Name: La production et lisolement des axones de neurones sensoriels de lanalyse biochimique Utilisation des filtres poreux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-08T23:45:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Apprenez à isoler des axones purs de neurones DRG embryonnaires à l'aide de filtres poreux pour des analyses biochimiques et immunocytochimiques. Cette méthode permet d'étudier la physiologie axonale et les mécanismes de neurodégénérescence.

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Ce projet a été soutenu par des MOP62827 de subvention des Instituts de recherche en santé du Canada.

REMARQUE: Les procédures suivantes sont conformes aux lignes directrices approuvées par le Conseil canadien de protection des animaux. Tous les efforts sont faits pour minimiser la douleur et la détresse des animaux pendant les procédures. 1. Revêtement de filtres REMARQUE: Lorsque les inserts de filtre de culture sont placés dans des puits de plaques à puits multiples, deux compartiments sont définis: le compartiment supérieur est au-dessus de la région de l&#39;insert et le compartiment inférieur est l&#39;une au-dessous de l&#39;insert Figure 1A.ab. Les explants sont ensemencées dans le compartiment supérieur où qu&#39;ils attachent à la partie supérieure du filtre; de nombreux axones se développent à travers le filtre et s&#39;étendent sur ​​la face inférieure du filtre, dans le compartiment inférieur Figure 1A.c. Les volumes de travail standard (c&#39;est à dire pour appliquer la solution de revêtement, les lavages, les milieux de culture, etc) sont de 2 ml pour le compartiment inférieur et 1 ml pour le compartiment supérieur et vont être mentionné dans le protocole &quot;; Volumes standard &quot;. Ajouter solutions en commençant par le compartiment de fond en plaçant la pointe de la pipette dans l&#39;espace entre l&#39;insert et le côté du puits. En outre, l&#39;inclinaison de l&#39;insert d&#39;un côté tandis que la distribution de la solution pour empêcher des bulles d&#39;être piégé dans le fond du filtre. <ol><li> Lancer le revêtement des filtres la veille placage. En vertu de la culture de tissus hotte stérile, placer 24 cartouches filtrantes mm dans une plaque à 6 puits de réception. Incuber les inserts de poly-D-lysine dans l&#39;eau (1 mg / ml) pendant 1 heure à température ambiante en utilisant des volumes standard: 2 ml dans le compartiment inférieur et de 1 ml dans la partie supérieure. </li><li> Aspirer la poly-D-lysine et rincer une fois avec de l&#39;eau. Aspirer l&#39;eau, fermer le couvercle et laisser les plaques sécher dans la hotte O / N. Pendant l&#39;aspiration de liquides, veillez à retirer un reste de liquide qui se retrouve piégé directement sous le filtre. </li><li> Le lendemain matin, diluer la laminine dans l&#39;eau (10 pg / ml), mélanger et chaud à 37 ° C. Incuber inserts avec la laminine 1 h dans cell incubateur à 37 ° C, en utilisant des volumes standard. </li><li> Aspirer la laminine et le collagène ajouter dans de l&#39;eau (0,1 mg / ml) et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Dans ce cas, utiliser 2 ml pour le compartiment inférieur et 2 ml pour le compartiment supérieur. </li><li> Aspirer le collagène et laver une fois avec de l&#39;eau stérile. Les filtres sont maintenant prêts à recevoir des milieux de culture et des explants DRG, comme décrit à l&#39;étape 3. </li></ol> 2. Dissection embryonnaire ganglion de racine (DRG) explants <ol><li> Anesthésier une souris femelle enceinte de 13 jours par une injection IP de Avertin (250 mg / kg). Attendez 10-15 minutes et vérifier l&#39;absence de réflexes de retrait de la cornée et la pédale. Une fois les réflexes sont absents, effectuer dislocation cervicale. </li><li> Désinfecter tous les instruments chirurgicaux et abdomen de la femelle avec 70% d&#39;éthanol. Permettre aux instruments à sécher. Maintenir la peau de l&#39;abdomen et de couper à travers les couches de peau et de muscle pour exposer la cavité abdominale. </li><li> Enlever l&#39;utérus en détachant du col de l&#39;utérus et des ovaires. Dans un sterile capot, retirez les embryons de l&#39;utérus avec des ciseaux et les recueillir dans une boîte de Pétri remplie avec les médias de L15 glacée. Garder sur la glace. REMARQUE: Se reporter aux rapports techniques précédentes pour plus de détails sur la façon d&#39;obtenir des embryons de 13 jours de gestation 17,18. </li><li> Sous le microscope, jeter l&#39;embryon d&#39;un côté et utiliser de petits ciseaux à ressort pour enlever la tête. Faire une incision le long des côtés latéraux pour annuler la poitrine, le ventre, les membres et la queue. Gardez le dos contenant la colonne vertébrale, poser face ventrale