Une biopuce microfluidique électrochimique à base d'analyse ADN hybridation Sans étiquette

L’objectif général de l’expérience suivante est d’observer l’effet des événements d’hybridation de l’ADN sur les spectres d’impédance à l’aide d’un dispositif électrochimique microfluidique. Pour ce faire, une puce électrochimique est fabriquée pour permettre un réseau de capteurs d’électrodes et une puce PDMS microfluidique est fabriquée. Pour faciliter l’introduction d’échantillons de microvolume, les deux puces sont liées ensemble et fonctionnalisées à l’aide de sondes d’ADN simple brin.

L’ADN simple brin cible est ensuite ajouté lors de l’hybridation de l’ADN, la force de répulsion plus forte entre l’ADN double brin chargé négativement et les molécules de cyanure Ferris chargées négativement entraîne une résistance au transfert de charge plus élevée. En fin de compte, les événements d’hybridation de l’ADN peuvent être détectés en mesurant les changements dans les spectres d’impédance électrochimique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l’utilisation d’un lecteur de plaques ou d’un test par décalage J, est que les appareils peuvent effectuer la même technique avec un faible volume d’échantillon et à une fraction du coût sans sacrifier la sensibilité ou la spécificité.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche sur le cancer, la détection de la grippe et le génie génétique en permettant un dépistage rapide de séquences d’ADN spécifiques et une étude de la cinétique binaire des séquences d’ADN simple brin. Étant donné que cette méthode d’analyse rapide et à haut débit de l’hybridation de l’ADN peut être réalisée avec un faible volume d’échantillon et sans étapes compliquées de préparation de l’échantillon, les implications de cette technique s’étendent à notre diagnostic de troubles génétiques, de diverses formes de cancer ou de maladies avec des marqueurs d’ADN spécifiques tels que la grippe. En général, les personnes qui ne connaissent pas la méthode auront du mal car le développement de micro-dispositifs nécessite des paramètres de traitement de contrôle et une approche itérative pour résoudre des problèmes tels que les fuites de solution.

Après l’assemblage de l’appareil, pour modeler des électrodes d’or sur la puce électrochimique, tenez une plaquette de silicium vierge de quatre pouces avec une pince à épiler et utilisez une bouteille de lavage pour rincer la surface des deux côtés de la plaquette avec de l’acétone, du méthanol, puis de l’isopropanol. Ce processus est désigné ci-après sous le nom de nettoyage A MI sous un jet d’eau déminéralisée. Rincez l’isopropanol de la plaquette, puis utilisez un pistolet à azote pour sécher la plaquette.

Chargez la plaquette dans un équipement de dépôt chimique en phase vapeur amélioré par plasma ou dans un équipement P-E-C-V-D. Entrez les paramètres pour obtenir une couche de dioxyde de silicium d’un micromètre d’épaisseur et démarrez ensuite le processus automatisé, à l’aide d’un outil de pulvérisation à courant continu, déposez une couche de chrome de 200 angströms d’épaisseur sur la plaquette, puis déposez une couche d’or de 2000 stroms d’épaisseur. Chargez la plaquette sur une essoreuse, saupoudrez la surface avec un pistolet à azote et à l’aide d’une pipette à pâter, appliquez un spin PR positif pour créer un film uniforme d’environ 1,6 micromètre d’épaisseur.

Ensuite, précuire la gaufrette pendant une minute à 100 degrés Celsius sur une plaque chauffante. Chargez la plaquette avec la résine photo dans l’équipement d’alignement de masque. Ensuite, lancez une exposition de 190 millijoules par centimètre carré à 405 nanomètres dans laquelle l’aligneur de masque ouvrira l’obturateur et exposera la résine photo à la lumière à travers un masque avec les caractéristiques conçues.

Après l’exposition, plongez la gaufrette dans un plat en verre contenant 3 5 2 révélateur et incubez pendant 30 secondes en secouant doucement. Rincez ensuite la plaquette sous un jet d’eau et séchez-la avec le pistolet à azote comme précédemment. Ensuite, plongez la plaquette dans un plat en verre contenant une solution de gravure à l’or et incubez pendant 1,5 minute en secouant doucement.

Transférez ensuite la plaquette dans un plat en verre contenant le chrome mentionné et incubez en secouant doucement jusqu’à ce que les marques de chrome sur la plaquette disparaissent. Cela devrait prendre environ 30 secondes. Rincez la plaquette à l’eau di et séchez-la avec le pistolet à azote qui tient la plaquette avec une pince à épiler.

Décapage de la résine photo à l’aide de la procédure de nettoyage MI. Ensuite, rincez à l’eau DI et séchez avec le pistolet à azote en portant deux couches de gants. Plongez la gaufrette dans un plat en téflon avec une solution propre de piranha pendant une minute.

