Name: Isolement de lARN de souris Pancréas: un tissu de Ribonuclease riche (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Apprenez à isoler l'ARN de haute qualité à partir du pancréas de souris riche en ribonucléases. Cette méthode utilise un réactif de lyse et un inhibiteur de RNase pour obtenir un nombre d'intégrité ARN supérieur à sept.

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Nous remercions Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo et Satyanarayana Rachagani pour leurs commentaires utiles, des suggestions et le partage de leurs protocoles. Ce travail a été soutenu par U01CA111294 de subvention et un prix Idée de développement du Programme de recherche intra-muros Ohio State University.

1. Préparation Les pratiques suivantes adhèrent aux politiques établies par soin et l&#39;utilisation des animaux Comité de l&#39;institution (IACUC). <ol><li> Il est recommandé d&#39;isoler pas plus de 6 pancréas de souris en un jour donné. Vous avez tous les instruments chirurgicaux propres et autoclave, un jeu par animal. </li><li> Étiqueter tous les microtubes. Quatre tubes de 2 ml par animal. </li><li> Placer 8 ml de réactif de lyse dans 50 ml tubes de centrifugation sur la glace. Remarque: Bien que le kit de purification est livré avec un réactif au phénol de thiocyanate de guanidine qui est approprié pour l&#39;isolement du pancréas, le réactif de lyse est employé en raison de l&#39;importance des volumes qui sont nécessaires pour l&#39;isolation. </li><li> Distribuer environ 10 ml des solutions suivantes dans 15 ml tubes de centrifugation pour nettoyer les pales de l&#39;homogénéisateur. L&#39;éthanol, 70% (2 tubes), de l&#39;eau de qualité HPLC (1 tube) et de l&#39;eau de qualité HPLC contenant environ 200 pi de RNase extérieur ou ribonucléase inactivator équivalent. </li></ol&gt; 2. Chirurgie, Pancréas Dissection et homogénéisation <ol><li> Placez 1-2 ml d&#39;isoflurane dans un bocal contenant gaze de coton ou du papier absorbant. Les souris sont placées sur une plate-forme qui les empêche d&#39;atteindre la source de l&#39;isoflurane. Ajouter isoflurane frais dans le pot avant d&#39;anesthésier chaque souris. </li><li> Placez délicatement la souris dans le bocal contenant la isoflurane. Boucher le pot et surveiller les effets de l&#39;anesthésie en tournant doucement le pot avant et en arrière. L&#39;animal est anesthésié une fois qu&#39;il est dans l&#39;incapacité de se tenir dans sa &#39;propre. </li><li> Pour confirmation de l&#39;anesthésie, enlever l&#39;animal de la jarre et appliquer un pincement de l&#39;orteil entreprise. Si la souris ne réagit pas au pincement de l&#39;orteil, passez à l&#39;étape 2.5. </li><li> Si la souris réagit au pincement de l&#39;orteil, puis répétez les étapes 2.2 à 2.3. </li><li> Placez l&#39;animal anesthésié sur la paillasse en position couchée. Disloquer le col de la souris en plaçant bien la main gauche sur le col de la souris. Noustion de la main droite saisir la queue de la souris et rapidement tirer vers le haut à un angle d&#39;environ 45 ° à disloquer le col de l&#39;utérus. </li><li> Fixer la carcasse à une surface (un morceau de mousse de polystyrène recouvert de niveau avec des serviettes en papier) en perçant chacun des quatre pattes de l&#39;animal dans la surface plane en utilisant jauge 25 aiguilles hypodermiques. </li><li> Utilisation d&#39;instruments chirurgicaux stériles, couper la partie centrale de la souris et retirez le pancréas de la souris rapidement. Utilisez la pince pour tenir le pancréas et le couper de la rate et l&#39;intestin grêle avec des ciseaux à ressort. Veillez à ne pas étirer le pancréas lors de l&#39;enlèvement de la souris. Perturbation des tissus pourrait libérer ribonucléase. Remarque: Le temps qu&#39;il faut pour éliminer le pancréas de la souris est indispensable. Un homme du métier devrait être capable de disséquer le pancréas en environ 1 min ou moins. </li><li> Placer l&#39;ensemble du pancréas dans un tube de 50 ml contenant 8 ml de glace froid réactif de lyse. Boucher le tube et agiter brièvement à plonger le tiuestion dans le réactif et passer à l&#39;étape suivante sans retard. Le rapport de réactif de lyse de tissu est critique. Voir la section des résultats d&#39;une comparaison de l&#39;intégrité de l&#39;ARN isolé en utilisant différents volumes de réactif de lyse. </li><li> Homogénéiser pendant 5 sec. Il est important de presser les lames d&#39;homogénéisation au fond du tube de centrifugation pour permettre au tissu d&#39;être tiré dans les pales d&#39;homogénéisation efficace. </li></ol> 3. L&#39;élimination des tissus non digérés Note: Après l&#39;homogénéisation, de petits morceaux de tissu restent dans le réactif de lyse. Il est plus important pour lyser rapidement le tissu en laissant un peu de tissu non digéré plutôt que sur l&#39;homogénéisation et la dégradation des risques de l&#39;ARN. <ol><li> Transférer 2 ml de réactif de lyse contenant du pancréas lysées à un tube de microcentrifugation de 2 ml. Recueillir deux microtubes d&#39;homogénat par l&#39;isolement. Jeter le broyat ou magasin restant à -80 ° C pour de futures études. </li><li> Centrifuge à 4 ° C, 12 000 g pendant 5 min pour sédimenter les tissus non digérés. Il s&#39;agit d&#39;une étape essentielle dans le report des tissus non digérés dans les solutions suivantes de l&#39;ARN sera probablement contaminer l&#39;échantillon avec la ribonucléase (étape 5.13). </li><li> Transfert 1 ml du surnageant dans un tube de 2 ml à centrifuger. Procéder à