Un guide pour In vivo Simple unité d'enregistrement de Optogenetically identifié corticale inhibitrice Interneurones

L’objectif global de l’expérience suivante est d’obtenir des enregistrements unitaires extracellulaires de haute qualité à partir d’interneurones corticaux chez des souris exprimant le canal rootin two. Ceci est réalisé en faisant avancer une électrode d’enregistrement à haute impédance à travers le tissu pour identifier les interneurones à partir des réponses de pointe aux impulsions de lumière bleue. Le signal électrique est surveillé pour détecter les changements qui indiquent la vitesse d’avance appropriée et la probabilité d’obtenir un enregistrement stable et bien isolé.

S’il n’est pas possible d’obtenir une bonne isolation unitaire ou, à l’inverse, si les neurones sensibles à la lumière sont rarement rencontrés, remplacez l’électrode d’enregistrement. Les résultats montrent la fiabilité des réponses de la lumière évoquée à partir de neurones identifiés optiquement et le rapport signal sur bruit typique obtenu avec cette stratégie. L’approche de photostimulation est un moyen accessible et peu coûteux de cibler des types de cellules génétiquement identifiés à l’aide d’un amplificateur extracellulaire standard et de la lumière bleue.

Il s’agit de notre stratégie pour proxénétiser des neurones internes spécifiques dans l’anesthésie du cortex auditif, mais les points les plus généraux s’appliquent à d’autres zones corticales que les types de cellules clairsemées. Une fois que l’animal a été anesthésié avec du cocktail de méine de kétamine par injection intrapéritonéale, placez-le dans un appareil stéréotaxique ou un autre appareil de maintien de la tête, assurez-vous que le crâne est bien fixé. Ceci est essentiel pour maintenir des enregistrements stables sur cellule unique.

Ensuite, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse et maintenez la température corporelle de l’animal à 37 degrés Celsius pour effectuer un drainage sternal CI pour une stabilité d’enregistrement supplémentaire, retirez le tissu du crâne postérieur avec une lame de scalpel pour exposer le sternum magna CI. Faites ensuite une petite entaille dans la Dora avec la pointe de la lame pour drainer le liquide céphalo-rachidien. Maintenant, à l’aide du scalpel, effectuez une petite craniotomie sur la zone corticale d’intérêt.

Après cela, retirez la dure-mère, puis couvrez le cortex exposé avec la couche d’aros chaud. Gardez l’agros humide avec une solution saline. Préparez une électrode de support de langue.

Collez l’électrode sur un tube capillaire en verre avec de la super colle et un accélérateur. Ajoutez ensuite une gaine thermorétractable pour la préhension. Ensuite, montez l’électrode sur un manipulateur micrométrique motorisé ou hydraulique et réglez-la pour qu’elle se déplace orthogonale à la surface corticale.

Glissez un fil de terre sous la peau contre le crâne. Évitez tout contact avec les muscles sur le côté de la tête et à l’arrière du cou car ils peuvent générer des artefacts myographiques. Le signal électrique est amplifié à l’aide d’un amplificateur extracellulaire adapté à l’enregistrement unitaire, de préférence équipé d’un mode de vérification d’impédance.

L’activité de pointe en cours est surveillée à l’aide de deux oscilloscopes et d’un ensemble de haut-parleurs amplifiés. Maintenant, faites avancer l’électrode à travers l’agros et testez son impédance pour vous assurer qu’elle est entre sept et 14 méga ohms. Lorsque la pointe perce la surface du cortex, mettez à zéro cette position sur le manipulateur microm.

Pour mieux estimer la profondeur d’enregistrement, vérifiez visuellement que l’extrémité de l’électrode sort de la surface corticale à une profondeur de zéro. Lors du retrait de l’électrode à la fin d’une pénétration dans le cortex auditif pour s’assurer que cette consigne zéro correspond au niveau du cortex, surveille les potentiels de champ évoqué du stimulus. Tout en faisant avancer l’électrode à travers les premières centaines de micromètres de tissu, confirmez que la polarité du potentiel de champ local s’inverse autour d’une profondeur de 100 micromètres.

Ensuite, montez une fibre optique couplée à une source de lumière bleue sur un micromanipulateur manuel. Régulez la sortie de la source lumineuse avec l’unité de commande capable de délivrer un train d’impulsions TTL de largeur et de durée spécifiées. Ensuite, surveillez le signal sur les deux oscilloscopes.

Mesurez la puissance lumineuse totale à l’extrémité de la fibre optique à l’aide d’un wattmètre. Utilisez cette valeur pour calculer l’irradiance en la divisant par la section transversale du noyau de la fibre. Commencez par une valeur de l’ordre de 10 à 15 milliwatts par millimètre carré.

