Name: Souris foetal entier Intestin Système de culture pour Ex Vivo Manipulation des voies de signalisation et dimagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Apprenez à cultiver des intestins fœtaux de souris entiers ex vivo pour étudier le développement des villosités par imagerie en direct en trois dimensions. Cette méthode permet de moduler les voies de signalisation et d'observer l'organogenèse intestinale.

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Nous remercions la Dre Deborah L. Gumucio en tant que conseillère et pour son soutien inestimable dans la définition de la culture et des méthodes d’imagerie. Nous remercions également le Dr Jim Brodie, le Dr Hong-Xiang Lu, la Dre Charlotte Mistruta et la Dre Ann Grosse pour leurs contributions au développement du système de culture d’organes de l’intestin entier. D’excellents conseils ont été prodigués par le Dr Chip Montrose, Michael Czerwinski et Sasha Meshinchi. Toutes les images ont été réalisées dans le laboratoire de microscopie et d’analyse d’images de l’Université du Michigan. Le soutien financier a été fourni par NIH R01 DK065850.

NOTE: Toutes les souris ont été traitées avec humanité en utilisant des protocoles approuvés par l&#39;Université du Michigan Medical School Unité de médecine de laboratoire et les animaux selon les directives du Comité de l&#39;Université sur l&#39;utilisation et l&#39;entretien des animaux. 1 Tout le Système de culture d&#39;organes <ol><li> Préparation des milieux et des plaques de culture <ol><li> Dans une culture de tissu capot, enlevez 5 ml de BGJb médias de la bouteille de et ajouter 5 ml de Pen / Strep. Préparer un stock de travail des médias dans un tube conique de 50 ml, en ajoutant 1 ml de 5 mg / ml d&#39;acide ascorbique à 49 ml de BGJb médias (avec Pen / Strep). </li><li> Préparer une plaque de culture à 6 puits en ajoutant 1 ml de chacune des sous transwell. NOTE: Si les 6 transwell ne sont pas utilisés, déplacer transwell supplémentaires dans une plaque à 6 puits stérile frais pour une utilisation ultérieure. Ajouter 3 ml de travailler BGJb médias à chacune des trois boîtes de Pétri de 10 cm stériles. </li></ol></li><li> Préparation pour la dissection <ol><li> Faire tremper les outils de dissection dans 70% ethanol et être sûr de garder les outils propres tout en travaillant. </li><li> Mettre en place la zone de dissection avec un grand seau à glace et placer la plaque de culture à 6 puits et 10 cm boîtes de Pétri avec BGJb médias sur la glace. Travailler sur la glace autant que possible, tout en disséquant et la préparation des intestins de la culture. </li><li> Anesthésier les souris femelles adultes dans une chambre avec isofluorane (100 pi) avant l&#39;euthanasie par dislocation cervicale pour la récolte de l&#39;intestin du foetus. </li><li> Après la récolte, les fœtus de leur mère, en scène chaque fœtus soigneusement selon le tableau 13 Theiler mise en scène. Ne vous fiez pas aux jours post-coït pour déterminer l&#39;âge de chaque fœtus comme des variations allant jusqu&#39;à 24 heures dans le stade de développement sont régulièrement observés dans une seule portée. </li></ol></li><li> Dissection de l&#39;intestin du foetus <ol><li> Euthanasier fœtus par décapitation avant le retrait de l&#39;intestin. </li><li> Disséquer chaque intestin en tampon phosphate salin (DPBS) de 1x Dulbecco puis plaCE dans une boîte de Pétri de 10 cm de travailler BGJb médias. </li><li> Retirez délicatement la rate de l&#39;estomac et le pancréas de l&#39;estomac et du duodénum supérieur. </li><li> Séparez délicatement l&#39;épiploon prenant soin de laisser l&#39;épiploon attachée autant que possible et en séparant seulement assez de connexions pour permettre à l&#39;intestin pour être redressé. NOTE: Pour les intestins plus que E14.5 ou ceux qui sont mis en culture pendant plus de 24 heures, séparer délicatement l&#39;intestin en 3 segments égaux pour permettre contenu luminal de couler à travers l&#39;intestin et être expulsés des extrémités coupées. Toutefois, pour