l&#39;isolement immédiatement et stocker le tube répliqué à -80 ° C pour une utilisation future. Placer tous les tubes contenant homogénat sur de la glace tout en procédant à l&#39;étape suivante. </li><li> Éliminer le réactif de lyse restant dans un réceptacle de déchets chimique approprié. </li></ol> 4. Nettoyage des lames Homogénéisateur <ol><li> Avant de passer à la prochaine isolement, nettoyer les pales du homogénéisation en les plaçant dans 10 ml d&#39;éthanol à 70%. Activez l&#39;homogénéisation pendant environ 20 secondes pour enlever les morceaux de tissu qui peut être pris dans les pales. </li><li> Utiliser un embout de pipette 200 ul à enlever tous les morceaux qui restent dans les lames de homogénéisation. </li&gt; <li> Répétez l&#39;étape 4.1 dans l&#39;eau, inactivator général RNase et 70% d&#39;éthanol. Sécher l&#39;arbre d&#39;homogénéisation avec un chiffon propre Kim. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.1 pour l&#39;isolement du pancréas des animaux restants, ARN garder isolés les uns séparés des animaux plutôt que la mise en commun de l&#39;ARN. </li></ol> 5. RNA La section suivante est identique au protocole de la trousse de purification. L&#39;avantage du kit de purification, c&#39;est qu&#39;il va isoler l&#39;ARN total, y compris les petits ARN. <ol><li> Si vous utilisez une solution de broyât congelé, décongeler sur la glace humide et laisser reposer à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Ajouter 200 ul de chloroforme, boucher le tube et agiter vigoureusement à la main pendant 15 secondes. Laissez le tube reposer à température ambiante pendant 2-3 min. </li><li> Centrifuger pendant 15 min à 12 000 xg, 4 ° C. </li><li> Transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube à centrifuger. Ajouter 1,5 volume d&#39;isopropanol et mélanger par pipetage de haut en bas plusieurs fois. </li><li> Transférer jusqu&#39;à 700 ul de l&#39;échantillon dans une colonne de centrifugation qui est placé dans un tube de collecte de 2 ml. Fermez le couvercle et centrifuger à 8000 g pendant 15 sec à température ambiante. </li><li> Jeter l&#39;effluent à travers. </li><li> Répéter les étapes 5.5 à 5.6, en utilisant le reste de l&#39;échantillon. </li><li> Ajouter 700 ul de tampon RTT à la colonne. Centrifuger pendant 15 s à 8000 x g. Jeter l&#39;effluent à travers. </li><li> Déposer 500 pi de tampon RPE dans la colonne. Centrifuger pendant 15 secondes à 8000 x g pour laver la colonne. Jeter l&#39;effluent à travers. </li><li> Ajouter 500 ul de tampon RPE à la colonne. Centrifuger pendant 2 min à 8000 xg pour sécher la colonne. </li><li> Transférer la colonne de centrifugation dans un tube de centrifugation de 1,5 ml. Pipette 80 pi d&#39;eau libre ribonucléase directement sur la membrane de la colonne. Centrifuger pendant 1 min à 8000 x g pour éluer l&#39;ARN. </li><li> Ajouter un inhibiteur de la RNase 1 ul de la solution d&#39;ARN. Stocker à -80 ° C ou procéder à 5.13. </li><li> Pour valider l&#39;intégrité de l&#39;ARN, d&#39;abord calculer la conce ARNntration et 260/280 taux à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre. </li><li> Diluer une partie de la solution d&#39;ARN à environ 500 ng / ul avec de l&#39;eau de qualité biologie moléculaire. </li><li> Déterminer l&#39;ARN intégrité (c&#39;est-à-RIN) en utilisant une analyse par électrophorèse capillaire. Environ 5 ul de solution d&#39;ARN est suffisante pour l&#39;analyse. </li><li> Aliquoter la solution d&#39;ARN (voir la figure 2) et conserver à -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).</li>
<li>Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+ribonucleic+acid+from+sources+enriched+in+ribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.</a> Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+versatile+method+for+isolation+of+high-quality+RNA+from+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas.</a> Biotechniques. 52, 332-334 (2012).</li>
<li>Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+program+in+the+response+of+human+fibroblasts+to+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum.</a> Science. 283, 83-87 (1999).</li>
<li>Lenstra, J. A., Beintema, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sequence+of+mouse+pancreatic+ribonuclease.+Extremely+rapid+evolutionary+rates+of+the+myomorph+rodent+ribonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry++FEBS%22%5BJournal%5D)">The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases.</a> European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).</li>
<li>Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+situ+ductal+perfusion+to+facilitate+isolation+of+high-quality+RNA+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas.</a> Biotechniques. 40, 617-621 (2006).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRio%2C+DC+%22RNA+A+Laboratory+Manual%22">RNA A Laboratory Manual</a>. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments++JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Isolement de l&#39;ARN à partir de tissus qui sont ribonucléase riche représente un grand défi pour les expériences de biologie moléculaire. Différents réactifs et des kits sont disponibles dans le commerce qui sont principalement basées sur la méthode phénol thiocyanate de guanidine de l&#39;extraction de l&#39;ARN. Le thiocyanate de guanidine dénature les protéines et réduit l&#39;activité de la ribonucléase ainsi. Toutefois, l&#39;ampleur de la ribonucléase dans le pancréas nécessite des modifications supplémentaires...

