In Vivo L'électroporation et microinjection de testicule de souris

Cet article décrit la micro-injection et l'électroporation de testicule de souris in vivo en tant que technique de transfection de cellules testiculaires de souris pour étudier les procédés uniques de la spermatogenèse. Le protocole présenté implique des étapes de préparation capillaire en verre, la micro-injection par le conduit efférent, et la transfection par électroporation.

Le but de cette procédure est d’effectuer une micro-injection de constructions génétiques dans le testicule de souris, suivie d’une électroporation InVivo. Cela permet d’effectuer une analyse génétique complète en mettant l’accent sur la spermatogenèse et la fonction testiculaire. Ceci est accompli en accédant d’abord au testicule via une incision abdominale directement au-dessus des glandes PrepU.

La deuxième étape consiste à préparer le canal efférent attaché aux testicules pour la micro-injection en libérant le vaisseau de son tissu adipeux. Ensuite, le canal ORL est perforé à l’aide d’une pipette de micro-injection chargée, et la solution de construction génétique de coloration est administrée aux tubules féreux testiculaires. La dernière étape est la transfection multilatérale par électroporation du testicule.

En fin de compte, le testicule transfecté est extrait au bout de trois jours afin d’évaluer la transfection par microscopie à fluorescence ou par mesure au luminomètre en fonction des constructions génétiques rapportées utilisées. Cette combinaison de la technique d’opération de l’intellect par micro-injection pour les testicules de souris en tant que méthodes de transfection transitoire offrira certainement de nombreux avantages par rapport aux approches existantes comme les animaux transgéniques ou les souris knock-out. Il garantit des performances rapides, un faible coût et le besoin de compétences techniques modérées.

Cette approche méthodologique pourrait, espérons-le, s’adapter à la technique disponible dans le domaine de la recherche sur la fertilité masculine. Il pourrait être essentiellement utile pour aborder un large éventail de questions concernant le génie expérimental et les processus de fertilité. Cela serait particulièrement possible lors de l’utilisation de cette méthode pour l’analyse génétique sous la forme d’expériences de gain de toute perte de fonction.

On peut supposer qu’il sera également très utile pour étudier les éléments régulateurs, par exemple, des gènes spécifiques de la spermatogenèse. Pour commencer la procédure, anesthésie une souris mâle âgée de six à huit semaines avec un mélange individuel de 10 % de kétamine et de 2 % de xylazine par voie sous-cutanée. Assurez-vous ensuite que la souris est sous anesthésie profonde en pinçant les orteils.

Appliquez de la pommade sur ses yeux pour prévenir la sécheresse. Ensuite, retirez les poils abdominaux avec un rasoir électrique et désinfectez ensuite la zone chirurgicale. Faites une incision ventrale directement au-dessus des glandes PrepU au centre de la région abdominale.

Pour cela, tirez sur la peau et effectuez une petite incision cutanée transversale. Continuez ensuite le long de la couche musculaire abdominale. Tirez soigneusement les coussinets de graisse abdominale pour exposer le testicule attaché et placez-le sur un papier stérile sur l’abdomen.

Par la suite, à l’aide d’un stéréomicroscope, trouver le canal ORL pour la microinjection. C’est la jonction des vaisseaux fins entre le testicule et l’épididyme, et est situé à côté de l’artère testiculaire. Retirez le tissu adipeux qui recouvre le canal ORL à l’aide d’une pince fine.

Après cela, placez le ductus de libération sur une bande de papier stérile, en vous assurant que le ductus est facilement visible sans nuire à l’environnement. Plus loin, connectez la pipette de micro-injection, qui a été chargée avec la solution plasmidique colorée auparavant, à l’unité d’injection du micromanipulateur. Après cela, placez l’aiguille de micro-injection parallèlement au conduit EENT avec la pointe pointant vers le testicule REIT.

Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler fine, dénuder le conduit sur la pipette de micro-injection. Assurez-vous que la pipette est maintenue parallèlement au conduit lorsque vous la tirez. Dirigez l’aiguille avec précaution vers le testicule et arrêtez-vous au moment où elle pénètre dans le FPI testicule directement sous la tunique albuginée.

Ensuite, réglez les paramètres du micro-injecteur. Par la suite, commencez à injecter la solution de construction génique. Surveillez l’ensemble du processus d’injection en observant l’état de remplissage des testicules.

À l’aide de la solution plasmidique colorée, ne construisez le testicule que jusqu’aux deux tiers de son volume. Pour permettre une électroporation efficace. Faites tremper les électrodes de la pince à épiler dans du PBS pour assurer une conductance adéquate.

Ensuite, pressez légèrement le test entre les électrodes humides et mesurez la résistance électrique avec l’électro parata. Ensuite, réglez l’électro de manière adéquate en veillant à ce qu’un courant puisse être appliqué au testicule avec un nombre total de huit impulsions carrées. À quatre sites testiculaires différents, effectuez l’électroporation complète autour de l’ensemble du testicule.

Une fois l’électroporation terminée, replacez le testicule dans l’abdomen aussi près que possible de son emplacement d’origine. La couche musculaire interne était donc une suture chirurgicale résorbable. Fermez ensuite la peau à l’aide de pinces de suture.

Laissez la souris récupérer de l’anesthésie. Dans une boîte stérile chauffée sur un coussin chauffant à 37 degrés Celsius, préparée avec du papier absorbant. Le coussin doit assurer le réchauffement d’une seule moitié de la cage, créant ainsi un gradient de chaleur.

De plus, couvrez la souris avec une autre feuille de papier absorbant pour réduire davantage le stress. Une fois que l’animal s’est complètement réveillé, transférez-le dans une nouvelle cage propre et entièrement équipée. Mais pour plus de récupération, surveillez le processus de récupération jusqu’à ce que vous rendiez enfin la souris à l’animalerie.

Cette figure montre l’ensemble des testicules de Mount trois jours après l’électroporation in vivo par détection de fluorescence, les testicules transfectés d’une souris noire C 57 six présentent une protéine fluorescente verte améliorée ou une protéine fluorescente rouge montrée. Voici les coupes histologiques d’un testicule. Trois jours après l’électroporation unilatérale avec PE eeg, FPC un, les cellules tubulaires séminifères transfectées sont illustrées par une fluorescence verte, ainsi que leur structure sphérique typique.

Leurs noyaux étaient contre-colorés avec deux pro trois en bleu. Pendant que vous effectuez cette procédure, il est important de garder à l’esprit que les processus d’identification du canal ORL et de libération de son tissu adipeux sont assez sophistiqués. Par conséquent, vous pouvez d’abord vous entraîner sur un animal mort avant d’accomplir une expérience réelle in vivo.

Suite à l’anti-procédé d’électroporation par micro-injection et de récolte d’essai finale, de nombreuses techniques peuvent être réalisées comme Q-R-T-P-P-C-R ship et Western blot. Par conséquent, la définition des modèles d’expression des protéines du gène testeur ainsi que les modifications post-traductionnelles sont pour acquis. Ainsi, au moyen de ces outils, une grande variété de sujets pourraient être attaqués, comme la spermatogenèse, par exemple, avec ses mécanismes et régulations complexes sous-jacents.