L'imagerie de fluorescence avec un nanomètre Précision (FIONA)

L’objectif général de cette procédure est de démontrer comment réaliser une imagerie de fluorescence avec une précision d’un nanomètre ou des expériences Fiona. Pour ce faire, il faut d’abord mettre en place l’équipement requis et aligner l’optique pour la réflexion interne totale, la fluorescence, la microscopie ou le gazon. L’étape suivante consiste à immobiliser CY 3D NA sur la surface interne d’une chambre d’échantillon et à localiser des molécules uniques de CY 3D NA avec une précision nanométrique.

Par la suite, Fiona est appliquée à l’étude du mouvement d’un seul moteur myosine tronqué cinq un moteur marqué par une boîte quantique. En fin de compte, la taille du pas de la myosine lorsqu’elle marche, Acton a été mesurée à 36 nanomètres par l’analyse de Fiona. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des moteurs moléculaires, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que le suivi des récepteurs sur la membrane des cellules.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les détails expérimentaux sont difficiles à apprendre. Il est important de porter des lunettes de sécurité laser à tout moment pendant la configuration. Pour la réflexion interne totale, la fluorescence, la microscopie ou le gazon.

Pour commencer, réglez la hauteur de tous les composants optiques à la hauteur du centre du microscope, du port arrière, de la monture du laser, de l’obturateur laser et des filtres ND. Utilisez des filtres ND pour atténuer la puissance du laser aussi bas que possible tout en gardant le faisceau visible. Serrez les vis avec les clés hexagonales appropriées.

Planifiez une trajectoire de faisceau comme illustré par les lignes bleues pointillées. Dans ce schéma, marquez le trajet du faisceau avec du ruban adhésif ou un marqueur sur la table optique. Placez le miroir M1 au premier tour à angle droit, placez les deux iris le long de la deuxième section droite de la trajectoire de faisceau prévue.

Ajustez à la fois la position et l’inclinaison de M1 de manière à ce que le laser passe à travers le miroir de position de l’iris M deux. Au deuxième virage à angle droit, placez l’extenseur de faisceau 10 x le long de la troisième section droite de la trajectoire. Ajustez son inclinaison de sorte que l’expanseur de faisceau soit parallèle à la fois à la table optique et à la trajectoire de faisceau prévue.

L’étape suivante consiste à ajuster M1 et M deux de manière itérative de sorte que le laser passe directement par les centres des deux lentilles, L un et L deux de l’expanseur de faisceau. Utilisez une feuille de papier blanc pour bloquer le faisceau après l’expanseur de faisceau afin de vérifier le profil du faisceau à l’œil nu. Ajustez jusqu’à ce que le profil du faisceau expansé soit non ED.

Gaussian ajuste la distance entre L un et L deux de sorte que le faisceau soit assemblé obturateur. Le laser dévisse l’objectif du microscope et vissez un alignement fluorescent. Placez les miroirs cibles M trois et M quatre pour diriger le faisceau expansé dans le port du microscope et sur le miroir dichroïque.

À l’intérieur de la tourelle. Ajustez M trois pour centrer la partie la plus brillante du faisceau sur la cible fluorescente et M quatre pour faire basculer le faisceau à la verticale, obturez le laser et revissez l’objectif. Bien. Ajustez les inclinaisons de M trois et M quatre pour optimiser la puissance du laser et le profil du faisceau hors de l’objectif.

Montez une caméra E-M-C-C-D sur le microscope et connectez la caméra à un ordinateur. Démarrez le logiciel de l’appareil photo. Fixez un échantillon fluorescent sur le microscope.

Regardez le point fluorescent brillant sur l’appareil photo. Vérifiez que le spot ne se déplace pas sur l’écran car la mise au point a changé. Placez l’objectif TIR sur la platine de translation XY, Z à une distance du plan focal arrière de l’objectif qui est égal à la distance focale, le L trois, qui est d’environ 30 centimètres.

Ajustez la position de L trois de sorte que le laser passe par le centre de la lentille. Déplacez L trois le long de la trajectoire du faisceau pour ajuster l’assemblage du faisceau. Assurez-vous que le faisceau est toujours centré sur le moniteur et de forme symétrique.

Déplacez L trois perpendiculairement à la trajectoire du faisceau pour incliner le faisceau hors de l’objectif. Continuez à traduire l’objectif TIR de manière à ce que le TIR soit réalisé avant d’effectuer une Fiona. Expérimentation sur la localisation et la mobilisation de CY 3D NA. Les molécules uniques construisent des chambres d’échantillonnage comme détaillé dans le texte du protocole.

Deux bandes de ruban adhésif double face sont appliquées sur la diapositive le long des bords longs, en laissant un espace de trois à cinq millimètres au centre, puis une lamelle de couverture nettoyée est placée sur le dessus de la diapositive Des vues latérales de la chambre de droite et de face sont montrées. Les extrémités ouvertes de la chambre sont laissées ouvertes et servent d’entrée et de sortie pour immobiliser SI 3D NA sur les surfaces intérieures de la chambre d’échantillonnage. Pipette 10 microlitres de biotine BSA dans la chambre.

Attendez cinq minutes. Lavez la chambre d’échantillonnage en pipetant 40 microlitres de T 50 BSA dans la chambre. Ensuite, pipetez 10 microlitres de neut travain dans la chambre et incubez pendant cinq minutes.