Isolement de l&#39;ARN avec une haute intégrité est nécessaire pour des expériences de biologie moléculaire de routine telles que le nord-blot 9, qRT-PCR 1 ou profils d&#39;expression génique 5. La plupart des méthodes contemporaines de l&#39;isolement de l&#39;ARN sont fondées sur des modifications des protocoles de thiocyanate de guanidine 2, 3. Guanidine thiocyanate est un dénaturant de protéines forte et efficace de perturber l&#39;activité de la ribonucléase dans la plupart des conditions. La méthode populaire de Chomczynski et Sacchi 3 phénol combiné à la solution de thiocyanate de guanidine de lyse, ce qui réduit le temps d&#39;isolement à environ 4 heures. Disponibles dans le commerce de nombreux réactifs d&#39;extraction d&#39;ARN sont basées sur la méthode de Chomczynski et Sacchi 3. Ribonucléase tissus riches comme humain ou de souris pancréas présente un défi supplémentaire pour isoler l&#39;ARN. Pancréas de souris peut contenir jusqu&#39;à 75 mg de ribonucléase 6 dont certains seront publiés During perturbation du tissu pancréatique résultant en l&#39;autolyse des tissus. Des modifications des protocoles guanidine thiocyanate ont été utilisés avec succès pour isoler l&#39;ARN à partir du pancréas avec une grande intégrité de 2, 4, 7, 10. Infusion d&#39;ARN réactif de stabilisation dans le pancréas de souris isolement facilité de l&#39;ARN avec une haute intégrité 4, 7, 10, cependant infusion de solutions dans le pancréas nécessite une grande habileté, peuvent nécessiter des instruments spécialisés, tels que un microscope à dissection et une rupture de l&#39;architecture des tissus au cours de la procédure peut se traduire par la lyse cellulaire. Tissu perfusion avec le réactif de stabilisation de l&#39;ARN pourrait interférer avec d&#39;autres applications, y compris l&#39;isolement des protéines et coloration histologique. De plus, cette technique n&#39;est pas adaptée pour isoler l&#39;ARN à partir de pancréas humain. D&#39;autres protocoles nécessitent la préparation de solutions spécifiques par l&#39;enquêteur 2. Nous rapportons un protocole pour isoler l&#39;ARN avec une haute intégrité du pancréas de souris. Thprotocole e utilise des éléments de méthodes déjà publiées et repose en grande partie sur les protocoles réactifs standards phénol / guanidine thiocyanate base-lyse. Il ne nécessite pas la préparation de solutions spécialisées et ne nécessite pas la perfusion de réactifs dans le pancréas. Les étapes critiques pour l&#39;isolement de l&#39;ARN avec succès comprennent un phénol / à base de guanidine réactif de lyse rapport élevé de tissu, des prélèvements de tissus non digérée avant la séparation de phase et l&#39;inclusion d&#39;un inhibiteur de ribonucléase à la solution d&#39;ARN résultant. Utilisation de ceux-ci et d&#39;autres modifications, on isole l&#39;ARN avec RIN typiquement supérieur à 7 à utiliser en routine analyse de l&#39;expression génique.