les cultures commencé avant E13.5, attendre après 24 heures de culture avant de se séparer les 3 segments de l&#39;intestin pour permettre la séreuse de croître correctement sur toute la longueur de l&#39;intestin. </li><li> Utilisez une pipette de bouche pour transférer les morceaux intestinales sur les transwell de la plaque de culture (1.1.2). </li><li> Repositionner délicatement les intestins au besoin afin qu&#39;ils soient directement à travers la transwell. NOTE: Une fois que les intestins commencent à s&#39;installer contenu luminal dans le tube, les plier dans l&#39;intestin entraînera une sauvegarde et des dommages à l&#39;intestin. </li></ol></li><li> Culture et le traitement <ol><li> Retirez le support sous le transwell, ajouter 700 ul de milieu de traitement (médias travaillent avec des protéines recombinantes ajoutés ou des inhibiteurs pharmacologiques) dans le cadre du transwell. </li><li> Ajouter 300 ul de milieu de traitement goutte à goutte sur le dessus de l&#39;intestin et laisser tremper à travers le transwell. Repositionner les intestins comme nécessaire. </li><li> Changer agents de traitement au moins une fois par jour ou plus souvent fonction de la demi-vie du réactif de traitement. </li></ol></li><li> Préparation de protéine des billes d&#39;agarose imprégné d&#39;une source localisée de réactif de traitement <ol><li> Remettre en suspension les billes d&#39;agarose dans leur conteneur de stockage et transférer 100 pl de billes d&#39;agarose dans un tube à centrifuger de 1,5 ml. </li><li> Remplir le volume restant du tube avec 1x stérile Phosphate solution saline tamponnée (PBS) et mélanger les perles pour les laver. Placez le tube de centrifugeuse dans un rack pendant quelques minutes pour permettre aux billes de se déposent au fond et puis pipette au large de la PBS à partir au-dessus des perles. Remplir le tube de centrifugeuse stérile de PBS 1x et répéter deux fois plus le processus de lavage. </li><li> Préparation de la protéine d&#39;intérêt à deux fois la concentration désirée pour le traitement. </li><li> Mélanger 5 pi de billes d&#39;agarose lavés avec 5 pi de la protéine actions 2x et agiter doucement les perles dans la protéine. Placer le tube sur la glace pendant 1 heure, en mélangeant délicatement toutes les 10-15 min. </li><li> Rincer les perles brièvement stérile 1x PBS avant de placer les perles sur les intestins. </li></ol></li><li> Placement des billes d&#39;agarose <ol><li> Placez délicatement les billes d&#39;agarose sur le dessus de l&#39;intestin à l&#39;aide d&#39;une pipette de bouche avec des aiguilles capillaires tirés. Placez les perles avec une extrême prudence, car une manipulation brutale peut endommager l&#39;intestin et prévenir le développement des villosités dans la zone lésée. </li><li> Placez deux fois plus de billes que nécessaire pour l&#39;analyse depuis les intestins vont subir les mouvements péristaltiques et environ la moitié des billes placées roulera hors de l&#39;intestin au cours de la durée de la culture. </li></ol></li><li> Fixation des intestins culture <ol><li> Retirez délicatement les médias de traitement de dessous de la transwell et permettre aux intestins sécher à l&#39;air pendant 3 min. </li><li> Ajouter 1 ml de fixatif sous la Transwell pendant 2 min, puis recouvrir la partie supérieure de l&#39;intestin avec 2 ml de fixatif pour le reste de la période de fixation. Fixer avec 4% de paraformaldéhyde O / N à 4 ° C ou pendant 2 heures à température ambiante. </li></ol></li></ol> 2. imagerie de l&#39;intestin fixes <ol><li> Imagerie Wholemount <ol><li> Placez les intestins entiers (avec fluorescence endogène) sur une diapositive avec 100 pi de 1x DPBS. Utilisez une pince à organiser doucement les intestins. </li><li> Utilisez un tissu de laboratoire pour retirer soigneusement les DPBS et ajouter immédiatement 100 pi de 70% de glycérol à faire la mo tissure transparente et augmenter la profondeur possible de l&#39;imagerie. REMARQUE: Si une plus grande pénétration de l&#39;intestin est souhaité, au