Rincez ensuite la plaquette à l’eau di et séchez-la avec un pistolet à azote. Ensuite, pour modeler les électrodes de platine, chargez la plaquette sur une toupie. Saupoudrez la surface à l’aide d’un pistolet à azote et à l’aide d’une pipette à pâter, distribuez PR deux photoréserves positives sur la surface et essorez-les pour créer un film uniforme d’environ 1,4 micromètre d’épaisseur.

Placez la gaufrette sur une plaque chauffante à 100 degrés Celsius et précuire pendant une minute. Après la précuisson, exposez la plaquette à 30 millijoules par centimètre carré 405 nanomètres à travers un masque photo. Placez ensuite la gaufrette sur une plaque chauffante à 125 degrés Celsius et faites cuire au four pendant 45 secondes.

Retirez le masque du masque, de l’aligneur et de l’inondation. Exposez la plaquette avec 1000 millijoules par centimètre carré à une longueur d’onde de 405 nanomètres sans masque photo. Après l’exposition, développez la plaquette en l’immergeant dans une boîte en verre contenant six pour un une solution de révélateur Z 400 K.

Incuber pendant deux minutes en secouant doucement. Rincez ensuite la plaquette à l’eau di et séchez-la avec un pistolet à azote. À l’aide d’un système d’évaporation par faisceau d’électrons, déposez une couche de titane de 400 angströms d’épaisseur suivie d’une couche de platine de 1600 angströms d’épaisseur sur la plaquette.

Placez la gaufrette dans un plat en verre rempli d’acétone et placez le plat dans un bain à ultrasons pendant cinq minutes pour décoller la photo. Résistez puis tenez la plaquette avec une pince à épiler. À l’aide d’une bouteille de lavage, rincez les deux surfaces de la plaquette avec de l’acétone, puis de l’isopropanol.

Rincez la plaquette à l’eau di et séchez-la avec le pistolet à azote. Pour préparer le moule pour les canaux de test, rincez une plaquette de silicium vierge de qualité test de quatre pouces avec la procédure de nettoyage MI. Comme précédemment, rincez l’isopropanol de la plaquette avec de l’eau, puis séchez-le avec un pistolet à azote.

Chargez la plaquette sur une touffe, saupoudrez la surface de la plaquette avec un pistolet à azote et à l’aide d’une pipette à pasti, distribuez trois photoréserves négatives PR sur la surface pour créer un film uniforme d’environ 100 micromètres d’épaisseur. Placez la gaufrette sur une plaque chauffante pour la précuire en utilisant une procédure de cuisson en deux étapes. Tout d’abord, augmentez la température de la température ambiante à 65 degrés Celsius à 300 degrés Celsius par heure.

Maintenez ensuite à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Augmentez jusqu’à 95 degrés Celsius à 300 degrés Celsius par heure, puis maintenez l’arrêt pendant 30 minutes. Exposez la plaquette avec 2 500 millijoules par centimètre carré à une longueur d’onde de 405 nanomètres à travers un masque photo.

Placez ensuite la gaufrette sur une plaque chauffante et post-cuisson de la gaufrette en passant de la température ambiante à 95 degrés Celsius à 300 degrés Celsius par heure. Maintenez à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Immergez la plaquette dans une coupelle en verre contenant du propylène glycol, de l’acétate de monométhyléther ou un révélateur P-G-M-E-A et laissez-la se développer pendant 10 minutes.

Rincez la plaquette avec de l’isopropanol et séchez-la avec un pistolet à azote pour fabriquer des canaux de dosage afin de trouver une enceinte autour de la plaquette de moule avec une feuille d’aluminium et versez lentement le polydiméthyl suboxane ou PDMS non durci sur le moule. Faites cuire le moule avec le PDMS dans un four à caisson en utilisant une procédure de cuisson en deux étapes dans laquelle la température passe de la température ambiante à 80 degrés Celsius en cinq minutes et reste à 80 degrés Celsius pendant 17 minutes. Une fois le moule refroidi, décollez le PDMS du moule et placez-le sur du papier d’aluminium.

Coupez les copeaux de test avec un couteau chirurgical et définissez les trous avec un outil de poinçonnage de biopsie comme illustré ici. Alignez manuellement les canaux de dosage PDMS avec les électrodes de travail sur la puce électrochimique. Le PDMS adhère bien à la puce électrochimique, scellant les canaux et empêchant les fuites.

Connectez un tube flexible à un coude en plastique ou à un connecteur droit à l’aide d’un tube flexible court comme adaptateur pour fonctionnaliser les micro-canaux verticaux. Connectez une seringue contenant la sonde d’ADN simple brin à la tubulure et placez-la dans un pousse-seringue. Fixez les connecteurs à chacune des entrées perforées de l’appareil.