<table><tbody><tr><td>Puissance Gen 500&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-261-03&nbsp ;</td><td>Homogénéisateur</td></tr><tr><td>5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Microcentifuge réfrigéré</td></tr><tr><td>Réactif de trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Réactif de lyse</td></tr><tr><td>Student Vannas ciseaux à ressort</td><td>Fisher</td><td>91500-09&nbsp ;</td><td>Utiliser pour couper le pancréas des tissus attachés</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux, 6 pouces</td><td>Fisher</td><td>08-951-20</td><td>À utiliser pour couper l’épilation de la souris</td></tr><tr><td>Pince à extrémité arrondie</td><td>Fisher</td><td>1381239</td><td>Utiliser pour tenir le pancréas pendant la dissection</td></tr><tr><td>Isoflurane USP</td><td>Abbott Labs</td><td>4/8/5210</td><td>Anesthésique</td></tr><tr><td>Rnase sortie (40 U/&micro ; l)</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>Rnase inhbitor</td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>Ambion</td><td>10328-011</td><td>General Rnase inactivateur</td></tr><tr><td>d’eau de qualité HPLC</td><td>Fisher</td><td>W5-4</td><td>Pour le lavage des lames d’homogénéisateur</td></tr><tr><td>Eau de qualité biologie moléculaire</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.03</td><td>Élution de l’ARN</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td> Kit de <td>purification</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de 217004 QiagenTubes à centrifuger de 2 ml, certifiés sans Rnase Dnase</td><td>USA Scientific Plastics</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>70 % éthanol</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 % éthanol</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &micro ; l pointes de pipette</td><td>Rainin</td><td>GPL200F</td><td>Pour le nettoyage des lames d’homogénéisateur</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-1000</td><td>Spectrophotomètre</td></tr><tr><td>Bioanalyseur</td><td>Agilent</td><td></td><td>Analyseur d’électrophorèse capillaire pour mesurer l’intégrité de l’ARN</td></tr><tr><td>ARNAlater</td><td>Ambion</td><td></td><td>RNA Stabilization Reagent&nbsp ;</td></tr><tr><td>RNeasy&nbsp ; colonnes de rotation&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Spins colonnes&nbsp ; dans le cadre du kit miRNeasy Mini Mice</td></tr><tr><td></td><td>Chales</td><td>River Strain C57BL/6</td><td>Leur âge variait de 4 à 12 mois. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Souris&nbsp ;</td><td>Jackson Lab</td><td>souche 129</td><td>Leur âge variait de 4 à 12 mois. &nbsp ;</td></tr></tbody></table>