et retirez tous les organes viscéraux. </li><li> Avec de petits ciseaux à ressort, exposer la moelle épinière ensemble en coupant la colonne vertébrale de sa face ventrale le long de la ligne médiane. Maintenez la carcasse vers le bas avec une paire de pinces (n ° 3) et utiliser une deuxième paire de tenir la moelle épinière par son aspect le plus rostral. </li><li> Lentement et doucement tirer sur le cordon loin de la cavité vertébrale et pincer DRG de la moelle épinière à l&#39;aide de pinces ultra-minces (# 5). Groupe GHM à percevoir surle fond de la boîte. </li><li> Recueillir DRG groupés par aspiration avec une pipette 200 ul qui a été coupé pour agrandir son ouverture. Placez les DRG dans un tube et laisser sur la glace jusqu&#39;à ce que la collecte des DRG est terminée. NOTE: conseils Blanc / transparentes sont préférés car DRG ne collent pas aux parois de cette pointe (par rapport à pointes jaunes standards). Conseils de chasse avec les médias avant l&#39;utilisation empêche en outre DRG de coller à ses murs. </li></ol> 3. Semis et entretien de ganglion de racine explants sur les filtres <ol><li> Ajouter un média DRG complet à 37 ° C pour les inserts enrobés utilisant des volumes standard. Compléter le support de compartiment inférieur avec 15 ng / ml de NGF, tout en gardant le compartiment supérieur NGF libre. NOTE: Bien que le NGF diffuse efficacement à travers le filtre et sa concentration s&#39;équilibre en quelques heures, nous avons observé que l&#39;application de NGF pour le compartiment inférieur juste avant le semis augmente significativement le rendement de axonale sur le bOttom surface du filtre. </li><li> Transférer les DRG du tube aux filtres en utilisant une pipette de 1000 pi avec une pointe taillée pour agrandir son ouverture. </li><li> Dessiner le média dans l&#39;embout 2-3x avant de recueillir les DRG. Cela les empêche de coller sur la face intérieure de la pointe. La même astuce peut être réutilisée pour tous les puits. L&#39;utilisation de conseils non coloré (contre pointes bleues standards) réduit DRG coller à la surface de la pointe. </li><li> Pour transférer des DRG, mettre la pipette à 800 pi. Aspirer environ 200 pi de milieu de la face supérieure du filtre, puis aller dans le tube contenant DRG et la pipette un petit volume de haut en bas - pour remettre en suspension les GHM qui ont coulé au fond. Aspirer la totalité du volume et DRG de pipette submergeant la pointe au milieu de la pièce. </li><li> Une fois tous les inserts sont chargés, fermez le couvercle de la plaque et agiter la plaque 10x, tapotant sur le banc de la hotte entre chaque tourbillon. Ces mouvements augmenter le rendement des axones en aidant les explants DRG évier etattacher au filtre. Cela permet aussi de distribuer des explants uniformément de sorte que les axones de différents explants ne se chevauchent pas. REMARQUE: La procédure de l&#39;ensemencement d&#39;explant est décrit dans les étapes précédentes augmente de manière significative le taux global de fixation de l&#39;explant au substrat (jusqu&#39;à 75%). Plus important encore, la procédure de pipetage facilement explants empêche de flotter sur la surface du support, au lieu de tomber au fond de l&#39;insert. </li><li> Pour les analyses biochimiques, les GHM de semences de un embryon (environ 30) par filtre. Pour les analyses morphologiques, utilisez la moitié ou un tiers des DRG d&#39;un embryon (10-15). Cette décision doit être prise avant la collecte des DRG dans des tubes, de sorte que tous les DRG d&#39;un tube sont ensemencées dans un seul puits (si elle est de 30, 15 ou 10 DRG). </li><li> Maintenir les cultures dans un incubateur de cellules à 37 ° C, changer de support tous les 2-3 jours. Pour changer de support, aspirer le compartiment supérieur en premier, suivi par le compartiment inférieur. Ajouter un milieu frais en volume standards en commençant par le compartiment inférieur. REMARQUE: Pour éviter cellules / axones de séchage, ne pas changer de support en plus de 3 inserts en même temps. DRG cultivés sur des filtres en présence de NGF s&#39;étendront axones longs, atteignant jusqu&#39;à 2 mm après 2 jours de culture. </li></ol> 4. Trophique Facteur traitement retrait Retrait NGF induit une dégénérescence axonale à la fragmentation axonale (déterminé par contraste de phase et β-III-tubuline SI) qui apparaît d&#39;abord autour de 12 heures après le retrait. Fragmentation complète est obtenue en 36 heures. Combien de temps la dégénérescence est laissée se dérouler pendant doit être choisi par l&#39;utilisateur final selon le protocole expérimental. <ol><li> Après la phase d&#39;extension axonale 2 jours, modifiez les médias de compartiments supérieurs et inférieurs