Isolement de cellules murines ganglions lymphatiques stromales

L’isolement des cellules stromales des ganglions lymphatiques est une procédure en plusieurs étapes comprenant la digestion enzymatique et la désagrégation mécanique pour obtenir des cellules réticulaires fibroblastiques, des cellules endothéliales lymphatiques et sanguines. Dans la procédure décrite, une digestion courte est combinée à une désagrégation mécanique automatisée pour minimiser la dégradation des marqueurs de surface des cellules stromales viables des ganglions lymphatiques.

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules stromales des ganglions lymphatiques. Ceci est accompli en perturbant d’abord la capsule des ganglions lymphatiques. Dans la deuxième étape, les fragments de ganglions lymphatiques sont digérés avec la collagénase quatre et la D nase un.

Les enzymes sont ensuite remplacées par la collagénase D et la D nase one, et les fragments sont désagrégés mécaniquement à l’aide d’une pipette multicanaux automatisée. En fin de compte, l’expression des molécules de surface cellulaire des cellules isolées des ganglions lymphatiques peut être caractérisée par cytométrie en flux. Le principal avantage de cette technique par rapport à la méthode existante est qu’avec cette méthode, les cellules SHR des ganglions lymphatiques sont digérées à l’aide d’une procédure enzymatique standardisée complétée par une désagrégation mécanique qui préserve la viabilité et l’expression des molécules de surface des cellules.

Commencez par placer les ganglions lymphatiques disséqués dans une boîte de Pétri stérile contenant deux millilitres de milieu glacé. Ensuite, utilisez deux seringues d’un millilitre équipées d’aiguilles de calibre 25 pour perturber les capsules des ganglions lymphatiques. Ensuite, transférez le tissu perturbé dans un tube conique de cinq millilitres contenant 750 microlitres de milieu, complété par de la collagénase quatre et de l’ADN un et un agitateur magnétique.

Placez ensuite le tube dans un bécher contenant de l’eau préchauffée à 37 degrés Celsius sur un agitateur magnétique et remuez les boues cellulaires à raison d’un tour par seconde pendant 30 minutes. Après avoir remué, laissez le fragment de ganglion lymphatique se déposer, puis retirez soigneusement le surnageant. Maintenant enrichi pour les cellules non stromales, transférez aux fragments de ganglions lymphatiques 750 microlitres de milieu frais, complété par la collagénase D et la collagénase D, puis remuez le tissu pendant cinq minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius.

Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux automatisée, désagréger les fragments de tissu des ganglions lymphatiques dans un volume de 700 microlitres pendant 10 cycles à vitesse maximale, puis remuez à nouveau les fragments de tissu après 10 minutes. De plus, désagrégez les amas de tissus à l’aide de la pipette multicanaux automatisée pendant 99 cycles à vitesse maximale. Ajoutez ensuite 7,5 microlitres d’EDTA 0,5 molaire dans le tube et mélangez la suspension tissulaire pendant 99 cycles supplémentaires avec la pipette automatisée.

Après le dernier cycle de désagrégation, ajoutez 750 microlitres de milieu à la solution cellulaire et filtrez les cellules à travers un treillis en nylon de 70 micromètres. Ensuite, granulez les cellules pendant cinq minutes à 1500 G et quatre degrés Celsius. Pour visualiser les populations de cellules stromales des ganglions lymphatiques par cytométrie en flux, colorez les échantillons de cellules appropriés avec un traqueur de morts vivants et les anticorps d’intérêt dans 100 microlitres de HBSS contenant 2 % de FCS pendant au moins 20 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.

Ensuite, lavez les cellules dans 500 microlitres de HBSS avec FCS et remettez-les en suspension. Les pastilles dans 100 microlitres de HBSS et de FCS font fonctionner les cellules sur un cytomètre en flux en excluant les cellules positives pour CD 45 afin d’exclure les cellules hématopoïétiques, puis la marche sur la population singulet vivante. Enfin, tracez GP 38 en fonction de CD 31 pour visualiser les cellules réticulaires de la zone T, les cellules endothéliales lymphatiques, les cellules endothéliales sanguines et les cellules doubles négatives.

Populations cellulaires. Le nombre total de cellules récupérées après la digestion des sous-ensembles de cellules stromales des ganglions lymphatiques était légèrement plus élevé dans le protocole qui vient d’être démontré par rapport aux protocoles Link et Fletcher, démontrant que la viabilité des cellules stromales des ganglions lymphatiques après isolement par ce protocole est similaire à celle récupérée à l’aide des protocoles publiés. Les cellules réticulaires de la zone T et les cellules endothéliales lymphatiques isolées via ce protocole et les protocoles de liaison et de Fletcher ont été comparées pour l’expression de l’IAB CD un 40, d’un CD 80, d’un L un et d’un CD 40.

L’expression des cinq molécules de surface était plus élevée lors de la digestion avec le protocole qui vient d’être démontré et le protocole de liaison pour les deux sous-ensembles de cellules stromales, ce qui suggère que la dégradation de certaines molécules de surface par la collagénase quatre et D est moins robuste qu’avec la collagénase p et l’espace DYS. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler avec succès les quatre principales sous-populations de cellules du stroma des ganglions lymphatiques tout en préservant l’expression de plusieurs molécules de surface utiles pour leur caractérisation et leur analyse ultérieures.