Name: Imagerie en direct de Drosophila larves Neuroblastes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Découvrez l'imagerie en direct des neuroblastes de larves Drosophila pour étudier les divisions asymétriques des cellules souches neuronales. Cette méthode combine dissection microscopique et microscopie confocale à disque tournant.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été soutenu par la division de la recherche intra-muros au National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) et un Lenfant biomédicale postdoctorale attribués à DAL.

1. Préparation du matériel requis pour explant Brains troisième stade larvaire <ol><li> Préparer les outils nécessaires pour microdissection. <ol><li> Forge deux outils de dissection (un scalpel et un crochet) en plaçant d&#39;abord un axe de dissection unique dans chaque support de broche. Garantir les broches étroitement main et l&#39;aide de pinces (La figure 1C). </li><li> Utilisez une paire de vieilles pinces à plier une broche de dissection à un angle d&#39;environ 120 °. Pour ce faire, sous un microscope à dissection pour s&#39;assurer que la moitié supérieure de la broche à plat lorsque le support de broche est tenu dans la main. Cet outil sera utilisé comme un scalpel de maintenir enfoncée ou couper à travers le tissu. </li><li> Utilisez une paire de vieilles pinces à plier la seconde broche en forme de crochet qui sera utilisé pour contenir et gratter les tissus. </li><li> Couvrir chaque outil de dissection avec une pointe de pipette pour protéger les outils de dommages. Avec des soins, des outils bien formés peuvent être utilisés pour la dissection indéfiniment. Remplacer les broches endommagées ou déformées si nécessaire. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Préparer dissection moyen. <ol><li> Dans une hotte de culture tissulaire, diluer le supplément de l&#39;antibiotique antifongique dans le milieu de culture de Schneider. Agiter les médias à intégrer le supplément. </li><li> Préparer plusieurs aliquotes de 5 ml des milieux supplémentés. Conservez tous les médias à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Réchauffer une portion aliquote de 5 ml de milieu additionné à température ambiante. Tracer le milieu dans une seringue stérile de 5 ml et le visser sur un filtre à seringue de 0,2 um stérile. </li></ol></li><li> Sélectionnez larves pour la dissection. Utiliser une sonde de dissection pour sélectionner ramper troisième stade larvaire que le cerveau sera plus facile à disséquer. En option: le dépôt des larves sur une plaque de gélose de raisin. Note: Ne pas utiliser les flacons ou bouteilles trop bondés avec &quot;la nourriture humide», comme ils ont tendance à forcer deuxième ou larves de premier stade de ramper prématurément. Remarque: Certains milieux génétiques nécessiteront l&#39;aide de jeunes larves. Cela n&#39;affecte pas le protocole, mais ne fait la dissection plus difficile. </li></ol> 2. Dissection du système nerveux central <ol><li> Sur une lame de verre unique, créer deux piscines de 50 ml de médias de dissection chaudes séparées d&#39;environ 3 cm. Une piscine sera utilisé pour la dissection brut et autres utilisées pour dissection fine (figure 1C). </li><li> Transférer plusieurs larves à l&#39;une des gouttes de médias. </li><li> Déplacer la lamelle couvre-objet avec des larves d&#39;un microscope à dissection. Faire un zoom dans la piscine contenant des larves de telle sorte que les extrémités antérieure et postérieure des larves sont discernables. </li><li> Utilisez une paires de pinces pour saisir la mi-région d&#39;une seule larve. Prenez une seconde paire de pinces dans l&#39;autre main et saisir la larve près de la même région. Tirez sur les deux paires de pinces à part pour le déchirer doucement la larve de moitié. Répétez les deux étapes précédentes pour toutes les larves sur la lamelle. </li><li> Éliminer les moitiés postérieures du corps des larves en les transférant à un tissu. </li><li> Zoomez sur une larve de sorte que ee antérieures mouthhooks sont clairement visibles. Utiliser les deux paires de pinces pour créer une petite incision ou encoche, sur des côtés opposés des larves mouthhooks entre la troisième et la première thoracique bandes de denticle antérieures. </li><li> Saisissez les mouthhooks avec la pince dans la main non dominante. Utilisez la pince dans l&#39;autre main pour éplucher doucement cuticule dans une direction antérieure à postérieure. Continuer à peler lentement cuticule jusqu&#39;à ce que le système nerveux central est exposé. </li><li> Isoler le système nerveux central du reste de la larve par déchirement des tissus avec la pince. Faites attention de ne pas perturber le système nerveux central. Étape critique: Ne pas tirer sur le système nerveux central! Jeter échantillons endommagés par un cordon déchiré ventral de nerf (figure 2A) ou lobes optiques déformées (figures 2B et 2B). </li><li> Répétez les deux étapes précédentes pour toutes les larves sur la lamelle. Transférer le tissu sain explantée à ladeuxième (propre) Piscine de milieu sur la lamelle pour la phase de dissection amende. </li><li> Utilisez les outils de broches de dissection pour déblayer les tissus périphériques (par exemple, les yeux, les ailes et les jambes disques) du cerveau. Faites glisser le scalpel entre le voulu (cerveau) et le tissu non désirée, épinglant le tissu conjonctif de la lamelle. Utilisez le crochet pour taquiner doucement le tissu indésirable tout en appuyant sur le scalpel