aux médias qui manque NGF et contient des anticorps anti-NGF (1 pg / ml) pour séquestrer tout en restant (ou produit de façon endogène) NGF. </li><li> Retour à plaques incubateur de cellules (37 ° C) pour permettreNGF dégénérescence induite par le sevrage se dérouler pendant le temps désiré. </li><li> Procéder à l&#39;extraction des protéines (étape 6) pour examen par western blot ou d&#39;examiner directement les filtres IF (étape 7). </li></ol> 5. Axonale Transection pour induire wallérienne dégénérescence Cette procédure laisse les axones sur le côté inférieur du filtre détachés de leur corps cellulaire, mais sinon intacte. Par la suite, ces axones lancer rapidement la dégénérescence wallérienne. Fragmentation axonale (matérialisés par contraste de phase ou β-III-tubuline SI) apparaît pour la première de 3 heures après résection; de 9 heures, les axones sont totalement fragmenté et sont détachées du filtre. Combien de temps la dégénérescence est laissée se dérouler pendant doit être choisi par l&#39;utilisateur final selon le protocole expérimental. <ol><li> Grattez la partie supérieure du filtre, contenant des explants DRG cultivés, avec une cellule-grattoir. Assurer l&#39;élimination complète du matériel supérieur en déplaçant grattoir en X, Y et circulairedirections. </li><li> Jeter le support du compartiment supérieur contenant les explants flottants qui ont été grattées du filtre et remplacer par 1 ml de milieu de DRG préchauffé, complet contenant NGF (10 ng / ml). </li><li> Retour plaque à la cellule incubateur (37 ° C) pour permettre la dégénérescence wallérienne de procéder pour le temps choisi par l&#39;utilisateur final. </li><li> Procéder à l&#39;extraction des protéines (étape 6) pour examen par western blot ou d&#39;examiner directement les filtres IF (étape 7). </li></ol> 6. Extraction des protéines des échantillons axonales <ol><li> Remplir des tubes de prélèvement (1,5 ml) avec 75 ul de tampon d&#39;échantillon de Laemmli. Garder les tubes sur la glace alors que la récolte des axones de l&#39;ensemble des filtres. </li><li> Laver le filtre avec des explants de DRG dans du PBS et gratter la partie supérieure du filtre. Retirez le cache de la plaque, nettoyer la partie supérieure du filtre avec un applicateur coton-tige et aspirer toute PBS supplémentaire sur les côtés supérieur et inférieur. </li><li> Placez insert à l&#39;enverssur un établi et couper le filtre de l&#39;insertion à l&#39;aide d&#39;un scalpel. Tenez le filtre avec une pince, de bas en haut. Effectuer une coupe à partir de la périphérie vers le centre du filtre avec des ciseaux. </li><li> Placer le filtre sur le dessus du tube de collecte, et avec une pince, appuyez sur le centre du filtre dans le tube. Tout en faisant cela, un entonnoir doit former. Pousser le filtre en forme d&#39;entonnoir à la partie inférieure du tube de sorte qu&#39;il est immergé dans le tampon d&#39;échantillon de Laemmli. </li><li> Extraction de la protéine complète en faisant bouillir les tubes pour 4 min. Retirez le filtre en utilisant une pince à placer à l&#39;envers dans le haut du tube et effectuer un bref essorage (2000 g pendant 15 secondes). Jeter les filtres séchés. </li><li> Résoudre 10 ul de la préparation de protéine axonale dans une SDS-PAGE suivie par western blot pour détecter les protéines d&#39;intérêt. NOTE: En tant que référence, une préparation axonale à partir de 20 explants cultivés pendant 2 jours et lysées dans 100 ul de tampon de lyse RIPA aura une concentration en protéines de 4 à 6ug / ul. </li></ol> 7. Immunofluorescence examen des axones sur les filtres Les étapes suivantes décrivent les manipulations générales à effectuer si la coloration sur les cartouches filtrantes, illustrés par la détection de β-III-tubuline. Fixateur, temps d&#39;incubation, les concentrations et les autres indications doivent être optimisés pour d&#39;autres paires antigène-anticorps. <ol><li> Utiliser utilisés précédemment plaques à 6 puits, soigneusement nettoyés, pour les incubations et les lavages suivants des inserts. </li><li> Laver rapidement inserts en PBS. Les fixer dans fraîchement préparé paraformaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 10 min à température ambiante sur agitateur. </li><li> Après fixation, racler et nettoyer la face supérieure de l&#39;insert de recueillir les axones qui se sont développées exclusivement sur la surface inférieure du filtre. Procéder à des incubations standard pour SI. </li><li> Incuber les inserts dans une solution de blocage (TBS, 0,05% de Tween 20, 5% de lait écrémé), en utilisant des volumes standard, pendant 1 heure à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Transfert insère à l&#39;anticorps primaire dilué