants dans la voie olfactive, tout en stimulant avec des odeurs florales et des phéromones. Plus tard, après avoir disséqué le cerveau, un traceur fluorescent différent est injecté dans le lobe de l’antenne pour remplir les neurones cibles. Les pistes remblayées et les tracés d’électrodes sont ensuite visualisés pour produire une reconstruction tridimensionnelle de l’architecture neuronale.

En fin de compte, les relations dans le revêtement olfactif entre les deux populations de neurones à différents niveaux de traitement comme le lobe de l’antenne et le corps du champignon peuvent être mieux comprises à l’aide de ces techniques. Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que nos électrodes multicanaux sont très petites et peuvent être utilisées en combinaison, ce qui signifie que nous pouvons enregistrer simultanément dans différentes zones du cerveau après avoir été ancrés. Les fils flexibles permettent un rappel stable pendant plusieurs heures chez les animaux en comportement.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuropathologie, telles que la compréhension de la façon dont les animaux reçoivent, perçoivent et enfin calculent les usines olf de la vie à partir de leur environnement. Cette technique de double enregistrement peut donner un aperçu du mécanisme sous-jacent du codage des odeurs et des réseaux neuronaux en général. Il peut également être appliqué à d’autres organismes modèles chez les invertébrés ou les affections et la neurobiologie.

En général, les individus qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car beaucoup de formation est nécessaire pour identifier les neurones des abeilles en utilisant uniquement des repères morphologiques comme le lobe interne ou le lobe vertical du corps du champignon. Pour ce protocole, construisez un adaptateur d’électrode pour s’adapter à une carte d’interface d’électrode standard. Soudez d’abord trois courts morceaux de fils isolés à un connecteur à 18 broches.

Coupez ensuite un morceau de plaque de plexiglas et insérez une rainure peu profonde le long du côté le plus long. Ensuite, vissez les cosses de soudure dans la plaque de plexiglas et collez la plaque sur le dessus du connecteur. Connectez ensuite la base aux cosses à l’aide des trois fils courts.

Placez ensuite un capillaire en verre dans la rainure de la plaque de plexiglas. Le capillaire doit pouvoir glisser et être fixé par une vis À l’aide d’une goupille minutieuse, étendez le capillaire en verre vers l’extérieur d’environ cinq millimètres. Le capillaire et la broche seront utilisés pour soutenir et stabiliser les microfils d’électrodes.

Ensuite, positionnez trois microfils. À l’aide de ruban adhésif pour un meilleur accès, le capillaire en verre peut être retiré à l’aide d’une colle à aiguille à souder de 12 volts. Les fils avec la cire dentaire LMP ne collent pas le dernier tiers des fils.

Connectez maintenant cet ensemble de microfils multicanaux à l’adaptateur d’électrode. Positionnez le capillaire en verre allongé parallèlement aux microfils. Fixez cet accessoire avec de la cire dentaire le long du capillaire en verre qui se chevauche et de la goupille minutieuse.

Coupez ensuite les fils d’électrode en laissant deux à trois centimètres à partir de la broche minutieuse et deux à trois centimètres à partir de l’extrémité de l’électrode. Ensuite, fixez le capillaire dans l’adaptateur d’électrode et utilisez une vis pour stabiliser le tout en place. À 360 degrés Celsius.

Soudez les extrémités des fils perpendiculairement aux cosses. Vérifiez ensuite qu’il y a un contact électrique suffisamment fort en vérifiant que leur impédance est d’environ 300 kilo ohms à un kilohertz. Connectez maintenant les canaux du deuxième adaptateur d’électrode à l’électrode maîtresse et soudez les électrodes de référence et musculaires à la base des électrodes maîtres.

Enfin, montez l’électrode maître sur la carte d’interface de l’étage de tête. Fixez la deuxième électrode sur un adaptateur séparé après avoir obtenu les abeilles domestiques, refroidissez-en une sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit immobilisée. Ensuite, fixez l’abeille dans un support en plexiglas standard avec la tête exposée.

Appliquez de la cire dentaire chauffée à la base des yeux et à la jonction entre la tête et le thorax, sécurisant ainsi la tête. Continuez à utiliser la cire pour immobiliser l’œil du scape des antennes sur la capsule céphalique. Évitez d’appliquer de la cire sur le fagel, qui doit pointer vers l’avant.

Le Pro Bois doit être exempt de tout empiétement. Vérifiez qu’il peut bouger. Maintenant, rasez la capsule céphalique pour améliorer l’accessibilité.

Ensuite, nourrissez l’abeille avec les 30 % de saccharose qu’elle consommera. Cela garantit une bonne préparation, la viabilité et l’humidité des tissus. Maintenant, à l’aide d’un micro-scalpel, coupez verticalement le long du bord de l’œil et horizontalement au-dessus des bases de l’antenne.

Continuez à couper sous l’œil de la cellule O et retirez la cuticule lâche. Les glandes hypopharyngées doivent être écartées, tout comme la trachée. Cela dégagera le chemin pour l’insertion de l’électrode.

