Name: Imagerie en temps réel des jonctions endothéliales cellule-cellule Pendant neutrophiles Transmigration Sous physiologique débit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Découvrez l'imagerie en temps réel des jonctions endothéliales VE-cadherine et PECAM-1 pendant la transmigration des neutrophiles sous débit physiologique. Cette méthode permet de différencier les voies paracellulaire et transcellulaire.

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Les auteurs remercient le Dr P.L. Hordijk pour la lecture critique du manuscrit. AED est soutenu par une bourse de la Fondation Landsteiner pour la recherche sur la transfusion sanguine (LSBR) (subvention #1028). JK est soutenu par la Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB est boursier NHS Dekker (subvention #2005T039).

Les neutrophiles ont été isolés chez des volontaires sains qui ont signé un consentement éclairé. La recherche a été effectuée en conformité avec les directives nationales et institutionnelles, pour le bien-être humain. 1. placage et l&#39;entretien des cellules ombilicales humaines endothéliales de veine <ol><li> La culture de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) selon les instructions du fabricant. Cultivez HUVECs sur la fibronectine (FN) doté d&#39;un revêtement plats (10 pg / ml, dissous dans l&#39;eau déminéralisée) par des moyens (endothéliale Basal Medium (EBM-2) supplémenté avec de croissance endothélial moyen (EGM-2) SingleQuots). Utilisez culture cellulaire entre 4-8 passages pour les expériences. </li><li> Jour 1: Coat-débit chambres avec 100 pi de la fibronectine (10 pg / ml dans PBS) pendant au moins 2 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Jour 2: Lorsque les cellules atteignent 80-90% de confluence, les cellules trypsiniser après un lavage soigneux avec RT tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4, centrifuger à 800 xg et remettre en suspension à 800 000 cellules / ml en utilisant les médias. Plate 80.000 cellules dans chaque canal unique des flux-chambres FN-enduits et doucement pipeter la suspension de cellules de haut en bas. Culture O / N dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Jour 3: Actualiser les médias dans la diapositive débit chambre d&#39;incliner lentement la lame à un angle de 45 °. (Voir la figure 1A). NOTE: Il est recommandé de ne supprimer que les médias dans les réservoirs et pas dans le canal lui-même. Retrait des médias dans les canaux peut entraîner la perte de cellules endothéliales et de décès dus à la force d&#39;entraînement des médias provoquée par pipetage. </li><li> Vérifiez par microscopie à contraste de phase si les cellules endothéliales ont formé une monocouche (soit 100% de confluence). Si les cellules ne sont pas 100% de confluence, changer les médias deux fois par jour jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent 100% de confluence. </li><li> Une fois que les cellules ont atteint la confluence, stimuler les cellules avec des milieux (voir l&#39;étape1.1) contenant du médiateur inflammatoire (TNF-α (10 ng / ml)). La stimulation des cellules HUVEC O / N (c&#39;est-à-12 h) avec les résultats de TNF-α dans un phénotype inflammatoire de l&#39;endothélium, ie., La régulation positive de molécules d&#39;adhésion cellulaire telles que ICAM-1 et VCAM-1 13. </li></ol> 2. leucocytes polynucléaires isolement en utilisant des gradients de Percoll <ol><li> Préparer N-2 hydroxyéthylpiperazine-N&#39;-2-éthanesulfonique (HEPES) -buffer (ci-après dénommé: flux tampon) avant d&#39;isoler les leucocytes polynucléaires (PMN). Flow-tampon est utilisé pour laver les PMN isolées et en tant que tampon dans le dosage de l&#39;écoulement. Pour préparer le tampon d&#39;écoulement: diluer 7,72 g NaCl (132 mM), 4,76 g d&#39;HEPES (20 mM), 0,45 g de KCl (6 mM), 0,25 g de MgSO 4 • 7H 2 O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mM) dans 1 litre d&#39;eau déminéralisée et d&#39;ajuster le pH à 7,4 (ce stock peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs semaines). </li><li> Ajouter frais 100 pi 1 M CaCl 2 &amp; #160; (1 mM), 2,5 ml d&#39;albumine humaine à partir d&#39;une concentration de 200 g / L de bouillon (0,5% v / v) et 0,1 g de glucose pour 100 ml (0,1% p / v) de tampon d&#39;écoulement. Ensuite, filtrage du flux-tampon en utilisant un filtre de 0,45 um. NOTE: Ce tampon de flux doit être préparé frais pour chaque expérience. </li><li> Avant d&#39;isolement des PMN, préparer 10% de citrate trisodique (CNC) dans une solution PBS, pH 7,4. </li><li> Recueillir 20 ml de sang total dans vacuettes de l&#39;héparine de sodium à partir d&#39;un volontaire sain. Diluer le sang total à 1: 1 avec 10% de PBS / TNC en tubes de 50 ml et 20 de pipette ml dilués sang avec précaution sur 12,5 ml de Percoll (23% (w / w) de solution colloïdale dans l&#39;eau avec une densité de 1,130 g / ml) dans un nouveau tube de 50 ml. Placez délicatement les tubes dans la