À l’aide du microscope, positionnez l’extrémité de la fibre aussi près que possible de la surface de l’aros. Centrez le faisceau là où l’électrode entrera dans le tissu. Vérifiez maintenant la présence d’artefacts lumineux avec l’électrode dans l’aros.

Délivrer une tension pulsée. Éliminez tout artefact de lumière transitoire en repositionnant la fibre optique par rapport à l’électrode pour modifier l’angle de la lumière incidente. Si les artefacts persistent, essayez de diminuer la puissance lumineuse.

Ensuite, faites avancer l’électrode lentement dans le cerveau à une vitesse d’environ un micromètre par seconde. Utilisez un oscilloscope pour surveiller l’activité en cours de l’électrode. Utilisez l’autre pour déclencher les impulsions laser.

Écoutez le faible hachage des pointes évoquées par la lumière sur le moniteur audio, qui indique que l’électrode s’approche d’une cellule d’opsine positive de canal. Ralentissez ensuite la vitesse d’avancement dès que la lumière se fait entendre. Les pointes sont suffisamment grandes pour être déclenchées individuellement sur l’oscilloscope.

Commencez à le faire. Ajustez une échelle sur l’axe horizontal pour observer la forme exacte de la forme d’onde du pic. À ce stade, arrêtez de faire avancer l’électrode et attendez qu’elle se dépose dans le tissu.

Ceci est essentiel pour un enregistrement stable. Après plusieurs minutes, si le rapport signal/bruit ne s’est pas amélioré, avancez de cinq micromètres plus loin et attendez. Encore une fois, répétez ce processus jusqu’à ce que le pic ou le creux d’un potentiel d’action puisse être capturé de manière fiable avec un seuil de tension.

Réglez bien au-dessus du bruit de fond pendant l’enregistrement. Surveillez l’activité en cours sur le premier oscilloscope. Dans le même temps, faites attention à la taille et à la forme des pointes à l’aide du deuxième oscilloscope et notez la qualité de leur son sur le haut-parleur.

Écoutez attentivement les changements brusques, qui indiquent que la cellule se rapproche trop de l’électrode ou s’éloigne. Si les pointes deviennent grandes et déformées, retirez l’électrode. S’ils deviennent plus petits, avancez l’électrode.

Déplacez-vous lentement par pas de deux micromètres pour confirmer la qualité des pointes. Superposez toute la forme d’onde de pointe sur une large gamme de valeurs de seuil. Une seule forme de pointe cohérente de hauteur uniforme doit être vue.

La plupart des cellules PV positives peuvent maintenir l’allumage pendant une seconde complète. Si le signal est contaminé par des pointes d’un neurone voisin, avancez l’électrode et cherchez une nouvelle cellule à chaque pénétration, abaissez l’électrode sur toute la profondeur du cortex. Si aucun neurone sensible à la lumière n’est rencontré après de nombreuses pénétrations ou à l’inverse, les enregistrements sont régulièrement contaminés par des pointes du canal voisin, des cellules négatives à l’opsine, essayez une nouvelle électrode.

Cette figure montre des exemples d’enregistrements de trois types d’interneurones identifiés optiquement. Les cellules réagissent au train d’impulsions de recherche par une rafale fiable de pointes. On voit ici des pointes de ligne de 100 tr et la forme d’onde interpolée moyenne.

Ces tracés montrent le moment constant des pics évoqués par la lumière. Les latences du premier pic pour un échantillon de puissance. Les interneurones positifs à Volin sont présentés ici.

L’approche de la photostimulation est très simple sur le plan conceptuel, mais elle peut être étonnamment difficile et à faible rendement. Pratiquement. Les électrodes en verre sont fortement orientées vers les neurones paramétalliques, de sorte que vous n’obtenez pas très souvent des neurones internes.

D’autre part, avec le tétros, vous obtenez beaucoup d’interneurones sensibles à la lumière, mais les pointes sont petites et il y a beaucoup de formes d’onde qui se chevauchent, il est donc très difficile de trier de manière fiable en unités uniques. Nous essayons d’accomplir cela de différentes manières, et pour les neurones internes, nous avons constaté que ces électrodes pointues de 10 à 14 méga-électrodes trouvaient le bon équilibre en termes de rayon d’écoute, qui doit être suffisamment grand pour détecter la lumière des pointes de chêne à distance, mais suffisamment restreint pour obtenir une bonne isolation unitaire. Il y a cependant un peu de vaudou.

Si vous n’y parvenez pas, vous gagnerez beaucoup de temps en abandonnant simplement cette électrode et en passant à la suivante jusqu’à ce que vous en trouviez une qui fonctionne.