L’aspect le plus difficile de cette procédure est de faire couler la solution dans les microcanaux sans générer de bulles. Pour assurer le succès, écoulez la solution très lentement Pour obtenir un remplissage homogène du canal, lancez la pompe à un débit de 200 microlitres par heure pour remplir lentement chacun des trois microcanaux séparés avec une solution d’incubation de sonde d’ADN simple brin différente. Après une incubation d’une heure, remplacez le tube et le connecteur de la seringue pour rincer les microcanaux avec du PBS Ensuite, remplacez le tube de la seringue et les connecteurs pour remplir le microcanal avec une solution composée d’un millimolaire de six mères CAPTO, d’un HME d’éthanol H dans 10 millimolaires de chlorure de sodium PBS, de 100 millimolaires de chlorure de sodium et de 1,395 millimolaire de TCEP incubé pendant une heure.

Rincez ensuite avec du PBS comme avant d’utiliser une pince à épiler. Soulevez le PDMS, faites-le pivoter de 90 degrés jusqu’à une orientation horizontale et posez-le vers le bas. Cela exposera des rangées distinctes de chambres de réaction, chaque rangée contenant un compteur unique et une électrode de référence pour l’analyse de l’hybridation de l’ADN.

Échangez, le tube de la seringue et les connecteurs pour remplir les micro-canaux avec une solution de mesure de contrôle de citrate de sodium salin concentré Forex tampon SSC incuber pendant 20 minutes après l’incubation changer la seringue pour remplir les micro canaux avec cinq millimolaires de cyanure de Ferris cinq millimolaires de cyanure de pharaon dans une solution PBS. Ensuite, pour enregistrer les valeurs d’impédance de fond du système électrochimique pour différentes fréquences par spectroscopie d’impédance électrochimique ou EIS, connectez une statistique de potentiel au compteur de travail et aux électrodes de référence à l’aide des pointes de sonde. Entrez les paramètres de la mesure EIS dans le logiciel informatique, puis lancez la mesure.

Répétez cette mesure pour chaque électrode fonctionnelle dans les microcanaux afin de mesurer l’hybridation de l’ADN pour chaque échange de cible d’ADN simple brin non complémentaire et complémentaire. Le tube de la seringue et le connecteur. Remplissez les microcanaux avec un tampon SSC concentré quatre fois contenant une micromolaire de l’ADN simple brin cible et incubez pendant 20 minutes.

Prenez des mesures en lançant la mesure EIS avec un logiciel sur l’ordinateur pour chaque solution d’ADN simple brin cible afin de valider l’activité électrochimique du vol cyclique de la biopuce. Des mesures de télémétrie ont été prises dans les micro-canaux remplis d’un oxydoréduction électroactif Couple cyanure de cyanure de couple illustré ici sont des télégrammes de vol cyclique de neuf électrodes de travail. La forme, la hauteur des pics et la séparation des pics similaires pour toutes les électrodes démontrent une grande reproductibilité pour démontrer la capacité des biopuces à détecter les événements d’hybridation de l’ADN.

Des variations d’impédance électrochimique ont été mesurées pour les événements d’hybridation entre trois sondes d’ADN simple brin et leurs cibles d’ADN simple brin complémentaires et non complémentaires. Des changements plus élevés de résistance au transfert de charge ont été observés lors de l’introduction et de l’hybridation d’une cible d’ADN simple brin complémentaire avec la sonde par rapport à l’introduction de cibles d’ADN simple brin non complémentaires pour démontrer la sensibilité du biocapteur. Différentes concentrations de cibles d’ADN simple brin complémentaires ont été introduites dans la sonde de détection, comme le montre ici un graphique de Nyquist de mesures de spectroscopie d’impédance électrochimique suite à l’introduction de concentrations croissantes d’ADN simple brin cible indiquées par la flèche sur le graphique. Des valeurs d’impédance accrues ont été observées à des fréquences basses d’environ 15 hertz pour des concentrations d’ADN simple brin cibles plus élevées en raison des forces de répulsion plus fortes entre l’ADN double brin et les molécules de cyanure de Ferris.

Dans l’ensemble, les BIOCHIPS montrent la capacité de détecter rapidement la présence d’événements d’hybridation de l’ADN. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer et de fabriquer un dispositif électrochimique microfluidique et de l’utiliser pour détecter les événements d’hybridation de l’ADN. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’optimiser divers paramètres du bios tels que le rapport signal/infirmière, la stabilité et la sensibilité Après cette procédure.

D’autres méthodes, telles que l’introduction de cibles d’ADN simple brin avec des séquences d’acides nucléiques légèrement différentes, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la combinaison de mutations d’ADN et la compétition. N’oubliez pas que travailler avec des solutions de processus de micro-fabrication peut être extrêmement dangereux, et que la protection du corps, des yeux et des mains doit toujours être mise en garde lors de l’exécution de cette procédure.