dans du tampon de blocage (anti-β-tubuline III-, 1:5000), en utilisant des volumes standard. Incuber O / N (environ 18 heures) à 4 ° C avec agitation douce. </li><li> Laver le premier anticorps à deux reprises dans du PBS (2 x 10 min à température ambiante). </li><li> Transfert insère à des anticorps secondaires fluorescents conjugué dilué dans du tampon de blocage (anticorps de chèvre anti-souris, 1:2000), en utilisant des volumes standard. Incuber couverte de la lumière pendant 2 heures à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Laver 3x anticorps secondaire dans du PBS (3 x 10 min à température ambiante). </li><li> Après SI est terminée, prendre sortie d&#39;insertion, videz PBS à partir du dernier lavage et nettoyer le dessus du filtre avec un applicateur coton-tige. Aspirer tout liquide à partir des côtés supérieur et inférieur. </li><li> Lieu insérer à l&#39;envers sur le banc, et coupé le filtre de l&#39;insert avec un scalpel. </li><li> Tenez le filtre avec une pince, la baisse, et placer sur la microscopie diapositive. Recouvrir d&#39;une lamelle et mou fluorescent compatiblemédias nting. Laissez sécher à plat dans la chambre froide, couverte de la lumière. Examiner et capturer des images en utilisant un microscope à fluorescence. NOTE: En cas de stockage à 4 ° C et à l&#39;abri de la lumière, ces préparations peuvent être conservés pendant des semaines avec une perte minimale de fluorescence. </li><li> OPTION: Sinon, SI peut être effectuée sur des filtres qui ont été retirés de l&#39;insert. Pour ce faire, gratter et nettoyer la face supérieure des filtres directement après fixation. <ol><li> Prenez filtres sur les inserts avec un scalpel et place des filtres axones-up pointu sur le fond d&#39;une plaque à six puits. </li><li> Ensuite, effectuez les incubations pour SI comme indiqué dans 7,4-7,8 et 7.11. L&#39;avantage de cette solution est qu&#39;il permet d&#39;économiser les réactifs, puisque, par exemple, les volumes d&#39;incubation peut aller jusqu&#39;à 500 pi (comparativement à 3 ml utilisés lorsque les filtres sont directement colorées sur les inserts comme indiqué dans 7.1 à 7.11). </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les paramètres importants à prendre en considération lors de l&#39;adaptation de cette technique comprennent la population neuronale qui sera étudié, le substrat, la taille des pores du filtre et la zone de surface. Tous ces paramètres auront une incidence sur la spécificité, la qualité et la quantité de la préparation des neurites obtenu, et doivent être soigneusement examiné par l&#39;utilisateur final. Dans les exemples présentés dans ce protocole, l&#39;utilisation de neurones DRG a l&#39;avantage d&#39;étendre seul...

Le compartiment axonal des neurones montre un grand degré d&#39;indépendance fonctionnelle du compartiment somato-dendritique. Dans les neurones de projection, les axones contiennent la majeure partie de la protéine de 1,2 neuronale. L&#39;étude de la physiologie et la physiopathologie des axones a pris de l&#39;ampleur dans la communauté des neurosciences car des études récentes ont montré que la dysfonction axonale précoce semble être une caractéristique commune des maladies neurodégénératives et des troubles neuropsychiatriques 3. Il semble probable qu&#39;une meilleure compréhension des mécanismes de axonales exclusive dans des conditions normales et pathologiques fera la lumière sur les événements précoces qui conduisent un dysfonctionnement. Le présent protocole décrit comment utiliser les inserts de culture portant une membrane poreuse (filtre) pour obtenir de grandes quantités de matériau pur axonale qui est approprié pour l&#39;analyse biochimique et immunocytochimique. L&#39;utilisation de cartouches filtrantes pour étudier la biologie axonale a été mis en œuvre par Steward et4 collègues et d&#39;autres développés par Twiss et ses collègues 5 à sa configuration actuelle. La technique est maintenant en cours d&#39;utilisation par des groupes qui étudient différents aspects de axonale et dendritique biologie, avec de légères modifications dans chaque cas à accueillir pour la population de neurones étudiés, les traitements effectués et le type d&#39;analyses biochimiques utilisés 6-9. Le présent protocole n&#39;a pas l&#39;intention d&#39;accueillir toutes les alternatives pour une telle variété d&#39;applications, mais plutôt de fournir une approche simple qui convient à la plupart des applications. En particulier, le protocole décrit ici utilise un revêtement triple qui maximise le rendement des axones pour les analyses biochimiques et est le plus approprié pour étudier axonales revêtements de dégénérescence-autres décrits dans la littérature produite moins