Commencez par insérer l’électrode de référence, un fil d’argent de 35 microns. Tout d’abord, faites une petite incision dans l’œil composé ipsilatéral. Ensuite, glissez l’électrode à travers celui-ci.

Ensuite, insérez le deuxième fil dans la région de projection musculaire sous l’œil latéral de la cellule O. Pour visualiser plus tard les positions des électrodes, trempez les électrodes dans une solution de chlorure de potassium à 0,5 molaire et à 5 % d’hydrocyte Alexa 4 88 pendant trois minutes. Ensuite, à l’aide de micromanipulateurs, positionnez les deux électrodes dans le cerveau.

Orientez-vous en identifiant le lobe de l’antenne et le lobe vertical du corps du champignon. Ici, une électrode se trouve dans le faisceau latéral du lobe de l’antenne, à 180 microns de profondeur, et l’autre dans le faisceau du lobe de l’antenne médian. Inséré à environ 300 microns de profondeur.

Complétez le placement des électrodes en les ancrant à l’aide de deux composants. Le silicium couvre tout l’espace au-dessus du cerveau, ce qui empêchera également les tissus de se dessécher. Ensuite, procédez à la réalisation d’enregistrements pour extraire l’activité unitaire du signal extracellulaire enregistré.

Utilisez le logiciel de tri des pointes disponible. Utilisez les canaux d’électrodes différenciés. Appliquez simultanément des techniques d’appariement de modèles sur les trois canaux d’électrodes pour détecter différentes combinaisons de formes d’onde qui tiennent compte des événements de pic unique.

Et enfin, contrôlez la séparation correcte des unités. Utilisation de l’analyse en composantes principales sur les événements de pic unique des trois canaux d’électrodes différenciés enregistrés. Après avoir fait les enregistrements, retirez soigneusement le silicium et les électrodes de l’abeille.

Ensuite, rincez le cerveau avec une solution de sonnerie d’abeille et retirez les glandes et la trachée. Ensuite, à l’aide d’une micro-pipette, injectez dans le lobe de l’antenne 5 % de microrubis dissous dans une molaire d’acétate de potassium. Cela fournira une étiquette antérograde aux traces du lobe.

À partir de là, effectuez toutes les étapes dans l’obscurité maximale. Rincez à nouveau le cerveau avec des bagues d’abeille, trois fois, et laissez le colorant incuber pendant 30 à 45 minutes. Immobiliser l’abeille en la refroidissant au réfrigérateur.

Ensuite, isolez le cerveau. Fixez le cerveau dans 4 % de para-aldéhyde dans 0,1 molaire PBS pendant la nuit à quatre degrés Celsius et avec une légère agitation. Après avoir rempli les neurones de projection dans le lobe de l’antenne avec un traceur microrubis, une vue de projection de ces neurones a été assemblée à partir d’ortho-coupes le long de l’axe Z.

Le colorant Alexa Hydrocyte 4 88 sur les deux électrodes montre leur insertion au niveau du lobe médial de l’antenne et dans le faisceau latéral du lobe de l’antenne. Une reconstruction 3D des cellules cibles colorées et des sites d’insertion des électrodes a été utilisée pour réaliser un schéma des trajectoires des deux lobes d’antenne, l’enregistrement simultané des deux lobes d’antenne tout en stimulant l’abeille avec différentes concentrations d’odeurs a été utilisé pour étudier le traitement temporel. L’activité a été évaluée aux étapes de traitement subséquentes.

L’analyse des neurones de projection du lobe de l’antenne et de l’analyse des composantes principales des neurones extrinsèques des vecteurs de population montre que l’odeur dans les neurones de projection a été prolongée et a survécu au stimulus. En revanche, dans la population de neurones extrinsèques, seuls les types odor on et odor off étaient représentés. Ainsi, dans l’observation de l’activité avec le temps, la population de neurones extrinsèques à droite montre une activité de séparation des odeurs légèrement avant que la population de neurones de projection ne commence à développer son activité induite par les odeurs.

La stimulation des odeurs est marquée en gris. Une fois maîtrisée, il faut environ 30 minutes pour construire une électrode. La préparation de l’abeille et l’insertion des électrodes dans les régions cibles peuvent être effectuées en une demi-heure supplémentaire si elles sont effectuées correctement.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler que chaque étape demande beaucoup de pratique et de patience jusqu’à ce qu’elle soit maîtrisée. Soyez particulièrement prudent lorsque vous montez les fils d’électrodes vers leurs points de connexion et enregistrez à partir de la portée du cerveau souhaitée. Il a exigé une solide connaissance de l’anatomie du cerveau des abeilles après son développement.

Cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la neuropathologie et de l’olfaction des insectes d’explorer les relations temporelles précises entre l’activité de différentes voies neuronales et les centres cérébraux chez les abeilles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la construction et de l’utilisation d’électrodes à microfils multicanaux pour enregistrer simultanément à partir de deux régions du cerveau et du comportement des abeilles. Vous devriez également être en mesure de visualiser l’emplacement exact de vos électrodes d’enregistrement.