Dissection et Immunocoloration Imaginal disques de Drosophila melanogaster

L’objectif global de cette procédure est de disséquer les disques imaginaux des larves de drosophile Pour l’immunohistochimie, cela est accompli en retirant d’abord le complexe de tête composé de la bouche, des crochets, de l’œil et des disques ténaux, et du cerveau des larves. La deuxième étape consiste à fixer le complexe de tête et à l’incuber avec des anticorps primaires et secondaires. Ensuite, l’œil et les disques ténaux sont séparés du complexe de la tête.

La dernière étape consiste à monter les disques imaginaux dans un agent anti-blanchiment sur une lame de verre. En fin de compte, les rapporteurs fluorescents ou LAC Z et la coloration des anticorps peuvent révéler l’expression spatiale et temporelle des gènes et des protéines dans les tissus imaginaires à l’aide de la microscopie à fluorescence. Bien que cette technique puisse être utilisée pour donner un aperçu de la localisation des gènes et des protéines dans le disque imaginaire enten.

Il peut également être appliqué à d’autres tissus imaginaires, tels que la patte alaire et l’arrêt. Ici. Pour commencer l’expérience, remplissez une boîte de Pétri de 35 millimètres avec un tampon de dissection. Placez 10 à 20 larves dans la boîte de Pétri et laissez-les nager pendant cinq minutes.

Pour vous nettoyer vous-même avec un parasite, votre pipette crée une grande flaque de tampon de dissection au milieu d’une plaque de dissection à base de silicone. Placez trois petits bassins autour du grand bassin et utilisez des pinces pour transférer les larves dans le bassin de fond. Ensuite, à l’aide de la pince numéro cinq, transférez une seule larve nettoyée de la petite mare à la plus grande mare de tampon de dissection.

Pour commencer la dissection grossière, utilisez une paire de pinces pour saisir les crochets buccaux et l’autre paire de pinces pour saisir les larves en douceur. À un tiers de la longueur de son corps, il maintient le crochet buccal stable. Retirez rapidement le reste du corps à l’aide d’une deuxième paire de pinces.

Libérez la larve de la pince et laissez les entrailles se répandre, permettant aux disques imaginaux de rester dans leur confirmation normale. Saisissez ensuite les crochets buccaux et utilisez l’autre paire de pinces pour retirer les deux tiers inférieurs des larves, y compris les entrailles intérieures. Ensuite, retirez doucement les glandes salivaires, les disques des jambes et d’autres tissus.

Les seuls tissus qui devraient rester sont une petite quantité de cuticule sus-jacente. Les crochets buccaux, les disques oculaires et ténaux, les hémisphères cérébraux et le ganglion ventral. Après un maximum de 20 minutes, transférez tous les tissus disséqués dans l’aldéhyde paraforme lysine paria.

Fixateur de date ou PLP. Ne laissez pas les disques imaginaux rester dans le tampon de dissection pendant plus de 20 minutes, sinon ils se dégraderont après la dissection. Transférez les tissus disséqués par incréments de 100 microlitres dans un verre de montre contenant du PLP froid.

Utilisez une paire de pinces pour vous assurer que les tissus disséqués sont complètement immergés. Incuber les tissus disséqués dans un fixateur PLP froid pendant 45 minutes à température ambiante sans agitation. Ensuite, transférez 100 microlitres de tissus disséqués du PLP dans le tampon de lavage.

Assurez-vous que les tissus sont complètement immergés et incubez-les à température ambiante sans agitation pendant 45 minutes. Transférez ensuite les tissus disséqués dans un tube de micro-fuge de 1,5 millilitre. Retirez le tampon de lavage et remplacez-le par 100 microlitres de solution de blocage.

Incuber les tissus à température ambiante avec une rotation douce sur un rotateur de table pendant 10 minutes. Après le blocage, retirez la solution et remplacez-la par 100 microlitres de solution d’anticorps primaires dans du sérum de chèvre 10 % normal. Incuber les tissus à température ambiante avec une rotation douce pendant 16 heures en fonction de la force de l’anticorps.