isolement de l&#39;arn de souris pancréas: un tissu de ribonuclease riche

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

L’isolement d’ARN de haute qualité à partir de tissus riches en ribonucléases tels que le pancréas de souris présente un défi. Comme l’une des fonctions principales du pancréas est d’aider à la digestion, le pancréas de souris peut contenir jusqu’à 75 mg de ribonucléase. Nous rapportons des modifications des protocoles standard de réactifs de lyse du thiocyanate de phénol/guanidine pour isoler l’ARN du pancréas de souris. Le thiocyanate de guanidine est un puissant dénaturant protéique et perturbera efficacement l’activité de la ribonucléase dans la plupart des conditions. Cependant, des modifications critiques des protocoles standard sont nécessaires pour isoler avec succès l’ARN des tissus riches en ribonucléases. Les étapes clés comprennent un rapport réactif/tissu de lyse élevé, l’élimination des tissus non digérés avant la séparation de phase et l’inclusion d’un inhibiteur de ribonucléase dans la solution d’ARN. À l’aide de ces modifications et d’autres, nous isolons régulièrement les ARN dont l’indice d’intégrité de l’ARN (RIN) est supérieur à 7. L’ARN isolé est de qualité appropriée pour l’analyse de routine de l’expression génique. L’adaptation de ce protocole pour isoler l’ARN des tissus riches en ribonucléases en plus du pancréas devrait être facilement réalisable.

Le rendement total de l'ARN à partir de 1 ml d'homogénat de lyse est de 20 à 40 ug. DO 260/280 ratios sont généralement autour de 2,0 et le RIN sont constamment supérieur à 7,0. Si le RIN est ≤ 6, l'isolement devra être répétée. De temps en temps, un RIN qui est supérieure à 8,0 est atteint. Les deux méthodes les plus couramment utilisées pour euthanasier les souris avant le retrait du pancréas sont le CO 2 asphyxie ou par inhalation d'isoflurane. Les deux techniques sont suivies ...

Nous rapportons une procédure permettant d’isoler l’ARN avec une grande intégrité du pancréas de souris riche en ribonucléases.