Lavez à nouveau la chambre avec 40 microlitres de pipette T 50 BSA, 20 microlitres de SI 3D NA dans la chambre d’échantillonnage et incubez pendant cinq minutes. Enfin, lavez la chambre avec 80 microlitres de T 50 BSA. Pour commencer la procédure d’imagerie de molécules uniques SI 3D NA sous gazon M, pipetez 30 microlitres de tampon d’imagerie dans la chambre d’échantillonnage et attendez huit à 10 minutes.

Montez l’échantillon pour l’imagerie sur un microscope sur gazon équipé d’un laser vert, d’un objectif à immersion dans l’huile 100 X et d’une caméra E-M-C-C-D. Réglez le temps d’exposition et le gain EM. Acquisition d’une vidéo de l’échantillon pour 1000 images.

Compilez et exécutez Fiona Pro pour l’analyse Fiona. Utilisez ce programme IDL pour importer l’image acquise, pour saisir la taille effective des pixels et le facteur de conversion de l’intensité en nombre de photons, et pour choisir des points pour l’analyse Fiona. À la fin, le programme produira les résultats d’ajustement avec des fonctions gaussiennes 2D ainsi que le nombre total de photons et la précision de localisation pour compiler et exécuter le comptage du pH pro.

Pour caractériser le nombre de photons, utilisez ce programme DL pour mesurer le nombre moyen de photons émis par une flore. Quatre avant le blanchiment des photos pour importer l’image acquise et saisir le facteur de conversion de l’intensité en nombre de photons. Le programme détectera les points fluorescents, calculera automatiquement le nombre de photons en fonction du nombre d’images et affichera les traces du nombre de photons.

Préparez l’échantillon pour cette expérience en pipetant 20 microlitres de BSA biotinylé à raison d’un milligramme par millilitre de DD H2O dans une chambre d’échantillonnage. Incuber pendant 10 minutes. Rincer avec 30 microlitres de D ddh, deux pipettes O dans 0,5 milligramme par millilitre de neut travain et incuber pendant deux minutes.

Lavez la chambre avec 30 microlitres de M cinq PSA. L’acte pour cette expérience doit être préparé la veille, comme décrit dans le texte du protocole. Diluez l’actine préparée 25 fois en général, tamponnez d’actine jusqu’à une concentration finale d’environ 0,004 milligramme par millilitre.

Pipetez la solution d’actine dans la chambre et attendez 10 minutes. Rincez la chambre avec 30 microlitres de tampon diluez la myosine cinq A avec des étiquettes de drapeau par 30. Pliez un tampon M cinq à une concentration finale de 250 nanomolaires.

Mélangez un microlitre de myosine diluée avec un microlitre d’Anti-Flag Q.Do 7 0 5. Ajoutez huit microlitres de M cinq à remplir à 10 microlitres et pipetez de haut en bas pour mélanger. Bien incuber pendant 10 minutes sur glace.

Pipette de 20 microlitres de tampon d’imagerie contenant du point Q de myosine dans la chambre de l’échantillon. Incuber pendant huit à 10 minutes. Imagez l’échantillon au microscope sur gazon à une exposition de 30 millisecondes.

Acquérir au moins 1000 images pour commencer l’analyse des données. Ouvrez le fichier vidéo dans l’image J et recadrez la vidéo autour d’un point mobile. Suivez le spot tout au long de la vidéo pour générer des coordonnées X et Y dans le temps en pixels en appliquant l’analyse Fiona à chaque image de la vidéo.

Convertissez les pixels en nanomètres comme décrit dans le texte du protocole. Calculez le déplacement par rapport à la position initiale en fonction du temps. Effectuez un test T sur le déplacement pour obtenir les pas de marche à la myosine.

Supprimez toutes les valeurs zéro de la colonne de taille de pas. Tracez la distribution des tailles de pas à l’aide de origin ou de matlab. Ajuster une gaussienne à l’histogramme.

Dans cette image typique de l’immobilisation de surface SI 3D NA. La flèche jaune pointe vers une seule molécule SI 3D NA dont la fonction d’étalement ponctuel ou PSF est illustrée ici. La PSF est équipée d’une fonction gaussienne bidimensionnelle, et les résidus d’ajustement sont également illustrés. Ce graphique est une trace typique du nombre de photons en fonction du nombre d’images et l’ajustement exponentiel donne le nombre moyen de photons d’environ 1,4 fois 10 à la sixième pour mesurer la taille du pas de myosine un fichier vidéo avec un bon rapport signal/bruit d’une seule myosine.

Au cours de sa marche, un filament d’actine est capturé. Trois exemples de cadres sont présentés. L’application de Fiona à chaque image donne une distance en fonction de la trace temporelle tracée en rouge.

Un algorithme de recherche d’étapes basé sur le test T est utilisé pour extraire les étapes individuelles et la sortie est superposée en blanc, les tailles de pas et les nanomètres sont étiquetés en blanc. Lorsque les pas de plusieurs traces sont combinés dans un histogramme, les tailles de pas mesurées sont distribuées gaussiennes environ 35,8 plus ou moins 0,4 nanomètres. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser les expériences de Fiona, y compris la configuration d’un microscope de gazon Pour obtenir les meilleurs résultats Avec ces procédures, il est important de minimiser les dommages photographiques à l’utilisation de la force du sol et aux expériences.

N’oubliez pas que travailler avec la microscopie du gazon et Fiona peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des lunettes de sécurité doivent être portées lors de cette procédure.