axones qui se rétractent et dégénèrent rapidement en cas de privation de facteurs trophiques 9. Dans cette procédure, les corps cellulaires neuronaux restent isolés au sommet de la wh de filtreaxones ile passent à travers les pores et se développent le long de sa surface inférieure. Axones purs (gratuite, la glie et les neurones contaminants du corps cellulaire) qui se développent sur ​​la surface inférieure du filtre peuvent être collectés pour des analyses biochimiques ou peuvent être fixés in situ et examinés par des techniques immunocytochimiques 9. Le procédé repose sur l&#39;utilisation de neurones sensoriels embryonnaires du ganglion de la racine dorsale (DRG). DRG embryonnaires sont largement utilisés pour étudier la biologie axonale car neurites de ces cellules subissent une croissance rapide et robuste in vitro lorsqu&#39;il est maintenu dans facteur de croissance nerveuse (NGF), et parce qu&#39;ils subissent rapidement la dégénérescence lorsqu&#39;ils sont privés de ce facteur. En outre, les neurones DRG manquent dendrites, de sorte que tous les neurites recueillies par cette méthode sont purement axones. inserts de filtre représentent un grand avantage par rapport aux autres approches utilisées pour étudier les axones. Des études reposant sur l&#39;utilisation de la microscopie à différencier les processus se produisant dans le corps cellulaire de celles dans unXons fournissent des informations biochimiques limitée. Comme autre exemple, les systèmes de culture compartimentés (par exemple, les chambres de Campenot 10 ou dispositifs microfluidiques 11) sont utiles pour les approches d&#39;imagerie et de traitement différencié des compartiments cellulaires, mais ne fournissent que des petites quantités de matériel axonal, empêchant l&#39;utilisation de ces techniques pour les analyses biochimiques qui nécessitent des quantités relativement importantes de l&#39;échantillon. En outre, leur utilisation nécessite une formation importante ainsi que des dispositifs spécialisés, et ils prennent beaucoup de temps. Une autre approche souvent utilisée pour isoler les axones à partir d&#39;explants est de supprimer manuellement un centre d&#39;explantation (contenant les corps cellulaires neuronaux) avant la collecte de l&#39;échantillon axonale. Même si cela peut produire de grandes quantités de préparations axonales enrichi, les axones de cette préparation peuvent être enveloppés dans des cellules gliales et éliminer rapidement les corps des 20 explants consécutivement à partir de 6 puits (à titre d&#39;exemple d&#39;une expérience minimum) prend du temps et à la limite de la faisabilité. En revanche, la méthode présentée ici produit des préparations axonales abondante et pure qui peut être ensuite analysé par pratiquement n&#39;importe quelle technique biochimique qui est couramment utilisé pour analyser les lysats de cellules entières, comme Western blot, immunoprécipitation 6, transfert de Northern 5 par spectrométrie de masse 6, la purification de l&#39;ARN 7,12,13, entre autres. En outre, le protocole peut être appliqué à immunofluorescence (IF) techniques, comme il est possible de fixer les axones en croissance dans le côté inférieur du filtre à examiner plus en détail les IF. Cette approche facilite grandement l&#39;analyse des processus spécifiques axonales car il n&#39;y a pas de corps cellulaires dans la préparation finale. C&#39;est un avantage important car un signal haute immunofluorescence de corps cellulaires mine souvent l&#39;examen et l&#39;analyse d&#39;un signal faible provenant de structures minces tels que des axones. Deux applications du procédé de culture pour étudier la dégénérescence axonale are décrit; un modèle de taille de développement et un modèle de dégénérescence induite par une lésion (communément appelée dégénérescence comme wallérienne). La modélisation de l&#39;élagage de développement est basé sur le fait que les neurones sensoriels in vivo en concurrence pour des montants de NGF cible dérivé et ceux ne recevant pas assez dégénéré de support neurotrophique 14 limiter. Ce phénomène peut être mimée dans des cultures de DRG embryonnaires par le retrait de NGF à partir du milieu de culture, ce qui, comme cela se passe in vivo, déclenche une dégénérescence axonale suivie de destruction du corps de la cellule. Pour modéliser la dégénérescence wallérienne, la partie supérieure du filtre avec les corps cellulaires est grattée. Les axones qui avaient poussé sur le côté inférieur du filtre séparées physiquement les corps cellulaires et subir par la suite, le processus dégénératif rapide et stéréotypé appelé dégénérescence wallérienne 15, nommé d&#39;après A. Waller qui a le premier signalé le phénomène en 1850 16.