centrifugeuse et tourner pendant 20 min à 800 xg avec une faible accélération et pas de pause fixé à RT. REMARQUE: Lors de l&#39;ajout du sang dilué au Percoll, incliner le tube Percoll contenant dans un angle de 45 ° et une pipette doucement le sang dilué dans l&#39;esprit du tubeh la vitesse la plus lente pipette de garçon. </li><li> Retirer tout le liquide et remplir ensuite le tube à la lyse des érythrocytes-tampon glacé (4,15 g NH 4 Cl [0,155 M], 0,5 g de KHCO3 [0,01 M] et 18,5 mg d&#39;EDTA (triplex III) [0,1 mm] à 500 ml glacé de H 2 O) pour lyser les érythrocytes. Laisser le tube sur de la glace, de temps en temps renversant le tube, jusqu&#39;à ce que la suspension vire au rouge foncé, suivie d&#39;une centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C avec des pauses activées. REMARQUE: La fraction de culot contient les PMN (neutrophiles, éosinophiles, basophiles) avec des érythrocytes. </li><li> Retirer le surnageant et laver culot deux fois dans la lyse-tampon glacée à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Reprendre le culot avec flow-tampon à la température ambiante et déterminer la concentration PMN l&#39;aide d&#39;un hématimètre ou compteur de cellules automatisé. Suspendre les PMN du débit-tampon à 1 x 10 6 cellules / ml et conserver à la température ambiante. </li></ol> 3. étiquetage des endothéliale Junctional VE-cadhérine et PECAM-1 <ol><li> Ajouter le PECAM Alexa Fluor 647 anticorps (clone WM59) à une dilution 1: 100 et l&#39;anticorps VE-cadhérine-FITC calcium-indépendante (clone 55-7H1) à un milieu de culture à la dilution 1:50 HUVEC (voir étape 1.1), et incuber pendant 30 min avant de commencer l&#39;expérience de flux de visualiser la dynamique de jonction des cellules endotheliales au cours de la transmigration des neutrophiles dans des conditions d&#39;écoulement physiologiques. REMARQUE: Avant d&#39;ajouter les anticorps directement marqués à l&#39;écoulement-chambres, veiller à ce que le volume de chaque canal ne dépasse pas 100 pi. Cela permet de garder les frais d&#39;anticorps aussi bas que possible. </li></ol> 4. PMN TEM test sous flux <ol><li> Placer les PMN dans un bain-marie pendant 15 min à 37 ° C avant de les injecter dans le système d&#39;écoulement. </li><li> Connectez le tuyau à un débit chambre vide et remplir avec chaud (par exemple, 37 ° C) Flux-tampon (voir l&#39;étape 4.3) pour éviter la formation de bulles d&#39;air lors de la mise en place eSystème de flux de courrier. </li><li> Se connecter un côté d&#39;une chambre d&#39;écoulement à vide du système de débit de la pompe de la seringue à l&#39;aide de tubes en silicone contenant une seringue de 20 ml, et de mettre la chambre d&#39;écoulement dans la platine du microscope. </li><li> Branchez l&#39;autre extrémité d&#39;un flux chambre vide dans le ballon réservoir rempli de 37 ° C Débit-tampon (figure 1B) et démarrer la pompe de la seringue afin de combler tous les tubes avec flow-tampon. La pompe va tirer le tampon d&#39;écoulement à partir du réservoir à travers la chambre d&#39;écoulement dans la seringue. NOTE: Ce tube comprend également un port d&#39;injection Luer en ligne, qui permet aux PMN à injecter avec une aiguille dans une expérience en cours d&#39;exécution sans arrêter la circulation et la création de bulles d&#39;air. </li><li> Remplacer le flux chambre vide avec le flux compartiments contenant le TNF-α HUVEC traitées, raccorder le tuyau d&#39;écoulement tampon contenant et le placer dans la platine du microscope (figure 1C). Pincez les tubes avant de débrancher et de rebrancher lem dans les chambres contenant les cellules HUVEC, comme pincement peut pas conduire à la formation de bulles d&#39;air à l&#39;intérieur de la tubulure et / ou débit-chambres. </li><li> Réglez la vitesse d&#39;écoulement de 1 dyn / cm 2, en fonction de la vitesse d&#39;écoulement physiologique dans les veinules post-capillaires (1-5 dyn / cm 2). </li><li> Fiche contraste interférentiel différentiel (DIC), FITC (488 nm) et l&#39;Alexa Fluor 647 (647 nm) en utilisant simultanément un microscope confocal à balayage laser microscope. </li><li> Injecter les PMN (étape 4.1) lentement dans le système d&#39;écoulement via le in-line orifice d&#39;injection Luer (figure 1D) en utilisant seringues de 1 ml. </li><li> Après quelques minutes, les leucocytes apparaissent, adhèrent, et transmigrer. Arrêter l&#39;expérience à tout moment désiré en débranchant le tube de l&#39;écoulement chambre et pipetage fixateur (formaldéhyde 3,7% dans PBS) dans le flux chambre. Laisser fixation pendant 10 minutes, suivie d&#39;un lavage avec du PBS. Les données sont analysées en utilisant un logiciel d&#39;imagerie (voir tableau des matériaux et de l&#39;équipement). REMARQUE: Effectuer la il expérience utilisant un microscope confocal à balayage laser équipé d&#39;une chambre climatique à une température constante à 37 ° C, 5% CO 2, et un objectif 63X d&#39;huile. </li></ol>

