Modélisation astrocytome pathogenèse In Vitro Et In Vivo Utilisation corticale astrocytes ou cellules souches neurales à partir de, souris génétiquement modifiées conditionnelle

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer des modèles d’astrocytome génétiquement modifiés à partir de types cellulaires définis pour la caractérisation phénotypique in vitro et in vivo. Ceci est réalisé en récoltant des cellules primaires de type sauvage à partir de souris génétiquement modifiées néonatales non cries exprimant des substances non cries pour la culture in vitro. Dans un deuxième temps, les cellules primaires sont infectées par un vecteur adénoviral codant pour la recombinaison Cree afin d’induire une recombinaison génétique des allèles F flox in vitro.

Ensuite, les cellules recombinées sont cultivées en série pour leur caractérisation phénotypique. En fin de compte, la caractérisation des phénotypes tumorogènes pertinents in vitro et in vivo détermine si les mutations définies favorisent l’agénésie gliogénique dans des types spécifiques de cellules neurales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neuro-oncologie telles que : Quelles sont les conséquences phénotypiques des mutations associées à l’astrocytome ?

Les implications de cette technique s’étendent au développement préclinique de médicaments pour les astrocytomes, car ces cellules génétiquement définies peuvent être utilisées in vitro et in vivo, chez des souris syngénétiques immunocompétentes. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de récolte cellulaire et d’injection orthotopique sont techniquement difficiles et nécessitent une identification précise des structures anatomiques. La démonstration de la procédure sera assurée par Ryan Bash, un technicien de mon laboratoire, pour prélever le tissu cérébral.

Commencez par utiliser des ciseaux de dissection stérilisés à l’éthanol pour faire une coupe sagittale dans la peau au-dessus du crâne d’une souris néonatale euthanasiée d’un à trois jours, génétiquement modifiée, de la moelle épinière au nez. Ensuite, faites une incision dans le crâne le long de la suture sagittale, en partant de la moelle épinière et en s’étendant au-delà des bulbes olfactifs. Ensuite, à l’aide d’une pince incurvée, décollez doucement chaque hémisphère du crâne latéralement du cerveau à l’aide de micro-pinces droites.

Ensuite, pincez doucement la partie dorsale de chaque hémisphère cortical en prenant soin d’éviter le cervelet et le bulbe olfactif et placez le tissu cérébral dans une boîte de culture tissulaire contenant H-B-S-S-N. À l’aide d’un microscope à dissection, à l’aide de deux paires de micro-pinces, retirez délicatement les méninges de chaque hémisphère cortical et replacez la boîte de culture tissulaire sur la glace pour homogénéiser le tissu cérébral. Tout d’abord, utilisez une lame de rasoir propre pour enfin couper les hémisphères corticaux en dés.

Ensuite, déplacez la plaque dans une hotte de culture tissulaire et transférez les morceaux de tissu dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Rincez la plaque avec un millilitre de HBSS glacé et transférez également le lavage dans le tube. Après avoir retiré l’excès de HBSS à deux millilitres de température ambiante, des trips avec de l’EDTA dans le tube et associez davantage les fragments de tissu en pipetant de haut en bas environ 10 fois avec une pipette d’un millilitre.

Incuber la suspension cellulaire à 37 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes. En mélangeant soigneusement la solution cellulaire par inversion toutes les cinq minutes après l’incubation, on a mélangé trois millilitres de milieu complet dans la suspension cellulaire pour inhiber la trypsine en pipetant de haut en bas 10 fois, comme cela vient d’être démontré. Ensuite, faites tourner les astrocytes dissociés.

Retirez délicatement le snat à l’aide d’une pipette d’un millilitre et remettez la pastille en suspension dans quatre millilitres à 37 degrés Celsius. Média complet. Ensuite, transférez la suspension d’astrocytes dans une fiole de culture tissulaire à vis T 75 et maintenez les astrocytes corticaux à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone environ 16 heures après la récolte.

Lavez la fiole avec quatre millilitres de 37 degrés Celsius HBSS. Ajoutez ensuite quatre millilitres de milieu complet et maintenez les astrocytes corticaux à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone. Lorsque la culture atteint environ 95 % de confluence, secouez la culture pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone.

Retirez ensuite le support contenant les cellules détachées et lavez la plaque avec quatre millilitres supplémentaires de 37 degrés Celsius HBSS. Ajoutez ensuite quatre millilitres de milieu complet frais et incubez à nouveau les cellules 24 heures après avoir enrichi la culture pour les astrocytes corticaux. Rafraîchissez la culture avec deux millilitres de média complet.