à la lamelle dans les mouvements de scie, etc. </li><li> Étape cruciale: Travaillez lentement et délibérément de supprimer tous les disques de chaque cerveau. Faites attention de ne pas perturber la morphologie du cerveau. Un cerveau sain aura un cordon intact ventrale de nerf et symétrique, lobes optiques rondes (figure 2C). </li></ol> 3. Montage Brains explantées pour l&#39;imagerie en direct <ol><li> Inverser une boîte de culture de 50 mm perméable au gaz avec le film transparent vers le haut (figure 2D). Appuyer sur la seringue pour déposer une petite goutte (environ 30 pi) de support sur til centre de l&#39;assiette. </li><li> Transférer les cerveaux isolés, un à la fois, à la goutte de milieu sur le plat. Utilisez l&#39;outil de crochet pour ramasser un cerveau sous les lobes optiques. Vous pouvez également utiliser une pince pour saisir axones de la corde nerveuse ventrale. </li><li> Recueillir 5-10 cerveau dans la goutte de milieu. Immerger les cerveaux en utilisant les outils de broches de dissection pour pousser le cerveau des individus à la partie inférieure de la goutte de milieu en tant que nombre d&#39;entre eux seront piégés au niveau du ménisque (figure 2E). </li><li> Orientez le cerveau en utilisant les outils de broches de dissection d&#39;aligner cerveau en fonction de la notifiés à imager (figure 3A). À l&#39;image de la NBs dorsale, placez la corde nerveuse ventrale vers le bas (le long de la membrane). À l&#39;image de la BNS de antéro-ventral, placent le cerveau avec la corde nerveuse ventrale vers le haut (loin de la membrane). Aligner les cerveaux de telle sorte que tous les cordons nerveux ventraux pointent dans la même direction dans le plan xy. </li><li> Utiliser une seringue ou en plastique transfert pipette de placer 4 halocarbures (HC) des gouttes d&#39;huile (environ 30 pi de chacun) sur la membrane perméable aux gaz. Le volume de chaque goutte d&#39;huile doit être équivalente à l&#39;autre et à la goutte de milieu. L&#39;espace des gouttes d&#39;huile de correspondent aux quatre coins d&#39;une lamelle couvre-objet centré autour de la goutte de milieu de culture. Une fois terminé, les cinq gouttes (quatre gouttes d&#39;huile et une goutte de milieu dans le centre) ressembleront les cinq facettes sur de style occidental dés (figure 3B). </li><li> Abaisser une lamelle # 1,5 mm 22 sur l&#39;assemblage de telle sorte qu&#39;il frappe l&#39;ensemble des cinq gouttes en même temps. Le maintien d&#39;une pression, même à travers les échantillons réduit la probabilité qu&#39;ils seront perturbés. Attendre environ 3 minutes, comme de l&#39;huile et de milieu de dispersion sous le poids de la lamelle. Une forme de croix de médias se former (figures 3C et 3D). </li><li> Étape cruciale: Abaisser la lamelle sur la surface du cerveau en enlevant l&#39;excès médias utilisant une mèche de papier tissu (Figure 3C). Pour ce faire, tout en regardant l&#39;échantillon sous le microscope à dissection. Comme les médias est enlevé, la lamelle sera inférieur. Arrêtez une fois la lamelle touche le cerveau. Ne pas trop mèche au risque de provoquer de distorsion du tissu ou du cerveau explosions. </li><li> Si l&#39;imagerie dorsale notifiés (figure 3F), passez à l&#39;étape 3.9. Si imagerie NBs de antéro-ventrale, la lamelle doit être légèrement déplacé (en poussant doucement avec une pince) dans le sens des conseils nerf de la moelle ventrale. Cela provoque le cerveau à tourner, ce qui amène les lobes du cerveau en contact direct avec la lamelle couvre-objet pour faciliter la formation d&#39;image (figure 3F). </li><li> Sceller la chambre en entourant la lamelle couvre-objet avec de petites quantités d&#39;huile d&#39;hydrocarbure halogéné (Figure 3D). L&#39;excès d&#39;huile qui suinte de la lamelle doit être minimisée et effacé loin avec un tissu. </li></ol> 4. Imagerie en direct de Central Neuroblastes cerveau Note: Pour ce travail, un disque tournant Nikon Eclipse TiMicroscope confocal (microscope inversé) a été utilisée pour l&#39;imagerie en temps réel; détails de notre installation ont déjà été publiés 31. En variante, l&#39;échantillon peut être imagé en utilisant un système à la verticale. <ol><li> Ajouter une goutte d&#39;huile d&#39;immersion à la lamelle juste au-dessus des cerveaux montés. Cela vous aidera à centrer l&#39;objectif directement au-dessus de l&#39;échantillon. </li><li> Étape cruciale: Maintenir cerveau à une température constante de 25 ° C avec un incubateur d&#39;étape. Positionnez délicatement l&#39;échantillon monté dans l&#39;incubateur de la scène et couvrir la chambre avec son couvercle. </li><li> Localiser NBs centrales du cerveau en utilisant la lumière transmise en se concentrant sur ​​les grandes cellules rondes qui résident dans les zones centrales et médiales des lobes optiques, ne pas utiliser épi-fluorescence. Cela devient plus facile avec la pratique. Il est très important d&#39;exposer l&#39;échantillon à la moindre quantité de lumière que possible. Ne perdez pas de cerveau d&#39;imagerie de temps qui sont endommagés. </li><li> Une fois en place, prendre des positions rapides utilisant le confocale àdéterminer l&#39;emplacement et la profondeur adéquate. Limiter la profondeur à la première 10-15 um. Ajustez au besoin, et prendre une autre image de test. <ol><li> Étape facultative: Recueillir un film d&#39;essai de la corde nerveuse ventrale pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de dérive de xy. Si la dérive est détectée, attendre 15-30 minutes