<ol><li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis--an+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis--an inflammatory disease.</a> N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).</li>
<li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+migration+in+inflammation%3A+present+and+future+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li>
<li>Szekanecz, Z., Koch, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+involvement+in+rheumatic+diseases%3A+%27+vascular+rheumatology%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular involvement in rheumatic diseases: ' vascular rheumatology.</a> Arthritis Res. Ther. 10, 224(2008).</li>
<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattractant+signals+and+beta+2+integrin+occupancy+at+apical+endothelial+contacts+combine+with+shear+stress+signals+to+promote+transendothelial+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration.</a> J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).</li>
<li>Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transendothelial+migration+of+lymphocytes+mediated+by+intraendothelial+vesicle+stores+rather+than+by+extracellular+chemokine+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots.</a> Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).</li>
<li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-cellular+migration%3A+cell-cell+contacts+get+intimate%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).</li>
<li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).</li>
<li>Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+transcellular+migration+occurs+through+recruitment+of+endothelial+ICAM-1+to+caveola-+and+F-actin-rich+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains.</a> Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).</li>
<li>Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).</li>
<li>Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-3+activation+modulates+cell-cell+contacts+of+human+bone+marrow+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Res%22%5BJournal%5D)">ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells.</a> J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).</li>
<li>Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+vascular+endothelial-cadherin+during+leukocyte+transmigration+across+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium.</a> J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).</li>
<li>Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+movements+of+VE-cadherin+and+PECAM-1+during+transmigration+of+polymorphonuclear+leukocytes+through+human+umbilical+vein+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium.</a> Blood. 100, 3597-3603 (2002).</li>
<li>Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro%3A+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li>
<li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Pour ce protocole, il est essentiel d&#39;éviter la formation de bulles d&#39;air dans le débit-chambres, car cela se traduira par l&#39;apoptose des cellules et une monocouche perturbé. Pour éviter cela, nous tenons à souligner à payer un intérêt particulier pour les étapes 4.2 et 4.5, où les tubes sont reliés à l&#39;écoulement chambre. Une autre étape importante dans le protocole est le amorçage des PMN qui sont conservés à la température ambiante en les incubant pendant 15 à 30 min à 37 ° C avant de les injecter à l&#39;écoulement de chambre (étape 4.1). Cela se traduit par l&#39;amorçage des intégrines leucocytaires, en leur permettant d&#39;adhérer à des molécules d&#39;adhésion telles que ICAM-1, VCAM-1 ou à l&#39;endothélium. Ce protocole n&#39;est pas limitée à étudier la transmigration des neutrophiles. Mais aussi d&#39;autres types de leucocytes tels que les monocytes ou les lymphocytes peuvent être utilisés. Notez que l&#39;étape 4.1, c&#39;est à dire, l&#39;amorçage des leucocytes peuvent différer entre les différents types de leucocytes. En outre, d&#39;autres types de cellules endotheliales peuvent être utilisés. Pour cela, il reste critiquepour stimuler les cellules endotheliales à des stimuli inflammatoires appropriés, tels que le TNF-α ou IL-1β. Si les neutrophiles ne répondent pas de transmigration, on peut envisager de traiter les neutrophiles brièvement (5 min) avec de la N-formyl-L-méthionyl-L-leucyl-L-phénylalanine (fMLP) peptide 16. Cela stimulera les neutrophiles, en particulier leurs intégrines, encore plus loin, ce qui les rend plus enclins à adhérer à l&#39;endothélium. Typiquement / cm 2 vitesses d&#39;écoulement 1 dyn est utilisé. Cette vitesse d&#39;écoulement est mesurée dans les veinules post-capillaires, les sites où la plupart des migrations leucocytes transendotheliale se produit 17. En utilisant les débits-chambres décrites, il est possible d&#39;augmenter la vitesse de circulation de 10 dyn / cm 2. Cependant, il n&#39;est pas recommandé d&#39;augmenter le cisaillement plus loin. Elle peut entraîner une fuite non désirée du tube et le détachement des cellules de la chambre d&#39;écoulement. Les résultats décrits dans la figure 3 indiquent que ceux-cianticorps peuvent être utilisés pour visualiser et étudier la dynamique des jonctions endothéliales cellule-cellule pendant la diapédèse des leucocytes. En particulier, en plus des dosages de transmigration existants ce protocole permet de discriminer de migration transcellulaire paracellulaire dans des conditions d&#39;écoulement physiologiques en temps réel. Comme les anticorps se colorent les jonctions cellule-cellule, on peut marquer le nombre de leucocytes qui traversent la VE-cadhérine / jonctions PECAM-1-positifs par rapport non positive VE-cadhérine / PECAM-1 sites. De cette façon, la migration transcellulaire peut être discriminé de la migration paracellulaire. Il est important de souligner que ces anticorps ne gênent pas la fonction des protéines, ils se lient à l&#39;anticorps: PECAM-1 utilisé dans cette étude est dirigé contre le domaine extracellulaire secondes. Les cellules endotheliales qui ont été étalées en présence de l&#39;anticorps n&#39;ont pas montré de défauts dans la diffusion ou la formation d&#39;une monocouche, ce qui suggère que l&#39;anticorps n&#39;a pas au moinsinterférer avec les interactions entre les cellules endothéliales homotypiques. en plus de cela, les deux anticorps ne nuisent pas à la capacité des neutrophiles à migrer à travers la monocouche endothéliale. En outre, le nombre de neutrophiles qui transmigrent à travers la monocouche endothéliale, en l&#39;absence ou en présence de l&#39;anticorps n&#39;est pas modifié (données non présentées). Fait important, la microscopie confocale à balayage laser nous donne la possibilité d&#39;enregistrer différents canaux de fluorescence et DIC simultanément. Ainsi, ce test permet d&#39;étudier la dynamique de la VE-cadhérine et PECAM-1 en même temps quand un neutrophiles traverse la jonction cellule-cellule endothéliale et aidera à comprendre pourquoi les leucocytes choisissent une voie sur l&#39;autre, c&#39;est-à-paracellulaire contre transcellulaire.