<table><tbody><tr><td>souris CD-1, E13 grossesse programmée</td><td>Charles River</td><td></td><td>Les grossesses programmées à la maison peuvent être réalisées en accouplant des souris et en vérifiant la présence de bouchons vaginaux (jour E0)</td></tr><tr><td>Inserts de culture cellulaire Falcon</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>1 & micro ; m taille des pores, s’adapte à la plaque réceptrice à 6 puits</td></tr><tr><td>Plaques compagnes de culture cellulaire Falcon</td><td>Corning</td><td>353502</td><td>Plaques réceptrices pour inserts</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Utilisé à 1 mg/ml dans l’eau. Peut être réutilisé une fois.</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Utilisé à 10 & micro ; g/ml dans l’eau. Prendre 100x le stock à partir de -80 &deg ; C et décongélation O/N à 4 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>PureCol Solution de collagène bovin</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz’s L-15 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td>Peut être remplacé par DMEM</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>medium Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 supplément sans sérum</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime ;-deoxyuridine (FDU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>NGF (2.5S, sous-unité bêta)</td><td>Cedarlane</td><td>CLMCNET-001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-NGF</td><td>Préparé en interne</td><td></td><td>Comme décrit dans : Acheson, A. et al. Détection de l’activité de type facteur neurotrophique dérivé du cerveau dans les fibroblastes et les cellules de Schwann : inhibition par les anticorps contre le NGF. Neurone. 7, 265-75, (1991).</td></tr><tr><td>Alomone Labs</td><td>AN-240</td><td>Option</td><td></td>commerciale</tr><tr><td>Anticorps anti-tubuline</td><td>Millipore</td><td>MAB5564</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anticorps anti-souris de chèvre</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">DRG milieu de culture</td></tr><tr><td colspan="4">Neurobasal Medium 2 % B27 Supplément neurobasal 2 mM l-Glutamine 1 % Pénicilline-streptomysine 10 &micro ; M FDU 15 ng/ml NGF (compartiment inférieur uniquement)</td></tr><tr><td colspan="4">1x tampon d’échantillon Laemmli</td></tr><tr><td colspan="4">2 % SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6,8) 5 % Glycérol 0,01 % (p/v) Bleu de bromophénol</td></tr></tbody></table>

la production et l&#39;isolement des axones de neurones sensoriels de l&#39;analyse biochimique utilisation des filtres poreux

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Les axones neuronaux utilisent des mécanismes spécifiques pour favoriser l’extension, maintenir l’intégrité et induire la dégénérescence. Un équilibre approprié de ces événements est nécessaire pour façonner les circuits neuronaux fonctionnels. Le protocole décrit ici explique comment utiliser des inserts de culture cellulaire portant une membrane poreuse (filtre) pour obtenir de grandes quantités de préparations axonales pures adaptées à l’examen par des techniques biochimiques ou immunocytochimiques conventionnelles. La fonctionnalité de ces inserts filtrants sera démontrée avec des modèles de taille développementale et de dégénérescence wallérienne, en utilisant des explants de ganglion embryonnaire de la racine dorsale. L’intégrité et la fonction axonales sont compromises dans une grande variété de pathologies neurodégénératives. En effet, il est maintenant clair que le dysfonctionnement axonal apparaît beaucoup plus tôt dans l’évolution de la maladie que la perte neuronale de soma dans plusieurs maladies neurodégénératives, indiquant que les processus axonaux spécifiques sont principalement ciblés dans ces troubles. En obtenant des échantillons axonaux purs pour l’analyse par des techniques moléculaires et biochimiques, cette technique a le potentiel d’apporter un nouvel éclairage sur les mécanismes régulant la physiologie et la physiopathologie des axones. Cela aura à son tour un impact sur notre compréhension des processus à l’origine des maladies dégénératives du système nerveux.

Explants de ganglions de la racine dorsale de souris E13.5 poussent de manière séquentielle sur des filtres largement recouvertes de poly-D-lysine, la laminine et le collagène (figure 1B, à gauche), atteignant jusqu'à 2 mm dans les 2 jours de culture. Cette combinaison de substrat donne une croissance particulièrement exubérante; autres combinaisons donnent axones qui sont considérablement plus courte (figure 1B, à droite). En outre, les GHM entretenus sur les filtres s'étendent de plus...

Cet article décrit un système de culture neuronale qui peut être utilisé pour obtenir de grandes quantités d’échantillons axonaux purs pour des analyses biochimiques et immunocytochimiques. Cette technique permettra une meilleure compréhension de la physiologie axonale normale et des voies de signalisation menant à la neurodégénérescence.