pour l&#39;échantillon à régler. Si la dérive ne s&#39;installe pas en 30 min, préparer un nouvel échantillon. Dérive majeure peut généralement être retracée à l&#39;ajout de l&#39;excès d&#39;huile, ou la taille inégale des gouttes d&#39;huile pendant le montage. </li></ol></li><li> Pour éliminer la dérive axiale (z-dérive) utiliser un dispositif de focalisation automatique en continu qui utilise une LED infrarouge. Sinon, corriger manuellement le plan focal. </li><li> Une fois NB d&#39;intérêt est identifiée, procéder à l&#39;imagerie régime. Comme avec tous imagerie des cellules vivantes, la quantité de lumière laser, temps d&#39;exposition, la caméra binning, grossissement de l&#39;objectif, du temps et / ou l&#39;intervalle z étapes doivent toutes être empiriquement optimisé pour une expérience particulière pour répondre à la question à portée de main. L&#39;objectif est de minimiser barrage lumièretandis que de l&#39;âge encore la collecte de données utiles. Voir la discussion pour des informations supplémentaires. <ol><li> L&#39;image de la totalité du volume du NB 12-14 en recueillant des images espacées de 1 um dans l&#39;axe z. Réglez la résolution de temps pour capturer cycles cellulaires simples ou multiples de la même NB. En règle générale, utiliser 10-30 seconde d&#39;intervalle pour l&#39;imagerie du cycle cellulaire unique et 1-3 minutes d&#39;intervalle pour les cycles cellulaires multiples. </li></ol></li><li> Étape cruciale: Assurez-vous que l&#39;échantillon est sain en contrôlant la durée de la mitose. Si la mitose prend plus de 15 minutes, passer à un autre cerveau. Un cerveau sain montrera de nombreux organismes notifiés dans le même champ de vue de subir plusieurs cycles de mitose. A noter que chaque cycle cellulaire est légèrement plus long que le précédent en raison de dommages de la lumière. </li><li> Une fois l&#39;imagerie terminée, démonter la chambre d&#39;incubation, et jetez tout mais les plats de culture perméables aux gaz. Rincer la surface de la boîte de culture avec 95% d&#39;éthanol et essuyez bien avec un tissu. Répéter deux autres fois. </li&gt; </ol> 5. Préparation de Brains pour immunofluorescence <ol><li> Recueillir 20 ou plus expiantes cerveau dans un tube de 1,5 ml, contenant environ 0,2 ml de milieu supplémenté. </li><li> Éliminer le milieu du tube et rincer une fois avec de cerveaux 0,5 ml PBSTx (Phosphate Buffered Saline, PBS, avec 0,3% de Triton X-100). Laissez cerveaux se déposent au fond du tube entre tous les échanges de liquide. Le détergent Triton X-100 est utilisé pour perméabiliser les tissus. Rinçage prend généralement moins de 30 secondes; il suffit de retirer le PBSTx fois cerveaux se sont installés au fond du tube. </li><li> Remplacer la solution avec 0,5 ml de paraformaldehyde à 9% d&#39;électrons à niveau de la microscopie dilué dans PBSTx. Incuber avec nutation pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Disposer de fixateur conformément à la réglementation sur les déchets dangereux. </li><li> Laver les échantillons par 0,5 ml PBSTx pendant 15 min. Répétez l&#39;étape de lavage avec PBSTx frais deux fois de plus. </li><li> Remplacer la solution avec 0,5 ml PBT (PBS, 1% Albumine de sérum bovin (BSA) et 0,1% de Tween-20). Incuber avec nutation pendant 1 heure à température ambiante. Cette blocs de l&#39;étape de liaison non spécifique de l&#39;anticorps au tissu. </li><li> Remplacer la solution avec 0,5 ml anticorps primaire dilué dans PBT complété avec 4% de sérum de chèvre normal (NGS). Incuber avec nutation pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Jeter ou mettre l&#39;anticorps primaire dilué. </li><li> Laver les échantillons par 0,5 ml PBT pendant 15 min. Répétez l&#39;étape de lavage avec PBT frais deux fois de plus. </li><li> Remplacer la solution avec 0,5 ml de modification PBT (PBS, BSA 2%, 0,1% de Tween-20, et 4% NGS). Incuber avec nutation pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Remplacer la solution avec 0,5 ml anticorps secondaire dilué en PBT modifié. Incuber avec nutation pendant 2 h à température ambiante. </li><li> Remplacer la solution avec 0,5 ml de PBST (PBS avec 0,1% de Tween-20). Incuber avec nutation pendant 15 min à température ambiante. Répétez l&#39;étape de lavage au PBS frais deux fois de plus. </li></ol><ol><li> Transférer soigneusement les échantillons comme une goutte sur une lame de verre, ce qui limite la chute vers la gauche du centre de la diapositive. </li><li> Ajouter une baisse importante (environ 2 cm de diamètre) de milieu de montage (par exemple, Aqua-Poly/Mount) au centre de la diapositive. Évitez la piscine de PBST qui est vers la gauche. </li><li> Utilisez une pince à transférer les cerveaux de la piscine de PBST à la piscine de milieu de montage. Ajout de milieu de montage directement sur le cerveau peut perturber leur orientation et doit être évitée. </li><li> Sous un microscope optique, organiser les échantillons dans le milieu de montage avec le côté qui sera imagé vers le haut. </li><li> Avec la lame sous le microscope optique, abaissez lentement une lamelle de verre # 1.5 sur le dessus des échantillons. Étape facultative: Déloger les bulles d&#39;air mineures en poussant légèrement sur la lamelle. </li><li> Laisser le milieu de montage à polymériser pendant plusieurs heures, ou toute la nuit, par le mensonge diapositives plat, la lumièreprotégé, à la température ambiante. </li><li> Les lames peuvent être imagé le lendemain, ou stocké avant l&#39;imagerie. </li></ol>