La migration des leucocytes transendothéliale efficace et étroitement contrôlé (TEM) est d&#39;une importance capitale dans les processus physiologiques tels que la surveillance immunitaire et de l&#39;inflammation aiguë. Toutefois, dans certaines conditions physiopathologiques, TEM incontrôlée et excessive est observée traduit dans les maladies inflammatoires chroniques (par exemple, la polyarthrite rhumatoïde, l&#39;athérosclérose, l&#39;asthme). Egalement au cours de la métastase des cellules tumorales, le processus de migration trans-endothéliale est instrumental pour les cellules tumorales quittent la circulation à métastaser 1-3. Dans le but d&#39;interférer spécifiquement avec leucocytes excessive ou TEM des cellules tumorales, une compréhension détaillée de la régulation de ce processus est nécessaire. On pense que le processus de TEM se produit à travers différentes étapes. Études séminales, revu il ya deux décennies par Butcher et Springer, ont conduit au modèle en plusieurs étapes décrivant le processus de TEM 4,5. Ce modèle est toujours valable, même si certains annonceétapes conditionnelles ont été inclus 6. Alon et al. Décrit la nécessité de la présence de chimiokines immobilisés sur la surface de l&#39;endothélium 7. Récemment, ils ont montré que l&#39;endothélium génère lui-même chimiokines qui sont présentés à la surface apicale endothéliale 8. En outre, le même groupe a mis en avant l&#39;importance des conditions d&#39;écoulement pendant TEM 7. Récemment, plusieurs publications ont porté sur les deux itinéraires différents leucocytes peuvent prendre à l&#39;étape finale de la diapédèse de TEM. Ils peuvent soit aller à travers les jonctions cellule-cellule, c&#39;est à dire, la voie de migration paracellulaire, ou traverser le corps de la cellule endothéliale, connue sous le nom migration voie transcellulaire 9. Carman et ses collègues ont étudié ces voies dans le détail et a conclu que les leucocytes choisissent préférentiellement la voie de migration paracellulaire (90%) sur la voie transcellulaire (10%) lors de la traversée d&#39;une veine ombilicale endothéliale monocouche 10.Cependant, lorsque les cellules endotheliales provenant d&#39;autres origines ont été utilisés, par exemple, le cerveau ou le système microvasculaire, les plus utilisés leucocytes voie transcellulaire (30%) 11. Le groupe Vestweber récemment montré que, lorsque les jonctions cellule-cellule étaient incapables de dissocier l&#39;une de l&#39;autre à l&#39;aide d&#39;une réaction en chaîne dans un modèle animal, en remplaçant endogène VE-cadhérine de VE-cadhérine, alpha-caténine chimère, leucocytes TEM a été complètement bloqué 12 . De manière surprenante, les auteurs ont remarqué que TEM a été bloqué en plusieurs, mais pas tous, les tissus. Dans l&#39;ensemble, ces expériences élégantes ont indiqué que les leucocytes ont préféré la voie paracellulaire sur la voie transcellulaire, bien que les signaux de régulation qui déclenchent cette décision sont encore inconnues. Même si la majorité des leucocytes préfèrent la voie de migration paracellulaire, il est encore difficile de distinguer entre les deux voies. En outre, en dépit de nombreuses études portant sur le rôle de la cellule Junct-cellule endothélialeions, la dynamique de ces jonctions, en particulier les protéines de jonction VE-cadhérine et PECAM-1, au cours de leucocytes passage est encore en débat. Nous avons développé un test relativement simple dans lequel les molécules de jonction peuvent être surveillés en temps réel pendant la diapédèse des leucocytes dans des conditions d&#39;écoulement physiologiques en utilisant des anticorps marqués par fluorescence. Ces anticorps n&#39;ont pas interféré avec ou bloquent l&#39;intégrité de jonction ou de la mobilité des protéines ciblées. Ce test nous permet de suivre la dynamique des protéines de jonction au cours du processus de paracellulaire TEM. En outre, ce test permet aussi la discrimination entre les voies de migration paramètres et transcellulaires.

<table><tbody><tr><td>&mu ;-Slide VI</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td>Chambre d’écoulement</td></tr><tr><td>0.45 &mu ; Filtre M&nbsp ;</td><td>Whatman/GE Lifesciences</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 1 ml&nbsp ;</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 20 ml&nbsp ;</td><td>Aiguille BD Discardit II</td><td>366296</td><td></td></tr><tr><td>21 G&nbsp ;</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>Albumine&nbsp ;</td><td>Sanquin</td><td>15522644</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium (NH4Cl)</td><td>Merck</td><td>1009245000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Milieu basal + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Facteurs de croissance</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 + CC-4176</td><td>média</td></tr><tr><td>EDTA (Titriplex III)</td><td>Merck</td><td>1370041000</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes&nbsp ;</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-2MG</td><td>FN</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Port d’injection Luer en ligne&nbsp ;</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4&bull ; 7H2O)</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1-ALEXA-647&nbsp ;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561654</td><td>clone WM59</td></tr><tr><td>Percoll&nbsp ;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Fresenius Kabi&nbsp ; Nederland</td><td>M090001/01NL</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénocarbonate de potassium (KHCO3)</td><td>Merck</td><td>1048540500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique trihydraté (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Tygon 3350 tube</td><td>VWR</td><td>228-4331</td><td>tube</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl</td><td>)Calbiochem (Millipore)</td><td>567441</td><td></td></tr><tr><td>Pousse-seringue&nbsp ;</td><td>Appareil Harvard</td><td>numéro de modèle 55-5920</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha ; &nbsp ;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td>facteur de nécrose tumorale Citrate</td></tr><tr><td>trisodique&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>1.06447.5000</td><td>TNC</td></tr><tr><td>Vacuettes</td><td>Greiner, Allemagne</td><td>980044</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin-FITC&nbsp ;</td><td>BD Pharmingen</td><td>560411</td><td>clone 55-7H1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META&nbsp ;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Iéna, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software 2008</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Iéna, Allemagne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie en temps réel des jonctions endothéliales cellule-cellule pendant neutrophiles transmigration sous physiologique débit