La production et l&#39;isolement des axones de neurones sensoriels de l&#39;analyse biochimique Utilisation des filtres poreux

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Le but de cette procédure est d’obtenir des préparations axonales pures adaptées à l’examen par des techniques conventionnelles, biochimiques ou immunochimiques. Ceci est accompli en cultivant d’abord des cellules ganglionnaires de la racine dorsale embryonnaire sur des inserts de culture portant un filtre à membrane poreux pendant que les neurones DRG étendent les axones. Une partie des axones se développe à travers les pores du filtre et s’étend sur sa surface inférieure tandis que les corps cellulaires restent isolés sur la surface supérieure Après les manipulations expérimentales souhaitées, la préparation axonale est obtenue en retirant physiquement les cellules sur la face supérieure des filtres tout en conservant les axones qui se sont développés sur la face inférieure.En fin de compte, les axones isolés peuvent être allongés pour des analyses biochimiques ou fixés pour un examen immunochimique en produisant des échantillons axonaux purs adaptés à l’analyse par des techniques biochimiques conventionnelles. Cette procédure s’est avérée très utile pour étudier la physiologie et la physiopathologie des axones. Comme vous le verrez, la technique est relativement simple à mettre en œuvre et peut être adaptée à des contextes expérimentaux particuliers.Nous allons démontrer son utilisation dans l’étude des mécanismes de dégénérescence axonale La veille du placage. Commencez par recouvrir les filtres d’une hotte de culture de tissus stériles. Première place, inserts filtrants de 24 millimètres dans une plaque de réception à six puits.Ajoutez ensuite deux millilitres d’un milligramme par millilitre, de la poly de lycine dans de l’eau dans le compartiment inférieur et un millilitre dans le haut, et incubez les inserts pendant une heure à température ambiante. Sa prochaine aspiration, le poly de lycine, en s’assurant d’éliminer le reste de liquide qui se retrouve piégé directement sous le filtre. Ensuite, rincez une fois à l’eau après avoir aspiré l’eau, fermez le couvercle et laissez sécher les plaques dans la hotte pendant la nuit.Le lendemain matin, mélangez et réchauffez une solution de stratifié et d’eau à 37 degrés Celsius. Incuber les inserts dans la solution de laminine pendant une heure dans un incubateur cellulaire à 37 degrés Celsius en utilisant des volumes standard. Après l’aspiration.La laminine ajoute 0,1 milligramme par millilitre, du collagène dans de l’eau et incube pendant une heure à température ambiante, puis aspire le collagène et lave une fois à l’eau stérile. Les filtres sont maintenant prêts à recevoir le milieu de culture et l’explan DRG après, après avoir disséqué et décapité un embryon de souris E 13 comme décrit dans le protocole texte. Placez l’embryon sur le côté dans une boîte de Pétri remplie de milieu L 15 tout en observant à travers un microscope à dissection, faites une incision le long des côtés latéraux pour éliminer la poitrine, les membres du ventre et la queue.Placez le dos contenant la colonne vertébrale, côté ventral vers le haut, et retirez tous les organes viscéraux à l’aide de petits ciseaux à ressort. Exposez toute la moelle épinière en coupant la colonne vertébrale de sa face ventrale le long de la ligne médiane. Maintenez la carcasse vers le bas à l’aide d’une paire de pinces numéro trois et utilisez une deuxième paire pour maintenir la moelle épinière par son aspect le plus rostral.Maintenant, tirez lentement et doucement le cordon loin de la cavité vertébrale. Au fur et à mesure que les DRG sont exposés, utilisez des pinces ultrafines numéro cinq pour les pincer de la moelle épinière. Placez les DRG détachés au fond du plat à l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres qui a été coupée pour l’agrandir.Son ouverture. Aspirez les DRG collectés et placez-les dans un tube sur de la glace. Complétez le milieu du compartiment inférieur avec 15 nanogrammes par millilitre de NGF tout en gardant le compartiment supérieur exempt de NGF.Ensuite, ajoutez un support DRG complet à 37 degrés Celsius aux inserts couchés en utilisant des volumes standard. Puis à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres avec une pointe taillée pour agrandir son ouverture. Réglez la pipette à 800 microlitres.Ensuite, transférez environ 200 microlitres de média de la face supérieure du filtre vers le DRG contenant une pipette tubulaire d’un petit volume de haut en bas afin de ressusciter les D RRG qui ont coulé vers le bas. Une fois remis en suspension, aspirez tout le volume, transférez maintenant les DRG dans le filtre en immergeant la pointe de la pipette au milieu de l’insert et en expulsant les DRG. Maintenez les cultures dans un incubateur cellulaire à 37 degrés Celsius.Changer de support tous les deux à trois jours pour changer de support. Aspirez d’abord le compartiment supérieur, puis le compartiment inférieur. Ajoutez des milieux frais dans des volumes standard en commençant par le compartiment inférieur pour étudier l’effet du retrait du facteur trophique sur les axones.Attendez deux jours pour permettre l’extension axonale. Ensuite, retirez le support des compartiments supérieur et inférieur. Ensuite, pour séquestrer tout milieu restant ou produit de manière endogène et GF, ajoutez un milieu dépourvu de NGF et contenant des anticorps anti-NGF.Remettez les plaques dans l’incubateur cellulaire à 37 degrés Celsius pour permettre à la dégénérescence induite par le