<ol><li>Truman, J. W., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+patterns+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).</li>
<li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+markers+for+identified+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells+in+the+Drosophila+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system.</a> Development. 116, 855-863 (1992).</li>
<li>Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+asymmetry+for+proper+fitness%2C+function%2C+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research%22%5BJournal%5D)">Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate.</a> Chromosome research. 21, 271-286 (2013).</li>
<li>Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+neural+stem+cell+proliferation+by+intermediate+progenitor+cells+in+Drosophila+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+development%22%5BJournal%5D)">Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development.</a> Neural development. 3, 5 (2008).</li>
<li>Bowman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+suppressors+Brat+and+Numb+regulate+transit-amplifying+neuroblast+lineages+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila.</a> Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).</li>
<li>Boone, J. Q., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Drosophila+type+II+neuroblast+lineages+containing+transit+amplifying+ganglion+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells.</a> Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li>
<li>Savoian, M. S., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+primary+cultures+of+Drosophila+melanogaster+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts.</a> Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).</li>
<li>Fleming, S. L., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flattening+Drosophila+cells+for+high-resolution+light+microscopic+studies+of+mitosis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).</li>
<li>Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+Mad2+to+the+kinetochore+requires+the+Rod%2FZw10+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%22%5BJournal%5D)">Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex.</a> Current biology. 15, 856-861 (2005).</li>
<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+without+centrioles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flies without centrioles.</a> Cell. 125, 1375-1386 (2006).</li>
<li>Lucas, E. P., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+the+proper+connection+between+the+centrioles+and+the+pericentriolar+matrix+requires+Drosophila+centrosomin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin.</a> J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).</li>
<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+amplification+can+initiate+tumorigenesis+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies.</a> Cell. 133, 1032-1042 (2008).</li>
<li>Conduit, P. T., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cnn+dynamics+drive+centrosome+size+asymmetry+to+ensure+daughter+centriole+retention+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome research. 6, 533-549 (1998).</li>
<li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells.</a> Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).</li>
<li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nat. Commun. 2, 243 (2011).</li>
<li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrobin+controls+mother-daughter+centriole+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).</li>
<li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Live+Cell+Imaging+and+Automated+4D+Analysis+of+Drosophila+Neuroblast+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Neumuller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells+by+transgenic+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi.</a> Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Siegrist, S. E., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+cues+orient+the+cell+division+axis+in+Drosophila+embryonic+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts.</a> Development. 133, 529-536 (2006).</li>
<li>Broadus, J., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+cues%2C+intrinsic+cues+and+microfilaments+regulate+asymmetric+protein+localization+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).</li>
<li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila%3A+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125, 2149-2158 (1998).</li>
<li>Siller, K. H., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lis1%2Fdynactin+regulates+metaphase+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical%2Fbasal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).</li>
<li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li>
<li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+the+model+to+the+test%3A+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity%2C+axon+outgrowth%2C+and+axon+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li>
<li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li>
<li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li>
<li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia%2Fflagella+function%2C+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li>
<li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole%2C+but+is+dispensable+for+centriole+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li>
<li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li>
<li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Imagerie des cellules vivantes est une approche précieuse utilisée pour étudier les mécanismes qui régulent ACD de cellules souches, la différenciation des lignées cellulaires, et la morphogenèse des tissus complexes. Bien que les groupes de recherche ont toujours utilisé une variété de techniques pour visualiser NB ACD, ces approches peuvent généralement être regroupés en deux catégories qui diffèrent principalement quant à savoir si le tissu cérébral est laissé intact ou dissocié. Imagerie...

