Analyse rapide des aberrations chromosomiques dans les lymphocytes B de souris par PNA-FISH

L’objectif général de l’expérience suivante est de quantifier l’instabilité génomique dans les lymphocytes B de souris. Ceci est réalisé en isolant d’abord les cellules B pour la culture cellulaire primaire. Ensuite, les cellules sont fixées, ce qui facilite la préparation des étalements de métaphase.

Enfin, l’analyse des télomères PNA fish est réalisée pour la visualisation des télomères marqués par fluorescence. En fin de compte, le niveau de divers types d’aberrations chromosomiques peut être quantifié par microscopie fluorescente. Les implications de cette technique peuvent élargir notre compréhension des voies de réparation de l’ADN, car elle peut aider à identifier les gènes qui favorisent la stabilité génomique dans nos modèles de souris ciblés.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les cassures chromosomiques et d’autres réarrangements chromosomiques importants, elle peut également être adaptée pour mesurer d’autres formes d’instabilité génomique telles que les translocations. Pour isoler les lymphocytes B, commencez par placer une rate fraîchement isolée dans une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres contenant deux millilitres de tampon de lavage dans une hotte à flux laminaire. Utilisez ensuite l’extrémité arrière du piston d’une seringue de cinq millilitres pour faire macérer doucement la rate.

Ensuite, filtrez la boue de tissu à travers une passoire en maille de nylon de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres à l’aide du piston pour presser doucement les plus gros morceaux de tissu à travers la passoire. Rincez la plaque et la seringue avec huit millilitres de tampon de lavage et filtrez le lavage à travers la passoire. Ensuite, après avoir fait tourner les cellules, pipetez la pastille de haut en bas plusieurs fois dans trois millilitres d’un tampon de lyse CK.

Après cinq minutes, arrêtez la réaction avec 10 millilitres de tampon de lavage. Ensuite, après avoir fait tourner à nouveau les cellules, tapotez le bas du tube pour remettre la pastille en suspension et ajoutez un millilitre de tampon de lavage aux cellules. Ensuite, incubez les cellules avec 50 microlitres de microbilles anti CD 43 max sur glace.

Après 30 minutes, lavez délicatement les cellules dans 10 millilitres de tampon de lavage. Pendant la centrifugation, placez une colonne minimax sur l’aimant et un tube conique de 15 millilitres étiqueté sous la colonne. Ajoutez ensuite un millilitre de tampon de lavage dans la colonne, en recueillant l’EIT dans le tube.

Remettez en suspension la pastille de cellule dans un millilitre de tampon de lavage, puis chargez les cellules sur la colonne Une fois l’échantillon écoulé, rincez la colonne avec un millilitre de tampon de lavage et ajoutez sept millilitres de tampon de lavage directement à l’échantillon collecté. Après avoir compté les cellules collectées, transférez-les dans un tube de 50 millilitres pour la centrifugation. Ensuite, pour activer les cellules B, remettez la pastille en suspension à une fois 10 des six cellules par millilitre dans un milieu de cellules B supplémenté et incubez les cellules dans des plaques à six puits à cinq millilitres de cellules par puits dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour fixer les cellules B.

Ensuite, à 50 microlitres de smid à chacun des puits. Après une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius, transférez les lymphocytes B dans un tube de 15 millilitres étiqueté. Couvrez l’étiquette avec du ruban adhésif et faites tourner les cellules.

Ensuite, aspirez tout le surnageant sauf environ un millilitre et remettez le granulé en suspension par pipetage. Ajoutez cinq millilitres de 37 degrés Celsius, du chlorure de potassium, goutte à goutte tout en pulsant sur un vortex. Ajoutez ensuite 10 millilitres supplémentaires de chlorure de potassium et mélangez la solution cellulaire par inversion.

Ensuite, incubez les cellules dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ajoutez ensuite cinq gouttes de mélange fixateur frais une fois de plus en inversant. Ensuite, faites tourner les cellules après avoir suspendu la pastille dans un millilitre de surnageant, ajoutez cinq millilitres de fixateur frais, goutte à goutte tout en pulsant sur un vortex et incubez les cellules et 10 millilitres supplémentaires de fixateur à température ambiante.

Après 30 minutes, granulez les cellules et retirez tout le fixateur sauf un millilitre. Ensuite, après avoir lavé les cellules, deux fois de plus dans 15 millilitres de fixateur, mettez à nouveau en suspension le granulé dans les 70 derniers microlitres du surnageant. Placez maintenant les lames étiquetées à un angle de 35 degrés dans une chambre d’humidité réglée à 22,9 degrés Celsius et 52 % d’humidité.

Déposez 35 microlitres de lymphocytes B remis en suspension sur chaque lame, en préparant deux lames par échantillon. Ensuite, après avoir laissé sécher les lames dans la chambre d’humidité pendant 30 minutes, stockez les lames dans une boîte à diapositives à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches. Une fois sec, utilisez un stylo diamant pour marquer une zone de 18 par 18 millimètres pour l’hybridation au dos de chaque lame afin de dénaturer les lames pour les poissons.

Ensuite, appliquez 120 microlitres de forme amide déionisée à 70 % sur des lamelles de 24 millimètres sur 60 millimètres, puis touchez chaque lame sur une lamelle. Dénaturez les lames sur une plaque chauffante à 80 degrés Celsius pendant 90 secondes, puis faites glisser rapidement et soigneusement les lamelles et consécutivement. Placez les lames dans de l’éthanol glacé à 70, 90 et 100 % chacune pendant trois minutes Une fois les lames sèches, placez les lames dans une chambre humide et appliquez le mélange de sonde nécessaire sur les zones marquées sur les lames.

Couvrez le mélange de sonde avec une lamelle de 18 x 18 millimètres et incubez les lames à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, lavez les diapositives dans les deux XSSC pré-avertis en les secouant. Après cinq minutes, appliquez 35 microlitres de support de montage moyal sur les lames.

Couvrez le support avec des lamelles de 24 millimètres sur 60 millimètres et stockez les lames à quatre degrés Celsius. Enfin, analysez les lames de métaphase à l’aide d’un microscope à épifluorescence standard. Les chromosomes en métaphase dérivés d’une cellule de souris doivent former un groupe discret contenant 40 chromosomes.

Chaque chromosome a un centromère à une extrémité, près de deux signaux de télomères, ainsi que deux signaux de télomères supplémentaires à l’autre extrémité du chromosome. Les cassures chromatidiennes sont des cassures dans l’une des deux chromatides sœurs qui composent chaque chromosome de métaphase. Dans certains cas, l’extrémité cassée du chromosome peut être observée comme un fragment avec des signaux de télomères dans la même métaphase étalée.

Les radiochromosomes sont des réarrangements complexes impliquant deux chromosomes. Les chromosomes peuvent également se joindre pour former des chromosomes dicentriques, qui apparaissent comme des fusions de chromosomes de bout en bout avec des centromères aux deux extrémités. Les translocations robertsoniennes sont un type de translocation entre les centromères de deux chromosomes, qui apparaissent comme quatre bras chromataires frères attachés à un seul centromère.

Dans cette dernière image, une métaphase qui n’a pas de signaux de télomères présents est montrée. Une absence de signaux télomères peut se produire à cause d’erreurs dans la préparation de la sonde ou de bulles d’air sous la lamelle pendant l’hybridation. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse du cycle cellulaire et les informations sur le côlon peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que l’instabilité génomique accrue affecte-t-elle la viabilité cellulaire.