Isolement de l&#39;ARN de souris Pancréas: un tissu de Ribonuclease riche

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler l’ARN avec une grande intégrité du pancréas de souris à crête de ribonucase. Pour ce faire, on retire rapidement le pancréas de la carcasse d’une souris euthanasiée. Ensuite, le pancréas a été immergé dans le réactif de lyse et le tissu est homogénéisé.Après la centrifugation, l’ARN est isolé du surnageant à l’aide de protocoles standard et la solution inhibitrice d’ARN est ajoutée à la solution finale d’ARN. La dernière étape consiste à nettoyer soigneusement les lames de l’homogénéisateur en enlevant tous les morceaux de tissu coincés dans les lames, puis en effectuant une série de lavages à l’éthanol et à l’eau. En fin de compte, cette procédure permet d’isoler l’ARN du pancréas de souris dont le nombre d’intégrité de l’ARN est supérieur à sept pour l’analyse de routine de l’expression génique.Je m’appelle Tom Schmid et je travaille avec l’ARN depuis plus de 20 ans, et pendant tout ce temps, je n’ai rien connu d’aussi difficile que d’isoler l’ARN avec une grande intégrité pour le pancréas de souris. La technique que nous allons vous montrer a été développée pour le pancréas de souris, mais il n’y a vraiment aucune raison pour qu’elle ne puisse pas être utilisée pour une variété d’autres tissus, y compris les tissus de cellules humaines, les lignées cellulaires ou d’autres tissus de souris, y compris les tissus riches en nucléases des côtes tels que la rate. L’utilisation des suggestions de ce protocole vous permettra d’isoler l’ARN avec une grande intégrité du pancréas de souris.Cela pourrait être utilisé pour de nombreuses applications en aval telles que QPCR, les réseaux d’expression génique ou le RNA-Seq. Ola Elgamal. Un étudiant diplômé de mon laboratoire fera la démonstration de cette technique après avoir euthanasié la souris comme décrit dans le protocole textuel.Fixez la carcasse en perçant chacune des pattes de l’animal dans une surface plane à l’aide d’aiguilles hypodermiques de calibre 25 à l’aide d’instruments chirurgicaux stériles. Ouvrez la section médiane de la souris et retirez rapidement le pancréas de la souris. Utilisez la pince pour tenir le pancréas et coupez-le de la rate et de l’intestin grêle à l’aide de ciseaux à ressort.Attention à ne pas étirer le pancréas lors du retrait de la souris. La perturbation du tissu pourrait libérer de la ribonucléase. Placez le pancréas entier dans un tube de 50 centimètres cubes contenant huit millilitres de réactif de lyse glacé.Fermez le tube et secouez-le brièvement pour immerger le tissu dans le réactif et passez immédiatement à l’étape suivante sans délai. Ensuite, homogénéisez le pancréas pendant cinq secondes. Il est important d’appuyer les pales de l’homogénéisateur sur le fond du tube de centrifugation pour permettre au tissu d’être aspiré dans les pales pour une homogénéisation efficace.Pour éliminer les tissus non digérés, transférez deux millilitres de réactif de lyse contenant le pancréas lysé dans un microtube à centrifuger de deux millilitres. Prélever deux microtubes de centrifugation d’homogénat par centrifugeuse d’isolement à quatre degrés Celsius, 12 000 fois G pendant cinq minutes pour granuler le tissu non digéré. Il s’agit d’une étape cruciale, car le transfert de tissus non digérés dans des solutions ultérieures d’ARN contaminera probablement l’échantillon avec de la ribonucléase.Nettoyez les lames de l’homogénéisateur en les plaçant dans 10 millilitres d’éthanol à 70 %. Activez l’homogénéisateur pendant environ 20 secondes pour éliminer tous les morceaux de tissu qui pourraient se coincer dans les lames. Ensuite, utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres pour retirer tous les morceaux qui restent dans les lames de l’homogénéisateur.Nettoyez à nouveau les lames de l’homogénéisateur dans de l’eau, de l’ARN syn général activateur et de l’éthanol à 70 %. Enfin, séchez l’arbre de l’homogénéisateur avec une lingette Kim propre. Transférez un millilitre de SNA dans un microtube à centrifuger de deux millilitres.Placez tous les tubes contenant de l’homogénat sur de la glace humide tout en passant à l’étape suivante. Procédez immédiatement à l’isolement de l’ARN et conservez le tube répliqué à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Éliminer le réactif de lyse restant dans un récipient à déchets chimiques approprié.La section suivante utilise un kit de purification d’ARN. L’avantage du kit de purification est qu’il permet d’isoler les ARN totaux, y compris les petits ARN. Commencer l’isolement en ajoutant 200 microlitres de chloroforme à la solution d’homogénat.Boucher le tube et agiter vigoureusement à la main pendant 15 secondes. Laissez ensuite le tube reposer à température ambiante pendant deux à trois minutes après une centrifugation pendant 15 minutes à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius. Transférez la couche aqueuse supérieure dans un micro-tube à centrifuger.Ajouter 1,5 volume d’isopropanol et bien mélanger en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Transférez jusqu’à 700 microlitres de l’échantillon dans une colonne de centrifugation qui est placée dans un tube de collecte de deux millilitres. Fermez le couvercle et centrifugez à 8 000 fois G pendant 15 secondes à température ambiante, puis jetez le flux.Ensuite, ajoutez 700 microlitres de tampon RWT à la colonne de centrifugation et à la centrifugeuse. Comme précédemment, versez le flux à travers la pipette 500 microlitres de tampon RPE dans la colonne de centrifugation et centrifugez à nouveau pour laver la colonne. Après avoir jeté le flux, ajoutez encore 500 microlitres de tampon RPE dans la centrifugeuse à colonne de spin pendant deux minutes à 8 000 fois G.To sécher la colonne, transférez la colonne de spin dans une pipette à tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre 100 microlitres d’eau libre de noyau de nervure directement sur la centrifugeuse à membrane de colonne de spin pendant une minute à 8, 000 fois G pour éluer, l’ARN.Ajoutez ensuite un microlitre d’inhibiteur d’ARN à la solution d’ARN et procédez à la détermination de l’intégrité de l’ARN à l’aide de l’analyse par électrophorèse capillaire comme décrit dans le protocole de texte, la comparaison du nombre d’intégrité de l’ARN ou RIN de l’ARN isolé du pancréas de souris révèle une corrélation directe entre le volume de réactif de lyse utilisé dans l’homogénéisation et l’intégrité de l’ARN. Les résultats indiquent que huit millilitres de réactif de lyse doivent être utilisés Dans ce protocole, un inhibiteur de ribonucléase a été ajouté à la solution aqueuse d’ARN et l’intégrité de l’ARN a été comparée lors de la congélation et de la décongélation. Le RIN pour la solution d’ARN avec inhibiteur était de 7,3 plus ou moins 0,15 contre 2,9 plus ou moins 0,65 pour la solution qui ne contenait pas d’inhibiteur afin d’examiner la possibilité qu’une congélation-décongélation répétée dénature l’inhibiteur de la ribonucléase, le rendant inefficace.Une solution d’ARN contenant un inhibiteur de ribonucléase a été testée. Les solutions d’ARN qui ont été congelées et décongelées jusqu’à cinq fois ont tout de même produit un RIN de sept ou plus. Alors que les solutions qui ont été congelées et décongelées six fois ou plus ont produit un RIN inférieur à sept nombres premiers aléatoires, l’ADNC a été synthétisé à partir de l’ARN et l’expression de trois gènes d’entretien a été mesurée par QPCR.À l’aide de techniques standard, les données valident l’utilisation réussie de l’ARN pancréatique de souris dans une technique standard de biologie moléculaire. Une fois correctement formés, les étudiants des cycles supérieurs et les postdoctorants devraient être en mesure de terminer cette technique en 30 minutes environ. Et je veux juste vous parler un peu de la façon dont nous l’utilisons.Nous étudions des modèles murins transgéniques de cancer du pancréas et nous utilisons cette technique pour isoler l’ARN. Ensuite, lorsque nous obtiendrons l’ARN, nous étudierons l’expression génique des micro-ARN chez ces animaux.