Les cellules souches de maintenir un équilibre de la différenciation et de l&#39;auto-renouvellement pour générer la diversité cellulaire au cours du développement précoce et remplacer les cellules endommagées dans les tissus adultes. Le règlement de cette homéostasie empêche à la fois la perte et la sur-expansion de la population de cellules souches, ce qui peut entraîner une dégénérescence tissulaire néfaste ou la tumorigenèse. Neuroblastes (NBS) sont les cellules souches neurales largement étudiés du système nerveux central chez la drosophile (figure 1A) que première forme embryonnaire pendant 1, 2. NBs subissent des cycles répétés de la division cellulaire asymétrique (ACD) pour produire deux cellules inégalement malheureuse: une cellule souche auto-renouvellement et une cellule de différenciation. ACD est guidé par centrosomes, les organites non-membraneux qui agissent comme des centres microtubules organisation de la plupart des cellules 3. Au cours de la mitose, centrosomes NB organisent et orientent le fuseau mitotique bipolaire long de la polaire apicale-basaleaxe lité. Lors du clivage de la division NB, les déterminants du devenir apical qui spécifient le destin des cellules souches, et les déterminants du devenir basales qui spécifient la différenciation, sont séparés dans les cellules filles inégales. Dans le cerveau des larves central, deux types de NBs peuvent être distingués par leur nombre, la position, l&#39;expression du facteur de transcription, et la lignée cellulaire (figure 1A) 6.4. Type I ON sont les plus abondants, et environ 90 d&#39;entre eux peuplent les côtés antérieur et postérieur de chaque lobe optique du cerveau 7. Ces organismes notifiés expriment le facteur de transcription Asense (Ase), et ils se divisent caractéristique dans un auto-renouvellement NB et un plus petit ganglion cellule mère (GMC, figure 1B). Chaque GMC subit une seule division borne à générer deux neurones ou des cellules gliales (figure 1B). En revanche, les organismes notifiés huit de type II qui peuplent la face postérieure de chaque lobe optique manquent Ase expression 5. Ils subissent ACDpour produire une auto-renouvellement NB et un progéniteur neural intermédiaire (INP). Le INP, à son tour, se divise de manière asymétrique trois à cinq fois. Chacun de ces résultats des divisions dans la régénération de l&#39;INP et la production d&#39;un seul GMC 4. Collectivement, l&#39;identité spécifique NB et l&#39;ordre temporel de naissance GMC donne lieu à la diversité étonnante de neurones du système nerveux central adulte. Compréhension de la biologie cellulaire qui sous-tend NB ACD a été grandement améliorée par l&#39;utilisation de techniques d&#39;imagerie des cellules. Protocoles publiés utilisées par les chercheurs à l&#39;image NBs vivants varient considérablement. Dans l&#39;ensemble, cependant, ces méthodes peuvent être regroupées en deux catégories générales se distinguent par le fait que le cerveau larvaire est laissé intact ou mécaniquement dissocié. Les deux techniques ont des avantages et des inconvénients distincts en fonction de la demande du chercheur. Les premiers rapports révélant en direct division cellulaire NBsions impliquent un certain degré de dissociation manuel du cerveau larvaire. Ces protocoles détail bavures 8 ou 9 taquiner à part le cerveau afin de développer des cultures primaires à court terme de la BNS sur des lamelles de verre. Pour améliorer l&#39;imagerie, les organismes notifiés rondes sont généralement aplatis sur les lamelles soit avec des lames de verre 8 ou 9 pads agarose. Bien que les cellules aplaties ont amélioré l&#39;optique, ces techniques entraînent souvent des défauts NB mitotiques, y compris la régression du sillon de clivage et l&#39;incapacité à diviser plus d&#39;une fois. Par conséquent, les protocoles qui impliquent à la fois manuel et la distorsion dissociation physique du tissu cérébral larves ne sont généralement adaptés à court terme (c.-à-., Un cycle cellulaire ou moins) très applications. De même, semi-écrasement ou aplatissement complètement cerveaux intacts entre des lames de verre et des lamelles limite le temps on peut passer imagerie un échantillon donné, à une période d&#39;environ 30 min 10. Malgré cette limitation, this approche a été utilisée avec succès 11-14. Les efforts récents de l&#39;image en direct dissociés limite NBs distorsion physique des cellules isolées. Ces techniques sont particulièrement utiles pour des applications où il est nécessaire de maintenir des cultures de cellules pour plusieurs cycles de division cellulaire. Par exemple, les cellules dispersées dans des cerveaux dissociées manuellement peuvent être partiellement noyés dans un caillot fabriqué à partir du mélange de fibrinogène et de la thrombine 15 pour l&#39;imagerie à long terme 16. En variante, les cerveaux explantées peuvent être dissociées premier chimiquement avec l&#39;enzyme collagénase, la prochaine perturbation manuellement par passage répété à travers un embout de pipette, et ensuite étalées sur des boîtes de poly-L-lysine à fond de verre 17, 18. Revêtement plats en verre avec soit fibrinogène ou poly-L-lysine favorise l&#39;attachement et légère propagation des cellules rondes, leur apportant le plus près de la lamelle possible sans distorsion majeure physique. En additisur, ces méthodes impliquent la culture de la notifiés dans un milieu qui peut être facilement échangé des expériences de perturbation pharmacologiques 18. Dans l&#39;ensemble, le placage directement dispersé NBs améliore optique d&#39;imagerie sans sacrifier les capacités d&#39;imagerie à long terme. Récemment, un protocole décrivant la culture à long terme des organismes notifiés dissocié a été détaillé 19. Cependant, cette approche n&#39;est pas sans limites. Il ya plusieurs mises en garde à l&#39;imagerie NBs direct dissociées. Dans un champ de cellules dispersées, par exemple, il est difficile d&#39;identifier des lignées de NB spécifiques qui sont organisées spatialement dans le cerveau intact 1. De même, la distinction du type I par rapport type II notifiés dans le tissu dissocié est également difficile sans l&#39;expression de marqueurs de la lignée ou transgènes spécifiques des sous-types, tels que worniu-GAL4, GAL80 aSENSE-20. Bien que ces transgènes sont très utiles pour certaines applications, ils ne limitent les chercheurs à ceux transgènes expressé sous le contrôle de l&#39;élément UAS d&#39;activateur 21 et nécessitent des systèmes génétiques complexes. Les études qui concernent la mise au point spatial ou temporel du NB, par conséquent, nécessitent l&#39;imagerie in vivo dans le cadre d&#39;un tissu intact. En outre, des études sur les ON embryonnaires dissociées indiquent que le contact physique de cellules adjacentes est critique pour la localisation d&#39;interphase de polarité clé Déterminants 22, 23. Ces études montrent complètement isolé NBs plus maintenir l&#39;axe de fuseau mitotique invariant. Au lieu de cela, ces cellules présentent un axe de broche plus aléatoires et de larges angles de séparation entre les bourgeons GMC successives, peut-être en raison de la perte de positionnement du centrosome apicale 22. Bien que la relation entre les organismes notifiés larves et leurs cellules voisines n&#39;a pas été étudié, il est intéressant de considérer que le microenvironnement des cellules souches larvaire peut empiéter sur la polarité cellulaire ou autrecomportements. Pour maintenir le contexte physiologique des larves de NB, nous l&#39;image ACD à partir de cerveaux entiers. Compte tenu des limites inhérentes à l&#39;imagerie dissocié NB, notre laboratoire et d&#39;autres ont établi des protocoles à l&#39;image des cycles successifs de NB ACD du cerveau larves entières. Les techniques à l&#39;image cerveaux intacts remplacent souvent la surface de verre rigide d&#39;un côté de la chambre de culture avec une membrane flexible pour empêcher la déformation ou endommagement des tissus et pour permettre l&#39;échange de gaz. Certains procédés impliquent le montage cerveaux explantées dans un mélange de milieu de culture d&#39;insecte, le sérum, et l&#39;acide ascorbique avec les corps gras isolés à partir de dix larves 24. Les corps gras isolées sont ajoutés parce qu&#39;ils sécrètent un mitogène connu pour stimuler la division cellulaire NB 25. Ce protocole préserve l&#39;intégrité du tissu pendant plus de 3 heures et est, par conséquent, se prêtent à l&#39;imagerie à long terme 24, 26-28. Récemment, un protocole décrivant la lonimagerie g terme de cerveaux larves intactes en présence de l&#39;acide ascorbique, le sérum et corps gras a été détaillé 29. Il est important, parce que le tissu n&#39;est ni exposé ni immobilisé, cette approche est moins utile pour des applications où milieu de culture est échangé (par exemple, des études de médicaments, immunodéplétion, etc.). Notre laboratoire a simplifié l&#39;ensemble de la préparation de montage de cerveaux de larves vivantes pour l&#39;imagerie à long terme 30, 31. Le principal avantage de notre protocole sur les autres est sa simplicité: nos observations indiquent ni sérum, l&#39;acide ascorbique, de l&#39;insuline, ni corps gras sont les additifs nécessaires à l&#39;image des cycles successifs de NB ACD. Bien que des additifs tels que l&#39;insuline, ont été utiles pour l&#39;imagerie prolongée de divisions de cellules souches 32 et migration collective de cellules dans les ovaires chez la drosophile 33, ils semblent être indispensables pour NB ACD, comme notre moyen d&#39;imagerie consiste en un simple mélange de standard insecte milieu de culture cellulaire supplémenté avec l&#39;antibiotique-antimycosique pour éviter la contamination. Grâce à l&#39;utilisation de plats gaz-perméables ou en verre réutilisables culture sur le fond, nous avons été en mesure de soutenir plusieurs séries de successives NB ACD. Les mêmes échantillons expiantes peuvent facilement être utilisés pour l&#39;immunofluorescence et d&#39;autres procédures avec tissu fixé. Dans ce protocole, nous détaillons la dissection des cerveaux de larves intactes, ainsi que la préparation des cerveaux pour analyse à la fois en direct et fixe.