retrait du NGF de se poursuivre pendant la durée souhaitée pour étudier la dégénérescence arienne. Utilisez des filtres contenant DRG explan maintenus en NGF pendant deux jours. Utilisez un grattoir à cellules pour gratter les DRG sur la face supérieure du filtre.Assurez l’élimination complète des corps cellulaires neuronaux en déplaçant le grattoir d’avant en arrière dans les directions x et y et en cercles. Confirmez le succès du raclage en vérifiant qu’aucune plante X ne reste attachée au filtre. Ensuite, jetez le milieu contenant les explants flottants du compartiment supérieur et ajoutez un millilitre de média DRG complet préchauffé contenant 10 nanogrammes par millilitre et gf.Remettez ensuite la plaque dans l’incubateur cellulaire à 37 degrés Celsius pour permettre à la dégénérescence wallérienne de se poursuivre pendant la durée souhaitée pour extraire les protéines des échantillons axonaux. Commencez par remplir des tubes de collecte de 1,5 millilitre avec 75 microlitres de tampon d’échantillon de feuilles d’agneau et placez les tubes sur de la glace. Lavez le filtre contenant l’explan DRG dans PBS et raclez la face supérieure du filtre comme précédemment.Après avoir retiré l’insert de la plaque, utilisez un applicateur à embout coton pour nettoyer la face supérieure du filtre. Aspirez ensuite tout PBS supplémentaire par le haut et le bas. Ensuite, placez l’insert à l’envers sur un banc et utilisez un scalpel bien aiguisé pour découper le filtre de l’insert.Ensuite, tenez le filtre avec une pince. De bas en haut. À l’aide de ciseaux, faites une coupe de la circonférence au centre du filtre.Placez maintenant le filtre sur le dessus du tube collecteur et, à l’aide d’une pince, appuyez sur le centre du filtre dans le tube. Ce faisant, un entonnoir se formera et poussera le filtre en forme d’entonnoir vers le fond du tube afin qu’il soit immergé dans le tampon d’échantillonnage. Terminez maintenant l’extraction des protéines en couvrant les tubes et en les plaçant dans de l’eau bouillante pendant quatre minutes.Retirez le filtre à l’aide d’une pince et placez-le à l’envers dans le haut du tube et centrifugez-le brièvement. Une fois terminé, jetez les filtres séchés pour l’immunofluorescence. Lavez les inserts dans du PBS dans des plaques à six puits.Fixez ensuite les inserts dans de l’aldéhyde paraforme à 4 % fraîchement préparé dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante sur un agitateur après la fixation, grattez et nettoyez la face supérieure des inserts pour vous assurer que seuls les axones qui se sont développés exclusivement sur la surface inférieure du filtre seront tachés. Effectuez ensuite l’immunofluorescence standard comme décrit dans le protocole textuel. Une fois que toutes les incubations par immunofluorescence sont terminées.Videz le PBS du dernier lavage. Nettoyez la face supérieure du filtre à l’aide d’un applicateur à embout en coton et aspirez le liquide restant par les côtés supérieur et inférieur. Placez l’insert à l’envers sur le banc et utilisez un scalpel bien aiguisé pour découper le filtre de l’insert.Ensuite, tenez le filtre avec la pince à l’envers. Placez-le sur une lame de microscope. Utilisez un support de montage compatible avec les fluorescents pour placer une lamelle sur le filtre et laissez le filtre sécher à plat dans l’obscurité à quatre degrés Celsius.Terminé par l’examen et la capture d’images à l’aide d’un microscope fluorescent. Le revêtement séquentiel des filtres avec de la polylysine, de la laminine et du collagène permet d’obtenir des plantes dont les axones poussent plus et plus longtemps que celles cultivées avec de la polylysine seule ou de la polylysine et du collagène sous le même substrat. Conditions de revêtement.DRG Explan maintenu sur des filtres montre une croissance axonale considérablement plus exubérante que les plantes X cultivées sur du plastique. La préparation axonale obtenue après grattage de la face supérieure du filtre est dépourvue de noyaux cellulaires, ce qui démontre que les corps cellulaires sont exclus de la face inférieure du filtre illustré. Voici des exemples d’axones qui proviennent d’environ 17 explan, qui s’étendaient à travers les pores du filtre pour se développer sur la face inférieure d’un filtre de 24 millimètres.Les immuno-transferts de lysats collectés sur le dessus et le bas du filtre démontrent que l’histone H, un marqueur nucléaire, est confinée au sommet du filtre. La teneur totale en protéines a été normalisée dans les différents échantillons. Les expériences de privation de NGF sont démontrées dans ces images à différents grossissements de préparations axonales à partir d’explan maintenues en NGF ou privées de NGF pendant 12 ou 36 heures.Les études de dégénérescence axonale de la paroi arienne sont montrées dans ces images de préparations axonales à partir d’explants intacts ou de trois à 7,5 heures après la transsection, comme dans d’autres modèles de dégénérescence wallérienne. Cinq millimolaires de NAD plus protègent de la dégénérescence induite par la section Une fois maîtrisé. Cette technique est robuste et facile à reproduire.Il permet de générer de grandes quantités de préparations axonales fiables Depuis qu’elles ont été décrites pour la première fois par twist et ses collègues en 2001. Des variantes de cette technique ont été utilisées pour explorer de nombreux aspects de la physiologie des axones et des dendrites. Référez-vous aux citations dans le protocole textuel pour découvrir d’autres applications de cette technique.

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