Imagerie en temps réel des jonctions endothéliales cellule-cellule Pendant neutrophiles Transmigration Sous physiologique débit

L’objectif global de cette procédure est de suivre la distribution des jonctionnels endogènes, de la térine et du pcam one pendant la migration endothéliale trans des leucocytes dans des conditions d’écoulement physiologiques. Ceci est accompli en isolant d’abord les leucocytes polynucléaires ou PMN du sang total de volontaires sains à l’aide d’un gradient proco. La deuxième étape consiste à ajouter des anticorps marqués par fluorescence à une monocouche de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine stimulées par le TNF alpha cultivées en lames d’écoulement 30 minutes avant de commencer l’expérience d’écoulement.

Cela permettra de visualiser la dynamique jonctionnelle des cellules endothéliales pendant la transmigration des neutrophiles dans des conditions d’écoulement physiologiques. Ensuite, la lame d’écoulement contenant les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine stimulées par TNF alpha marquées par fluorescence est connectée au système d’écoulement et placée sur la platine du microscope. La pompe tirera le tampon d’écoulement du réservoir à travers la chambre d’écoulement dans la seringue.

La dernière étape consiste à injecter lentement les PMN dans le système d’écoulement via l’orifice d’injection. En fin de compte, les PMN sont visualisés à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Au bout de quelques minutes, les leucocytes apparaissent, adhèrent et transmigrent.

L’expérience peut être arrêtée à tout moment souhaité. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes existantes telles que les tests de transmigration statique, est qu’avec cette technique, vous pouvez étudier l’adhésion et la transmigration dans la vie réelle dans des conditions d’écoulement physiologiques. Cela nous aidera à comprendre pourquoi les leucocytes choisissent une racine plutôt qu’une autre, donc la migration PGA par rapport à la migration transcellulaire.

Pour ce faire, nous visualisons les jonctions cellulaires avec des anticorps marqués par fluorescence. Les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine ou HU X pour cette expérience sont cultivées selon les instructions du fabricant sur des boîtes enrobées de fibronectine à l’aide de milieux complétés par une croissance endothéliale. Douleur moyenne. La culture cellulaire est utilisée entre quatre et huit passages lorsque les cellules atteignent 80 à 90 % de confluence, lavez-les soigneusement avec du PBS à température ambiante à pH 7,4, puis la trypsine est les cellules après trypsine et centrifugation.

Nous suspendons à 800 000 cellules par millilitre à l’aide de fluides. L’expérience utilise des chambres d’écoulement qui ont été recouvertes de fibronectine sur la plaque du jour précédent. 80 000 cellules dans chaque canal des chambres d’écoulement codées par la fibronectine et pipeter doucement la suspension cellulaire de haut en bas de la culture pendant la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone le lendemain.

Rafraîchissez le support dans la glissière de la chambre d’écoulement en inclinant doucement la glissière à un angle de 45 degrés. Il est recommandé de ne retirer le fluide que dans les réservoirs et non dans le canal lui-même. L’élimination du milieu dans les canaux peut entraîner la perte et la mort des cellules endothéliales en raison de la force de traînée du milieu causée par le pipetage.

Vérifier par microscopie à contraste de phase si les cellules endothéliales ont formé une monocouche. Si les cellules ne sont pas à 100 % cofluentes, changez de milieu deux fois par jour jusqu’à ce qu’elles atteignent 100 % de confluence. Une fois que les cellules ont atteint 100 % de fluidité, stimulez les cellules avec des milieux contenant le médiateur inflammatoire.

Le TNF alpha stimulant uix pendant la nuit avec TNF alpha entraîne un phénotype inflammatoire de l’endothélium IE régulation à la hausse des molécules d’adhésion cellulaire telles que ICAM one et VA M1. Avant d’isoler les leucocytes polymorphonucléaires ou PMN, préparez un tampon d’écoulement pour le lavage des PMN isolés et pour l’utilisation dans l’essai d’écoulement à 100 millilitres d’une solution mère préalablement préparée. À 100 microlitres de chlorure de calcium frais d’une molaire, 2,5 millilitres d’albumine humaine à partir d’une concentration de stock de 200 grammes par litre et 0,1 gramme de glucose.

Filtrez le tampon d’écoulement à l’aide d’un filtre de 0,45 micron. Une solution de citrate trisodique ou de TNC à 10 % dans du PBS à un pH de 7,4 est également préparée avant l’isolement des NMP. Les NMP seront isolés à partir de 20 millilitres de sang total prélevés dans une héparine de sodium provenant d’un volontaire en bonne santé.

Diluez d’abord le sang entier un à un avec 10 % de PBST NNC dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, utilisez un pipeteur au réglage le plus lent pour pipeter soigneusement 20 millilitres de sang dilué soigneusement sur 12,5 millilitres de solution colloïdale per co dans de l’eau d’une densité de 1,130 gramme par millilitre dans un nouveau tube de 50 millilitres. Le tube contenant chaque coll doit être incliné à un angle de 45 degrés lors de l’ajout de sang.