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Au cours de l&#39;inflammation, les leucocytes quittent la circulation et traversent l&#39;endothélium pour lutter contre les pathogènes envahisseurs dans les tissus sous-jacents. Ce processus est connu comme la migration des leucocytes transendotheliale. Deux voies de leucocytes à traverser la monocouche endothéliale ont été décrites: la voie paracellulaire, c&#39;est-à travers les jonctions cellule-cellule et la voie transcellulaire, c&#39;est à dire, à travers le corps de la cellule endothéliale. Cependant, il est techniquement difficile de discriminer entre le paragraphe et la voie transcellulaire. Nous avons développé un test in vitro simple pour étudier la distribution de la VE-cadhérine endogène et PECAM-1 au cours de la migration des neutrophiles transendotheliale dans des conditions d&#39;écoulement physiologiques. Avant de neutrophiles perfusion, les cellules endothéliales ont été brièvement traités avec des anticorps marqués par fluorescence contre VE-cadhérine et PECAM-1. Ces anticorps ne gênent pas la fonction des deux protéines, comme cela a été déterminé par la cellule-électrique SUBSTRAte impédance de détection et PAF mesures. L&#39;utilisation de ce test, nous avons pu suivre la répartition des endogène VE-cadhérine et PECAM-1 lors de la migration trans-endothéliale dans des conditions de débit et de discrimination entre les paramètres et de migration transcellulaire routes des leucocytes à travers l&#39;endothélium.

Nous avons d'abord testé si les anticorps n'ont pas interféré avec la fonction de barrière de l'endothélium. Nous avons mesuré la résistance des monocouches endothéliales en utilisant électrique cellule-substrat impédance de détection (ECIS). Pour plus de détails, voir Van Buul et al. Aucune 13 modification de la résistance a été observé lorsque l'anticorps anti-VE-cadhérine marqué par fluorescence a été ajouté aux cellules (figure 2A). Un anticorps anti-VE-cadhérine qui est bien reconnu pour bloquer la VE-cadhérine fonction réduit considérablement la résistance (Figure 2A). En outre, les anticorps utilisés pour l'imagerie ne pas modifier la dynamique de VE-cadhérine, comme cela a été évalué par mesure de la récupération de fluorescence après photo-blanchiment (FRAP) de la VE-cadhérine-GFP (figure 2B). Après 1-2 min, les neutrophiles ont adhéré à la monocouche endothéliale pouvant être activé comme visualisé dans le canal DIC (figure 3A). Après l'exploration de soi 5-30c, la grande majorité des neutrophiles transmigré à travers la monocouche endothéliale travers les jonctions cellule-cellule qui ont été marquées avec les anticorps dirigés contre le PECAM-1 et VE-cadhérine. Au cours du processus de diapédèse, la distribution de la VE-cadhérine et PECAM-1 a été suivi en temps réel (figure 3B). Sur les sites de diapédèse des neutrophiles, la VE-cadhérine a été perturbé localement et PECAM-1 a montré une structure plus en forme d'anneau. Après l'achèvement de la diapédèse, les jonctions étroites et VE-cadhérine et PECAM-1 clairement déplacés sur les sites de la diapédèse (Figure 3C). Notez que les parties de l'anticorps anti-PECAM-1 ont été détectés sur la surface de la neutrophiles polynucléaires neutrophiles a atteint une fois que le côté baso-latéral de l'endothélium. Toutefois, cela n'a pas empêché les neutrophiles de traverser l'endothélium. Les dynamiques observées de VE-cadhérine en temps réel lors de la migration des neutrophiles transendotheliale étaient en accord avec les travaux de Shaw et ses collègues quiont montré, en utilisant la microscopie confocale et VE-cadhérine-GFP-transfecté les cellules endothéliales, que la VE-cadhérine-GFP diffuse latéralement lorsque les leucocytes ont traversé les jonctions cellule-cellule endotheliales 14. Travailler aussi par Su et ses collègues ont souligné nos observations de PECAM-1. Ils ont montré que la diffusion, à côté latéral VE-cadhérine au passage des leucocytes, PECAM-1 a été redistribué localement dans un anneau autour de la transmigration des neutrophiles à 15. <img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400"> Figure 1: Dans la chambre d'écoulement vitro. (A) La flèche indique le réservoir à partir duquel le support a besoin d'être rafraîchi. (B) un tube de silicone qui relie la chambre d'écoulement avec la ligne dans l'orifice d'injection pour l'injection Luer PMN sans déconnecter le tube (tête de flèche). (C) Connection d'un écoulement de chambre de vide dans le ballon réservoir rempli de 37 ° C d'écoulement tampon (tête de flèche). (D) de la connexion d'écoulement avec la chambre de TNF-α HUVEC traitées à la tubulure d'écoulement contenant un tampon et placé dans la platine du microscope (tête de flèche). <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500"> Figure 2: VE-cadhérine anticorps n'interfèrent pas avec la dynamique ou de la fonction de jonction. (A) impédance monocouche de cellules endothéliales est mesurée à l'aide de l'ECIS. Y-axe exprime impédance en ohms et l'axe des x représente le temps en heures. VE-cadhérine anticorps clone 55-7H1, marqué avec ALEXA647 (ligne bleue) ou isotype IgG témoin-ALEXA647 (ligne rouge) ne modifient pas endothéliale impédance monocouche cellulaire, alors que le VE-cadhérine blocage CL75 anticorps (ligne noire) ne réduire l'impédance . (B <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500"> Figure 3 VE-cadhérine et PECAM-1 au cours de la distribution des neutrophiles TEM en temps réel. (A) des neutrophiles (marquée avec la ligne blanche) faire adhérer sur l'endothélium et traversant la jonction cellule-cellule sans affecter la distribution de la VE-cadhérine et PECAM -1. (B) des neutrophiles traversant la monocouche endothéliale à travers les jonctions cellule-cellule. Une dispersion locale de la VE-cadhérine et PECAM-1 peuvent être observées lorsqu'un neutrophiles saillie à travers les jonctions cellule-cellule. La ligne blanche illustre présence de neutrophiles encore au-dessus de l'endothélium. Ligne jaune montre tha membrane des neutrophilest est déjà sous endothélium. (C) des neutrophiles a entièrement franchi la monocouche endothéliale. VE-cadhérine et PECAM-1 sont déplacés sur les sites de diapédèse. Ligne jaune illustre frontières de l'neutrophiles transmigré. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Les leucocytes traversent la monocouche endothéliale utilisant le paracellulaire ou la voie transcellulaire. Nous avons développé un test simple de suivre la distribution de jonction endogène VE-cadhérine et PECAM-1 au cours de la migration leucocytaire transendotheliale sous flux physiologique à une discrimination entre les deux voies de transmigration.