lieu de monter l&#39;intestin dans 70% de glycérol, tremper l&#39;intestin dans quelques gouttes d&#39;orientation claire solution pour 10-30 min. Pipeter au large de la solution mise au point claire et monter l&#39;intestin avec le Mont Effacer. </li><li> Tremper chaque des quatre coins d&#39;une lamelle en pâte à modeler et ramasser une petite quantité d&#39;argile à utiliser comme entretoises entre la lame et lamelle pour maintenir la lamelle de l&#39;aplatissement de l&#39;intestin. </li><li> Sceller la lamelle sur la lame avec valap fondu appliquée avec un coton-tige. </li><li> L&#39;image sur les intestins soit un microscope confocal debout ou inversé. S&#39;il vous plaît se référer à la discussion pour plus de détails. </li></ol></li><li> Vibratome sectionnement de l&#39;intestin fixes (pour une vue en coupe transversale de structures intestinales) <ol><li> Intégrer dans les intestins 7% d&#39;agarose dans de petits moules en plastique (10 x 10 x 15 mm) et permettre aux blocs d&#39;agarose àrefroidir et se solidifier. </li><li> Retirer des blocs d&#39;agarose à partir de moules en plastique et des blocs d&#39;agarose colle à l&#39;étape de collecte de vibratome avec de la colle instantanée. </li><li> Remplir le stade de la collecte de froid de glace 1x DPBS. </li><li> Couper des sections à une épaisseur comprise entre 100-150 um. Pour les sections plus épaisses utilisent les solutions de compensation (décrits dans la section 2.1.2) pour visualiser plus profondément dans la section. </li><li> Verser vibratome sections de l&#39;étape de la collecte dans un puits d&#39;une plaque à 6 puits pour le stockage à 4 ° C. </li></ol></li><li> Immunofluorescence, de tissus vibratome sectionnés fixes <ol><li> Placez 5-12 sections vibratome par puits dans une plaque de 24 puits avec 1x DPBS. </li><li> Retirer 1x DPBS et ajouter 500 ul de solution de perméabilisation par puits. Secouez délicatement les échantillons pendant 25 min à température ambiante. </li><li> Après perméabilisation, laver les échantillons 3 fois avec du PBS 1X. </li><li> Bloquer les échantillons pendant au moins 30 min dans 500 pi de solution de blocage. </li><li> Après blocage, eXCHANGE la solution de blocage avec 500 ul d&#39;anticorps primaire dilué dans la solution de blocage et conserver les échantillons à 4 ° CO / N. REMARQUE: Les dilutions d&#39;anticorps primaires qui fonctionnent bien sur des coupes congelées et paraffine fonctionnent généralement bien sur vibratome sections aussi, cependant anticorps nécessitant l&#39;extraction de l&#39;antigène nucléaire en général ne fonctionnent pas bien avec ce protocole (par exemple, BrdU). </li><li> Le jour suivant, laver les échantillons 3 fois pendant 15 min à chaque fois avec une solution de blocage. </li><li> Après lavage, 500 ul d&#39;appliquer l&#39;anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage. Enveloppez la plaque de 24 puits dans du papier d&#39;aluminium pour protéger les fluorophores de la lumière et de la roche les échantillons pendant 45 minutes à 2 heures à température ambiante. </li><li> Laver les échantillons 3 fois avec du PBS 1X pendant 15 minutes chacun et monter les sections de vibratome sur des lames comme décrit à la section 2.4. </li></ol></li><li> Montage sections vibratome <ol><li> Préparer des lames pour vibratome de montage par couper de fines tranches de double-stick bande et en les plaçant sur les côtés longs des lamelles. </li><li> Placez délicatement 5-10 sections vibratome entre le ruban adhésif double-bâton sur les lames dans une goutte de 100 pi de PBS 1x. </li><li> Déplier toutes les sections et les étaler en une seule couche sur la diapositive. </li><li> Retirez tout excès d&#39;agarose ou des morceaux inégaux qui empêcherait une lamelle de siéger plat. </li><li> Soigneusement utiliser un tissu de laboratoire pour absorber l&#39;excès de PBS 1x autour des sections de vibratome. </li><li> Ajouter une goutte de milieu de montage aqueux sur des sections de vibratome et lamelle. </li><li> Sceller les lamelles