<table><tbody><tr><td>Boîte de culture tissulaire Lumox 50 x 12 mm</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.410</td><td>Une boîte de culture réutilisable avec une base de film perméable aux gaz et optiquement transparente.</td></tr><tr><td>Schneider’s S2 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antibiotique-Antimycosique (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Un supplément contenant de la pénicilline (10 000 U/ml), de la streptomycine (10 000 &#956 ; g/ml) et l’amphotéricine B (25 &#956 ; g/ml) qui est ajouté au milieu S2 de Schneider pour prévenir la contamination bactérienne et fongique.</td></tr><tr><td>Lamelles de protection en verre, #1.5 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Huile halocarbonée 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>Une huile inerte à haute viscosité, claire et incolore.</td></tr><tr><td>Paire de porte-goupilles nickelés, 17 cm de long</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Paire de pinces Dumont #5</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille/sonde de dissection avec poignée en plastique</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965-A</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue, 0,22 &#956 ; taille des pores</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Seringue, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert en plastique</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, 32 % de qualité EM</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15714</td><td>ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique ; il doit être manipulé dans une hotte. Suivez les directives de la fiche signalétique pour une manipulation en toute sécurité.</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Un colorant qui marque l’ADN et est excité par la lumière UV.</td></tr></tbody></table>