Imagerie en temps réel des jonctions endothéliales cellule-cellule Pendant neutrophiles Transmigration Sous physiologique débit

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

L’objectif global de cette procédure est de suivre la distribution des jonctionnels endogènes, de la térine et du pcam one pendant la migration endothéliale trans des leucocytes dans des conditions d’écoulement physiologiques. Ceci est accompli en isolant d’abord les leucocytes polynucléaires ou PMN du sang total de volontaires sains à l’aide d’un gradient proco. La deuxième étape consiste à ajouter des anticorps marqués par fluorescence à une monocouche de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine stimulées par le TNF alpha cultivées en lames d’écoulement 30 minutes avant de commencer l’expérience d’écoulement.Cela permettra de visualiser la dynamique jonctionnelle des cellules endothéliales pendant la transmigration des neutrophiles dans des conditions d’écoulement physiologiques. Ensuite, la lame d’écoulement contenant les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine stimulées par TNF alpha marquées par fluorescence est connectée au système d’écoulement et placée sur la platine du microscope. La pompe tirera le tampon d’écoulement du réservoir à travers la chambre d’écoulement dans la seringue.La dernière étape consiste à injecter lentement les PMN dans le système d’écoulement via l’orifice d’injection. En fin de compte, les PMN sont visualisés à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Au bout de quelques minutes, les leucocytes apparaissent, adhèrent et transmigrent.L’expérience peut être arrêtée à tout moment souhaité. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes existantes telles que les tests de transmigration statique, est qu’avec cette technique, vous pouvez étudier l’adhésion et la transmigration dans la vie réelle dans des conditions d’écoulement physiologiques. Cela nous aidera à comprendre pourquoi les leucocytes choisissent une racine plutôt qu’une autre, donc la migration PGA par rapport à la migration transcellulaire.Pour ce faire, nous visualisons les jonctions cellulaires avec des anticorps marqués par fluorescence. Les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine ou HU X pour cette expérience sont cultivées selon les instructions du fabricant sur des boîtes enrobées de fibronectine à l’aide de milieux complétés par une croissance endothéliale. Douleur moyenne. La culture cellulaire est utilisée entre quatre et huit passages lorsque les cellules atteignent 80 à 90 % de confluence, lavez-les soigneusement avec du PBS à température ambiante à pH 7,4, puis la trypsine est les cellules après trypsine et centrifugation.Nous suspendons à 800 000 cellules par millilitre à l’aide de fluides. L’expérience utilise des chambres d’écoulement qui ont été recouvertes de fibronectine sur la plaque du jour précédent. 80 000 cellules dans chaque canal des chambres d’écoulement codées par la fibronectine et pipeter doucement la suspension cellulaire de haut en bas de la culture pendant la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone le lendemain.Rafraîchissez le support dans la glissière de la chambre d’écoulement en inclinant doucement la glissière à un angle de 45 degrés. Il est recommandé de ne retirer le fluide que dans les réservoirs et non dans le canal lui-même. L’élimination du milieu dans les canaux peut entraîner la perte et la mort des cellules endothéliales en raison de la force de traînée du milieu causée par le pipetage.Vérifier par microscopie à contraste de phase si les cellules endothéliales ont formé une monocouche. Si les cellules ne sont pas à 100 % cofluentes, changez de milieu deux fois par jour jusqu’à ce qu’elles atteignent 100 % de confluence. Une fois que les cellules ont atteint 100 % de fluidité, stimulez les cellules avec des milieux contenant le médiateur inflammatoire.Le TNF alpha stimulant uix pendant la nuit avec TNF alpha entraîne un phénotype inflammatoire de l’endothélium IE régulation à la hausse des molécules d’adhésion cellulaire telles que ICAM one et VA M1. Avant d’isoler les leucocytes polymorphonucléaires ou PMN, préparez un tampon d’écoulement pour le lavage des PMN isolés et pour l’utilisation dans l’essai d’écoulement à 100 millilitres d’une solution mère préalablement préparée. À 100 microlitres de chlorure de calcium frais d’une molaire, 2,5 millilitres d’albumine humaine à partir d’une concentration de stock de 200 grammes par litre et 0,1 gramme de glucose.Filtrez le tampon d’écoulement à l’aide d’un filtre de 0,45 micron. Une solution de citrate trisodique ou de TNC à 10 % dans du PBS à un pH de 7,4 est également préparée avant l’isolement des NMP. Les NMP seront isolés à partir de 20 millilitres de sang total prélevés dans une héparine de sodium provenant d’un volontaire en bonne santé.Diluez d’abord le sang entier un à un avec 10 % de PBST NNC dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, utilisez un pipeteur au réglage le plus lent pour pipeter soigneusement 20 millilitres de sang dilué soigneusement sur 12,5 millilitres de solution colloïdale per co dans de l’eau d’une densité de 1,130 gramme par millilitre dans un nouveau tube de 50 millilitres. Le tube contenant chaque coll doit être incliné à un angle de 45 degrés lors de l’ajout de sang.Placez soigneusement les tubes dans la centrifugeuse et faites-les tourner à température ambiante pendant 20 minutes à 800 G avec une faible accélération et avec les freins désactivés lorsque la centrifugation est terminée. Retirez tout le liquide et remplissez chaque tube avec un tampon de lyse érythrocytaire glacé