sur les lames avec fondu valap appliquée avec un coton-tige. </li><li> Image, les sections de vibratome sur soit un microscope confocal droit ou inversé. S&#39;il vous plaît se référer à la discussion pour plus de détails sur la sélection d&#39;un système d&#39;imagerie. </li></ol></li></ol> 3. imagerie en direct de l&#39;intestin entiers Intestins récolté de fetuses après E12.5, avec l&#39;épiploon connecté laissée intacte, développer avec succès villosités en culture en utilisant le système ci-dessus. Par conséquent, ce système ex vivo permet la capture d&#39;images en direct z-section de l&#39;intestin de développement qui peut être reconstituée pour une vue en trois dimensions de la morphogenèse au cours du temps. <ol><li> Mise en place d&#39;imagerie en temps réel <ol><li> Utilisez de la colle instantanée à respecter une membrane de polycarbonate individu à un tamis à mailles fines. Cela fournit un échafaudage de support pour maintenir l&#39;intestin en place sous l&#39;objectif de trempage du microscope confocal verticale. S&#39;il vous plaît se référer à la section de discussion pour plus de détails sur la sélection de microscopes d&#39;imagerie en direct. </li><li> Placer le tamis dans le puits central d&#39;une plaque de culture. </li><li> Placer l&#39;intestin disséqué sur la membrane de polycarbonate et on ajoute une goutte de colle instantanée à chaque extrémité. Utilisez seulement assez de colle pour fixer l&#39;intestin, mais pas l&#39;enduire! </li><li> Ajouter culture libre de médias de phénol rouge ci-dessous le polycarbonatemembrane dans le puits central de la plaque de culture. </li><li> Ajouter de l&#39;eau à la bordure extérieure de la plaque de culture à fournir de l&#39;humidité. </li><li> Depuis l&#39;intestin foetal subit ondes péristaltiques analogues de contraction dans la culture, ajouter 100 ul d&#39;une solution 1: 5 de xylazine dans du PBS 1x à 3 ml de milieu à contrôler les mouvements de l&#39;intestin, tandis que l&#39;imagerie. Cette posologie sera de contrôler les mouvements intestinaux pour environ 8-10 heures sans compromettre le développement des villosités. </li><li> Pour une vue transversale de l&#39;intestin, intégrer les intestins vivants dans une solution d&#39;agarose à 3-4% et couper des sections épaisses (150-500 de um) sur un vibratome. Correspondre à la rigidité de l&#39;agarose avec la rigidité de l&#39;intestin étant déterminée empiriquement et couper le stade de développement. En général, une solution d&#39;agarose à 3% fonctionne bien pour les intestins de moins de E14.5 et une solution à 4% fonctionne bien pour les intestins E15-E16. </li><li> Coller les sections de vibratome à une membrane de polycarbonate, apposée sur un tamis à mailles (comme dans la section 3.1.1) etculture comme décrit dans la Section 3.1.2-3.1.6. </li><li> Effectuer l&#39;imagerie en temps réel en utilisant un microscope confocal à fluorescence à deux photons (laser d&#39;excitation entre 690-1,040 nm) sur un support vertical avec une table réglable. </li><li> Laser à deux photons réglé à 900 nm permet une pénétration profonde avec la meilleure résolution pour les signaux de GFP. Il réduit les dommages aux tissus en imagerie. En outre, le réglage de la puissance du laser pour l&#39;émission le plus bas possible pour réduire les dommages des tissus. En général pour obtenir une bonne excitation de la GFP, en utilisant 12% de la puissance du laser à deux photons. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n’ont aucun conflit financier à divulguer.

La nature dynamique et les interactions de tissus complexes de l&#39;intestin en développement exige une visualisation 3D d&#39;avoir une appréciation complète de ces événements morphogénétiques. Avec l&#39;évolution des technologies d&#39;imagerie, la capacité d&#39;examiner en détail la morphogenèse des villosités se développe / amélioration et, avec elle, la compréhension de la communication spatiale et interaction pendant l&#39;organogenèse est grandement améliorée. Des méthodes alternat...