imagerie en direct de<em&gt; drosophila</em&gt; larves neuroblastes

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Les cellules souches se divisent de façon asymétrique pour générer deux cellules filles ayant un potentiel de sort inégal: une cellule souche auto-renouvellement et de différenciation d&#39;une cellule. Compte tenu de leur importance pour le développement et la maladie, la compréhension des mécanismes qui régissent la division des cellules souches asymétrique a été une zone robuste d&#39;étude. Parce qu&#39;ils sont génétiquement docile et soumis à des cycles successifs de la division cellulaire environ une fois toutes les heures, les cellules souches du système nerveux central chez la drosophile, ou neuroblastes, sont des modèles indispensables pour l&#39;étude de la division des cellules souches. Environ 100 cellules souches neurales sont situés près de la surface de chacun des deux lobes du cerveau des larves, ce qui rend ce système modèle particulièrement utile pour des études de microscopie d&#39;imagerie en temps réel. Dans ce travail, nous passons en revue plusieurs approches couramment utilisées pour visualiser les divisions de cellules souches, et nous abordons les avantages et les inconvénients de ces techniques qui emploient indissociables contre tissus cérébraux intacts. Nous avons également en détail notre simplified protocole utilisé pour explantation cerveaux entiers de troisième stade larvaire pour l&#39;imagerie des cellules vivantes et des applications d&#39;analyse fixes.

Imagerie en temps réel a élucidé un certain nombre de mécanismes qui régulent NB ACD. Avant l&#39;acquisition des images, il est nécessaire de déterminer les conditions optimales d&#39;imagerie. Il est nécessaire d&#39;équilibrer le taux de capture d&#39;image avec la durée d&#39;imagerie des cellules vivantes. Pour l&#39;analyse cellulaire fine, par exemple, a augmenté temporelle et la résolution optique peut être nécessaire. Quand la visualisation d&#39;un cycle cellulaire NB unique (figure 4A), la vi...

Ce protocole détaille une méthode simplifiée utilisée pour effectuer l&#39;imagerie des cellules vivantes dans le cadre d&#39;un cerveau intact larvaire. Approches d&#39;imagerie des cellules vivantes sont très précieux pour l&#39;étude des divisions de cellules souches neurales asymétriques ainsi que d&#39;autres processus neurogène et de développement, les mécanismes qui ont été précédemment négligés découvrant constamment.