pour lesser les érythrocytes. Laissez les tubes sur la glace, en les inversant de temps en temps jusqu’à ce que la suspension tourne en rouge foncé à 500 GS pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius avec les freins activés.La fraction de granulés résultante contient les PMN Avec les érythrocytes, éliminez le surnageant et lavez la pastille deux fois dans de la glace. Tampon de lyse froide à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant du deuxième lavage, remettre la pastille en suspension avec un tampon d’écoulement à température ambiante et déterminer la concentration de NMP à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.Enfin, suspendez les PMN dans le tampon d’écoulement à une fois 10 à six cellules par millilitre et conservez-les à température ambiante pour marquer la cadhérine VA jonctionnelle endothéliale et le pcam un. Ajouter l’anticorps pcam LOR 6 47 à une dilution de un à 100 et l’anticorps anti-cadhérine FE ZI indépendant du calcium à une dilution de un à 50 à une culture VE, milieu dans la chambre d’écoulement et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour préparer les NMP au dosage, placez-les dans un bain-marie pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius avant de les injecter dans le système d’écoulement.Connectez le tube à une chambre d’écoulement vide et remplissez-le d’un tampon d’écoulement chaud pour éviter la formation de bulles d’air. Lors de la mise en place du système d’écoulement. À l’aide d’un tube en silicone, connectez un côté de la chambre d’écoulement vide au système d’écoulement de la pompe à seringue contenant une seringue de 20 millilitres.Placez la chambre d’écoulement sur la platine du microscope. Le test sera effectué à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un objectif à huile 63 x et d’une chambre climatique réglée à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Connectez l’autre côté de la chambre d’écoulement vide à la fiole du réservoir remplie d’un tampon d’écoulement à 37 degrés Celsius et démarrez la pompe à seringue afin de remplir tout le tube avec un tampon d’écoulement, la pompe tirera le tampon d’écoulement du réservoir à travers la chambre d’écoulement dans la seringue.Ce tube contient également un port d’injection de leurre en ligne, qui permet d’injecter des PMN avec une aiguille dans une expérience en cours d’exécution sans arrêter l’écoulement et créer des bulles d’air. Ensuite, remplacez la chambre d’écoulement vide par la chambre d’écoulement contenant du VE traité TNF alpha pincez les tubes avant de les déconnecter et de les reconnecter à la chambre contenant le VE.To éviter les bulles d’air dans le système, il est essentiel de pincer et de serrer les tubes. Lors de la connexion de la lame contenant les cellules.Placez la chambre d’écoulement sur la platine du microscope, ajustez la vitesse d’écoulement à un centime carré conformément à la vitesse d’écoulement physiologique en post-capillaires, qui est de un à cinq dines par centimètre carré d’enregistrement différentiel de contraste interférentiel ou DIC fite LOR 6 47. Simultanément, à l’aide d’une seringue d’un millilitre, injectez lentement le PMN dans le système d’écoulement via l’orifice d’injection du leurre en ligne. Après quelques minutes, les leucocytes apparaissent, adhèrent et transmigrent et arrêtent l’expérience à tout moment souhaité.En déconnectant le tube de la chambre d’écoulement et en pipetant un fixateur dans la chambre d’écoulement, la résistance des monocouches endothéliales a été mesurée pour tester si les anticorps interféraient avec la fonction barrière de l’endothélium. Aucun changement de résistance n’a été observé lorsque l’EV a pu entendre un clone d’anticorps 55 7 H un ou que le contrôle de l’isotype a été ajouté aux cellules. En revanche, l’anticorps anti-blocage de l’ouïe CL 75 a considérablement réduit la résistance.L’analyse RAP n’a révélé aucun changement dans la récupération de fluorescence en présence ou en l’absence de l’anticorps VE CADHERIN 55 7 H one, indiquant que l’anticorps n’a pas modifié la dynamique de la cadhérine VE, de la cadhérine VE et de la distribution d’un seul élément pendant la migration endothéliale trans des neutrophiles ou TEM en temps réel a été analysée. Le panneau supérieur montre un neutrophile entouré de blanc adhérant sur l’endothélium et traversant la jonction cellule à cellule sans nuire à la distribution de l’EV cohérent et du pcam. Au cours de la diapédèse, une dispersion locale de VE cohérent et de P chem un peut être observée lorsqu’un neutrophile fait saillie à travers la cellule jusqu’aux jonctions cellulaires délimitées en blanc est un neutrophile au-dessus de l’endothélium.Le contour jaune montre la membrane neutrophile qui se trouve déjà sous l’endothélium. Après la fin de la diapédèse, les jonctions se ferment et sont toutes cohérentes et une jonction est relocalisée sur les sites de diapédèse. Les bords des neutrophiles transmigrés sont délimités en jaune.À la suite de cette procédure, la migration endothéliale trans des leucocytes peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires telles que si les leucocytes traversent l’endothélium en utilisant le bagga ou la racine transcellulaire.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ici, nous décrivons un non-invasive à deux photons approche microscopique (2P) pour l'étude des leucocytes homing dans le coussinet plantaire de la souris. Nous discutons des aspects techniques de notre préparation imagerie des tissus et de marcher le lecteur à travers une expérience typique de la configuration initiale à la collecte de l'exécution et des données.