Ensuite, retirez l’anticorps primaire et remplacez-le par 750 microlitres de tampon de lavage. Placez le tube sur un mutateur à température ambiante pendant 10 minutes. Retirez le tube du mutateur et laissez les têtes se déposer au fond du tube.

Retirez ensuite le tampon de lavage et ajoutez 100 microlitres de solution d’anticorps secondaires dans du sérum 10 %Normal. Incuber le tube à température ambiante avec une rotation douce pendant au moins deux heures en fonction de la force de l’anticorps. Après l’incubation, retirez la solution d’anticorps secondaire du tissu.

Remplacez-le par 500 microlitres de tampon de lavage et laissez le mouchoir se déposer au fond du tube. Placez trois flaques de tampon de lavage sur une plaque de dissection en silicone. Transférez tous les tissus disséqués dans la grande flaque de tampon de lavage qui a été placée sur le plat de dissection.

Cela aide à éliminer l’excès d’anticorps secondaires pour commencer une dissection fine, placez le complexe de la tête côté ventral vers le bas et fixez la cuticule par les crochets buccaux. Placez une deuxième paire de pinces dans l’espace entre le cerveau et les disques oculaires et retirez rapidement le cerveau des crochets buccaux pour retirer les deux lobes cérébraux tout en continuant à tenir les crochets buccaux. Pincez le tissu le plus près possible de la connexion entre la section de l’antenne du disque d’antenne de l’œil et le crochet buccal.

Continuez jusqu’à ce que tous les tissus souhaités aient été disséqués. Ensuite, ajoutez deux petits morceaux de papier de soie de la taille d’une couverture espacés de trois pouces sur le plat de dissection. Placez une lame de verre sur ces morceaux de papier pour éviter que la lame ne colle à la base en silicone du plat de dissection.

À l’aide d’une pipette P 20, ajoutez neuf microlitres d’agent antiblanchiment au milieu de la lame de microscope en verre pour éviter le blanchiment du tissu par la lumière fluorescente avec la même pointe non coupée, rassemblez tous les disques I et ténaux et ajoutez-les à la goutte de réactif anti-blanchiment. Ensuite, utilisez une pince pour séparer et étaler l’œil et les disques ténaux dans la goutte de réactif anti-blanchiment jusqu’à ce qu’aucun disque imaginal ne se touche. À l’aide d’un pinceau fin, abaissez doucement une lamelle sur la goutte d’agent antiblanchiment pour éviter la formation de bulles d’air.

Enfin, stockez les lames à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à visualiser et à imager les disques ioniques à l’aide de la microscopie optique ou à fluorescence. Cette méthode produit de manière fiable un matériau d’analyse de haute qualité, comme le montrent ces images confocales de disques imaginaux. Les disques ont été traités avec un fluoro quatre foid et conjugué, qui se lie à l’actine f et délimite donc chaque cellule.

L’une des caractéristiques les plus frappantes du disque ental est le sillon morphogénétique, qui peut être vu comme une indentation dans le tissu le long de l’axe ventral dorsal. Au fur et à mesure que le sillon progresse dans le champ oculaire, la mer de cellules désordonnées se transforme en un ensemble ordonné d’yeux unitaires périodiquement espacés ou Oma Tedia. La vérification de l’expression clonale et l’analyse du disque I imaginal sont des applications possibles en aval de cette méthode.

Les trois panneaux supérieurs affichent des disques qui ont été colorés avec différents anticorps tels que l’ilis, un DPP, un rapporteur transcriptionnel LAC Z et des marqueurs spécifiques cellulaires tels que la vision embryonnaire, létale, anormale ou vy, qui code pour une protéine de liaison à l’ARN panneuronale. Les trois panneaux inférieurs montrent des disques dans lesquels la GFP est utilisée pour marquer les populations de cellules. Une fois le cours maîtrisé, l’isolement des complexes de tête de 10 à 20 larves prendra environ 10 minutes, et en outre, l’isolation fine du disque ténal ionique de ces complexes prendra également environ 10 minutes.