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JoVE Journal

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Isolement murin îlots pancréatiques

Une description détaillée de la souris îlot isolement est décrit en utilisant la technique de la ponction du pancréas in situ canalaire et la perfusion d'une combinaison de collagénase purifiée et la protéase neutre.

Souris îlot de Langerhans isolement à l&#39;aide d&#39;une combinaison de la collagénase purifiée et protéase neutre

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des îlots à partir du modèle murin de diabète de type 2, Leprdb et les détails d’un test sur cellules vivantes pour la mesure de la sécrétion d’insuline à partir d’îlots intacts qui utilise la microscopie à 2 photons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

Dans les essais de colonies in vitro pour détecter l' auto-renouvellement et la différenciation des cellules progénitrices isolées à partir de pancréas de souris adultes sont mis au point. Dans ces essais, les progéniteurs du pancréas donnent naissance à des colonies de cellules dans un espace en 3 dimensions dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Les protocoles pour la manipulation des cellules individuelles et la caractérisation des colonies individuelles sont décrites.

In Vitro Colony Assays pour Caractériser les cellules progénitrices Tri-puissants Isolée des adultes murins Pancréas

Nous décrivons ici un protocole pour isoler les îlots intacts de souris néonatales. Pancreata ont été partiellement digéré avec de la collagénase, suivi d'un lavage et cueillette à la main. 20 - 80 amas d'îlots peuvent être obtenus par le pancréas de souris nouveau-nés, qui sont appropriés pour de nombreuses études d'îlots.

Isolation efficace des îlots fonctionnels de néonatales Pancréas souris

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

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Analyse transcriptomique unicellulaire de cellules endocrines pancréatiques de souris

Ici, nous décrivons l’immunoprécipitation des ribosomes et de l’ARN associé de populations choisies de cellules mâles adultes de germe de souris utilisant le système de RiboTag. La reproduction stratégique et l’immunoprécipitation soigneuse donnent des résultats propres et reproductibles qui informent sur le translatome des cellules germinales et donnent un aperçu des mécanismes des phénotypes mutants.

Immunoprécipitation de RiboTag dans les cellules germinales de la souris mâle

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Isolement de l'ARN de souris Pancréas: un tissu de Ribonuclease riche

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