Imagerie en direct de<em&gt; Drosophila</em&gt; larves Neuroblastes

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

L'objectif général de cette procédure est de détailler la dissection du SNC intact provenant de larves de troisième stade larvaire d'oph. Afin d'étudier les divisions asymétriques des cellules souches, la différenciation cellulaire et la morphogenèse. Cela est réalisé en extrayant d'abord le SNC du corps larvaire par une dissection macroscopique.La deuxième étape consiste à isoler le cerveau intact des tissus périphériques par microdissection fine à l'aide d'outils sur mesure. Ensuite, les cerveaux sains sont soit montés pour l'imagerie de cellules vivantes, soit soumis à une fixation chimique et à une immunofluorescence ; finalement, une microscopie confocale à disque tournant est utilisée pour visualiser les événements régissant les divisions des cellules souches neurales et fournir des éclairages mécanistiques sur le développement du système nerveux central. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la cancérologie des cellules souches et du développement neural.En contribuant à notre compréhension de la régulation de la prolifération des cellules souches, nous savons que la division des cellules souches ABER est associée à la tumorigenèse et

live-imaging-of-drosophila-larval-neuroblasts

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Nous décrivons ici un protocole visant à étudier la migration des cellules gliales dans le développement de l'œil de drosophile en utilisant l'analyse microscopique direct couplé à la GFP taggés cellules gliales.

Imagerie de la migration en direct des cellules gliales dans le disque Eye drosophile Imaginal

Hémocytes drosophile se dispersent sur ​​l'ensemble de l'embryon en développement. Ce protocole démontre comment monter et à l'image de ces migrations à partir d'embryons avec les hémocytes marqués par fluorescence.

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Nous présentons ici un protocole de montage pour...

Imagerie verticale de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Source : Hellerman, M. B., et al. Imagerie en direct de l’œil de la drosophile nymphale. J. Vis. Exp. (2015)La vidéo montre une technique d’imagerie en direct pour étudier les motifs oculaires d’une chrysalide de Drosophila melanogaster. Les marqueurs marqués à la protéine fluorescente verte (GFP) permettent de visualiser l’organisation cellulaire et la différenciation pendant la formation de la structure oculaire en développement.

Imagerie en direct de l’œil de la chrysalide de la drosophile à l’aide de la microscopie à fluorescence

Nous décrivons ici une méthode efficace pour étudier la dynamique de la clairance des cellules...

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

Ce protocole décrit comment l'image des cellules en division dans un tissu en Caenorhabditis elegans embryons. Bien que de nombreux protocoles décrivent comment la division cellulaire de l'image dans l'embryon précoce, ce protocole décrit comment l'image de la division cellulaire dans un tissu en développement au cours de l'embryogenèse tardive milieu.

Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenèse

Ce protocole présente une méthode efficace pour l’imagerie du neuroépithélium de l’œil nymphal vivant de la drosophile. Cette méthode compense le mouvement des tissus et la topologie inégale, améliore la visualisation des limites cellulaires grâce à l’utilisation de plusieurs protéines de jonction marquées GFP et utilise un banc d’imagerie facile à assembler.

Live-imagerie de la Drosophila Nymphe yeux

Ce protocole décrit un procédé détaillé pour la culture ex vivo à long terme et de l' imagerie en temps réel d'un disque de Drosophila imagée. Elle démontre la différenciation des photorécepteurs et la rotation ommatidial dans les 10 h de l'imagerie en direct du disque des yeux. Le protocole est simple et ne nécessite pas l'installation coûteuse.

À long terme d&#39;imagerie en direct de<em&gt; drosophile</em&gt; Disc Eye

Ici, nous décrivons la méthode que nous avons employée pour imager la filodose dendritique fortement motivoir dans une préparation en direct du cerveau larvaire de Drosophila, et le protocole que nous avons développé pour quantifier des ensembles de données d'imagerie 3D de time-lapse pour des évaluations quantitatives du dendrite dynamique dans le développement des neurones.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-

Ici, nous discutons d’un flux de travail pour préparer, disséquer, monter et imager des cerveaux d’explants vivants de larves du troisième stade de Drosophila melanogaster afin d’observer la dynamique cellulaire et subcellulaire dans des conditions physiologiques.

Imagerie de cellules vivantes du cerveau larvaire du troisième stade de Drosophila melanogaster

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer une imagerie en direct de la division asymétrique des cellules souches germinales (GSC) dans la niche ovarienne de la drosophile. Nous utilisons une lignée transgénique qui exprime de manière ubiquitaire une fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) de la protéine du spectrosome Par-1.

Imagerie en direct étendue des niches de cellules souches germinales de Drosophila melanogaster femelle

Découvrez l'imagerie en direct des neuroblastes de larves Drosophila pour étudier les divisions asymétriques des cellules souches neuronales. Cette méthode combine dissection microscopique et microscopie confocale à disque tournant.

Imagerie en direct de

Explorer plus de vidéos