Placez soigneusement les tubes dans la centrifugeuse et faites-les tourner à température ambiante pendant 20 minutes à 800 G avec une faible accélération et avec les freins désactivés lorsque la centrifugation est terminée. Retirez tout le liquide et remplissez chaque tube avec un tampon de lyse érythrocytaire glacé pour lesser les érythrocytes. Laissez les tubes sur la glace, en les inversant de temps en temps jusqu’à ce que la suspension tourne en rouge foncé à 500 GS pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius avec les freins activés.

La fraction de granulés résultante contient les PMN Avec les érythrocytes, éliminez le surnageant et lavez la pastille deux fois dans de la glace. Tampon de lyse froide à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant du deuxième lavage, remettre la pastille en suspension avec un tampon d’écoulement à température ambiante et déterminer la concentration de NMP à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.

Enfin, suspendez les PMN dans le tampon d’écoulement à une fois 10 à six cellules par millilitre et conservez-les à température ambiante pour marquer la cadhérine VA jonctionnelle endothéliale et le pcam un. Ajouter l’anticorps pcam LOR 6 47 à une dilution de un à 100 et l’anticorps anti-cadhérine FE ZI indépendant du calcium à une dilution de un à 50 à une culture VE, milieu dans la chambre d’écoulement et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour préparer les NMP au dosage, placez-les dans un bain-marie pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius avant de les injecter dans le système d’écoulement.

Connectez le tube à une chambre d’écoulement vide et remplissez-le d’un tampon d’écoulement chaud pour éviter la formation de bulles d’air. Lors de la mise en place du système d’écoulement. À l’aide d’un tube en silicone, connectez un côté de la chambre d’écoulement vide au système d’écoulement de la pompe à seringue contenant une seringue de 20 millilitres.

Placez la chambre d’écoulement sur la platine du microscope. Le test sera effectué à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un objectif à huile 63 x et d’une chambre climatique réglée à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Connectez l’autre côté de la chambre d’écoulement vide à la fiole du réservoir remplie d’un tampon d’écoulement à 37 degrés Celsius et démarrez la pompe à seringue afin de remplir tout le tube avec un tampon d’écoulement, la pompe tirera le tampon d’écoulement du réservoir à travers la chambre d’écoulement dans la seringue.

Ce tube contient également un port d’injection de leurre en ligne, qui permet d’injecter des PMN avec une aiguille dans une expérience en cours d’exécution sans arrêter l’écoulement et créer des bulles d’air. Ensuite, remplacez la chambre d’écoulement vide par la chambre d’écoulement contenant du VE traité TNF alpha pincez les tubes avant de les déconnecter et de les reconnecter à la chambre contenant le VE.To éviter les bulles d’air dans le système, il est essentiel de pincer et de serrer les tubes. Lors de la connexion de la lame contenant les cellules.

Placez la chambre d’écoulement sur la platine du microscope, ajustez la vitesse d’écoulement à un centime carré conformément à la vitesse d’écoulement physiologique en post-capillaires, qui est de un à cinq dines par centimètre carré d’enregistrement différentiel de contraste interférentiel ou DIC fite LOR 6 47. Simultanément, à l’aide d’une seringue d’un millilitre, injectez lentement le PMN dans le système d’écoulement via l’orifice d’injection du leurre en ligne. Après quelques minutes, les leucocytes apparaissent, adhèrent et transmigrent et arrêtent l’expérience à tout moment souhaité.

En déconnectant le tube de la chambre d’écoulement et en pipetant un fixateur dans la chambre d’écoulement, la résistance des monocouches endothéliales a été mesurée pour tester si les anticorps interféraient avec la fonction barrière de l’endothélium. Aucun changement de résistance n’a été observé lorsque l’EV a pu entendre un clone d’anticorps 55 7 H un ou que le contrôle de l’isotype a été ajouté aux cellules. En revanche, l’anticorps anti-blocage de l’ouïe CL 75 a considérablement réduit la résistance.

L’analyse RAP n’a révélé aucun changement dans la récupération de fluorescence en présence ou en l’absence de l’anticorps VE CADHERIN 55 7 H one, indiquant que l’anticorps n’a pas modifié la dynamique de la cadhérine VE, de la cadhérine VE et de la distribution d’un seul élément pendant la migration endothéliale trans des neutrophiles ou TEM en temps réel a été analysée. Le panneau supérieur montre un neutrophile entouré de blanc adhérant sur l’endothélium et traversant la jonction cellule à cellule sans nuire à la distribution de l’EV cohérent et du pcam. Au cours de la diapédèse, une dispersion locale de VE cohérent et de P chem un peut être observée lorsqu’un neutrophile fait saillie à travers la cellule jusqu’aux jonctions cellulaires délimitées en blanc est un neutrophile au-dessus de l’endothélium.

Le contour jaune montre la membrane neutrophile qui se trouve déjà sous l’endothélium. Après la fin de la diapédèse, les jonctions se ferment et sont toutes cohérentes et une jonction est relocalisée sur les sites de diapédèse. Les bords des neutrophiles transmigrés sont délimités en jaune.

À la suite de cette procédure, la migration endothéliale trans des leucocytes peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires telles que si les leucocytes traversent l’endothélium en utilisant le bagga ou la racine transcellulaire.