Ensuite, incubez les cellules avec un millilitre de milieu complet contenant un microlitre d’au moins un fois 10e du 10e pfu par millilitre de l’adénovirus d’intérêt à 32 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone à cinq. L’infection par Gfab CRE provoque un avantage prolifératif dans les astrocytes gfab recombinés, augmentant la pureté des astrocytes de 59 % à plus de 90 % après cinq à neuf passages en culture. Après six heures, retirer le milieu contenant le virus et réincuber la culture dans un milieu frais et complet.

Ensuite, les astrocytes corticaux sont récoltés à environ 90 % de confluence et le nombre de cellules approprié sont remis en suspension dans de la méthylcellulose glacée à 5 %. Placez une seringue en verre de 250 microlitres dans un distributeur d’antigène à répétition, puis fixez une aiguille émoussée de calibre 18 à la seringue. Utilisez l’aiguille de calibre 18 pour aspirer les astrocytes corticaux dans la seringue et éliminer les bulles d’air.

Ensuite, jetez l’aiguille de calibre 18 et insérez une aiguille de calibre 27 sur la seringue. Appuyez sur le bouton du distributeur d’antigène jusqu’à ce que le liquide soit expulsé de la nouvelle aiguille pour implanter les astrocytes. Ensuite, fixez un animal receveur immunocompétent de trois à six mois dans un cadre stéréotaxique et faites une incision sur la suture sagittale d’environ 0,5 centimètre de long entre les oreilles et les yeux.

Localisez l’intersection des sutures coronales et sagittales ou BRE MA, ainsi que l’intersection de la lambdoïde dans les sutures sagittales ou la Lambda. Après s’être assuré que la BMA et la lambda sont dans le même plan horizontal, fixez la seringue et le distributeur d’antigène répétitif au cadre stéréotaxique au-dessus de la tête de l’animal, et mettez la pointe de l’aiguille en contact avec la bgma. Soulevez légèrement l’aiguille de la surface du crâne et déplacez-vous de deux millimètres latéralement et d’un millimètre rostrale par rapport à la bgma.

Ensuite, abaissez soigneusement l’aiguille à travers le crâne jusqu’à sa destination. Quatre millimètres ventral de la breg MA et activent le distributeur d’antigène répétitif. Une fois pour injecter cinq microlitres de la suspension cellulaire.

Laissez l’aiguille en place pendant deux minutes pour permettre à la pression intracrânienne de s’équilibrer, puis retirez l’aiguille lentement sur une période de 30 secondes à l’aide d’un échange de coton pour appliquer une pression sur tout saignement qui pourrait survenir. Enfin, utilisez un adhésif pour tissus pour approximer les bords de la plaie et fermer l’incision, puis placez l’animal dans une cage propre et chaude pour récupérer. Les xénogreffes de lignées cellulaires humaines établies nécessitent des hôtes immunodéficients et généralement ne doivent pas récapituler l’histopathologie des astrocytomes humains.

Par exemple, les xénogreffes orthotopiques U 87 MG forment des tumeurs circonscrites qui n’envahissent pas un cerveau normal. En revanche, l’injection d’astrocytes T RRP nulls dans le cerveau de souris syngéniques immunocompétentes produit des tumeurs qui récapitulent les caractéristiques histologiques de leurs homologues humains, en particulier l’invasion du tissu cérébral normal. Pour surveiller la croissance de l’allogreffe nulle TRP, des souris ont été sacrifiées tous les cinq jours après l’injection de cellule, et la charge tumorale a été déterminée en quantifiant la surface tumorale sur des sections de cerveau colorées h et e.

Il a été déterminé que la zone tumorale augmentait de façon exponentielle au fil du temps, et l’injection orthotopique d’une fois 10 à la cinquième des astrocytes TP nll dans le cerveau du receveur a entraîné une morbidité neurologique. Avec une survie médiane de 22 jours. L’imagerie longitudinale in vivo a été utilisée pour définir la cinétique de croissance tumorale.

Par conséquent, dans cette expérience, des astrocytes pénaux TR et modifiés pour exprimer la luciférase ont été injectés dans le cerveau de syngéniques immunocompétents. Les compagnons de portée et la croissance tumorale ont été déterminés par imagerie de bioluminescence en série. Une augmentation de 15 fois de la bioluminescence a été observée sur une période de 16 jours.

À la suite de cette procédure, des tests de médicaments peuvent être effectués in vitro et in vivo pour déterminer l’efficacité et tester de nouvelles combinaisons de médicaments. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de récolter des astrocytes corticaux à partir de souris génétiquement modifiées conditionnelles exprimant non CRA, comment induire une recombinaison génétique in vitro et comment modéliser la tumorgenèse à l’aide d’allogreffes orthotopiques chez des souris immunocompétentes.