L&#39;imagerie non invasive des Homing leucocytes et des migrations In vivo</em

C'est une méthode pour visualiser l'adhésion des leucocytes à l'endothélium dans les vaisseaux sous pression récoltés. La technique permet l'étude de l'adhérence vasculaires sous flux de cisaillement avec différentes pressions intraluminale jusqu'à 200 mmHg donc imitent-ment les conditions physiopathologiques de l'hypertension artérielle.

Adhésion leucocytaire imagerie de l&#39;endothélium vasculaire au Haute pression intraluminale

Nous décrivons un protocole de fond clair microscopie intravitale pour la mesure dynamique des interactions cellulaires des neutrophiles-endothélium lors du recrutement des neutrophiles en réponse à la source d'un facteur chimiotactique des neutrophiles in vivo. Neutrophiles ramper intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus de souris crémaster sont visualisés avec la photographie vidéo en temps-caduque et suivis avec ImageJ.

Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo

Cet article décrit tout d'abord une procédure pour isoler les cellules endothéliales humaines de veines ombilicales puis montre comment utiliser ces cellules pour examiner la transmigration des neutrophiles dans des conditions d'écoulement. En utilisant une chambre d'écoulement à faible volume faite d'un polymère avec des caractéristiques optiques de verre, des cellules vivantes d'imagerie de fluorescence de populations de cellules rares est également possible.

Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l&#39;étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d&#39;écoulement

Nous rapportons ici une technique expérimentale de la microscopie de fluorescence intravitale de visualiser hétérotypiques plaquettes neutrophiles interactions sur l'endothélium activé lors de l'inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes. Cette technologie microscopique seront très utiles pour étudier le mécanisme moléculaire de la maladie vasculaire et de tester des agents pharmacologiques dans des conditions physiopathologiques.

Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l&#39;endothélium activé lors de l&#39;inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

L’immunité adaptative est contrôlée par des 'synapses immunologiques' dynamiques formées entre les lymphocytes T et les cellules présentatrices d’antigènes. Ce protocole décrit des méthodes d’étude des cellules endothéliales à la fois en tant qu’APC physiologiques sous-étudiées et en tant que nouveau type de « modèle d’APC cellulaire planaire ».

Une cellule endothéliale Planar Modèle for Imaging Dynamics Synapse immunologique

Nous détaillons un protocole pour surveiller le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et dans des conditions inflammatoires en utilisant la microscopie confocale intravitale sur des souris anesthésiées.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Leucocytes avidement interagissent avec les cellules vasculaires et plaquettes après blessure de mur de navire ou lors d’une inflammation. Nous décrivons ici un simple test à flux laminaire pour caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires.

Analyses d’enquêter sur le recrutement des leucocytes sur les cellules vasculaires et plaquettes adhérentes à flux laminaire

Nous présentons ici un protocole intégré qui mesure la sous-population de monocyte traite sous flux in vitro par l’utilisation de marqueurs de surface spécifiques et la microscopie confocal fluorescence. Ce protocole peut être utilisé pour explorer les étapes séquentielles de recrutement aussi bien quant à profil autres sous-types de leucocytes à l’aide d’autres marqueurs de surface spécifiques.

Étude simultanée du recrutement des sous-populations de Monocyte sous flux In Vitro

Dans ce protocole, un test de microfluide biomimétique, qui peut reproduire un environnement microvasculaire physiologiquement pertinent et reproduire l’ensemble de la cascade d’adhésion / migration des leucocytes, est utilisé pour étudier les interactions leucocytes-cellules endothéliales dans les maladies inflammatoires.

Un système microphysiologique pour étudier l’interaction leucocytaire-endothéliale pendant l’inflammation

Découvrez l'imagerie en temps réel des jonctions endothéliales VE-cadherine et PECAM-1 pendant la transmigration des neutrophiles sous débit physiologique. Cette méthode permet de différencier les voies paracellulaire et transcellulaire.

Imagerie en temps réel des jonctions endothéliales cellule-cellule Pendant neutrophiles Transmigration Sous physiologique débit

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