Chaque villosité intestinale est composée de deux compartiments tissulaires principaux : une couche superficielle épithéliale et un noyau mésenchymateux. L’intestin grêle de la souris se forme au 10e jour embryonnaire lorsqu’une feuille d’endoderme se ferme et se scelle pour former un tube d’épithélium entouré de cellules mésenchymateuses3. Ce tube plat d’épithélium subit une prolifération rapide, augmentant à la fois en longueur et en circonférence et subit des réarrangements spectaculaires impliquant des changements dynamiques de forme cellulaire1. Dans le même temps, le mésenchyme environnant subit également de nombreux processus de développement, notamment la formation du plexus vasculaire, la différenciation des muscles lisses et le recrutement des neurones entériques4. Dans l’intestin grêle proximal au 14,5e jour embryonnaire, des condensations (grappes) de cellules sensibles à Hedgehog et PDGF commencent à se former à côté de l’épithélium2,5. La formation d’amas mésenchymateux continue de s’étendre sur toute la longueur de l’intestin de sorte qu’ils couvrent l’intégralité de l’intestin grêle au jour embryonnaire 16,52. Au fur et à mesure que les amas mésenchymateux se forment, les cellules épithéliales les plus proches des amas commencent à se retirer du cycle cellulaire, tandis que les autres cellules épithéliales continuent de proliférer. Les cellules situées directement au-dessus de l’amas mésenchymateux qui se sont retirées du cycle cellulaire commencent à changer de forme lorsque les villosités émergentes se déforment dans la lumière. La croissance ultérieure des villosités est en partie due à la prolifération continue de l’épithélium entre les villosités émergentes. Les amas mésenchymateux restent étroitement adhérents à l’épithélium des villosités en croissance et continuent d’exprimer une variété de molécules de signalisation. La vague d’émergence des villosités se propage sur toute la longueur de l’intestin grêle suite à la formation d’amas mésenchymateux. Au fur et à mesure que l’intestin continue de croître et que la région des villosités intervillosités s’étend entre les villosités émergentes, de nouveaux amas mésenchymateux se forment à côté de l’épithélium des villosités intervillosités et d’autres cycles d’émergence et de croissance s’ensuivent.
Le développement synchronisé de l’épithélium et du mésenchyme est essentiel pour la morphogenèse des villosités. Les molécules de signalisation sont sécrétées d’une couche à l’autre où les récepteurs reçoivent et transduisent le message du signal afin de coordonner le développement entre l’épithélium et le mésenchyme. Les amas mésenchymateux agissent comme des centres de signalisation et expriment une variété de morphogènesdéveloppementaux 7-10. La perturbation de la formation ou du motif des grappes entraîne la perte de l’émergence et du motif des villosités. L’inhibition de la signalisation PDGF entraîne moins de grappes et moins de villosités et les villosités qui se forment sont déformées après les grappes anormales11. La perte de la signalisation Hedgehog entraîne une perte complète de la formation des grappes et l’échec de l’émergence des villosités2,12. Ensemble, ces données démontrent que les amas coordonnent le développement de l’épithélium des villosités avec son noyau mésenchymateux.
En utilisant l’ensemble de ce système de culture d’organes, nous sommes en mesure de modifier la signalisation impliquée dans la diaphonie des amas épithéliaux-mésenchymateux pour déterminer le rôle de ces signaux dans la morphogenèse des villosités. Le sectionnement et la reconstruction optiques confocaux à deux photons permettent de visualiser la formation des amas et l’émergence des villosités en trois dimensions et de mieux comprendre les relations spatiales entre les amas mésenchymateux et leur épithélium sus-jacent. En étendant le système de culture à quatre dimensions, nous pouvons capturer des piles z de grappes et de villosités en développement au fil du temps et observer ces interactions. En fin de compte, la capacité de suivre le développement des villosités de cette manière et d’observer les changements qui se produisent avec une signalisation altérée révolutionnera la compréhension des interactions mésenchymateuses épithéliales dans la morphogenèse des villosités.

<table><tbody><tr><td>Pince à dissection fine&nbsp ;</td><td>Outils de science fine</td><td>&nbsp ; 11254-20</td><td>2 paires</td></tr><tr>d’éthanol <td></td><td></td><td></td><td>à 70 %</td></tr><tr><td>1x solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) stérile.</td><td></td><td>14040-133</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>6 puits</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>24 puits</td><td>Costar&nbsp ;</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri 60 x 15 mm</td><td>Falcon</td><td>&nbsp ; </td><td></td>451007</tr><tr><td>Plaques Transwell, inserts de 24 mm, membranes en polycarbonate de 8,0 mm Corning</td><td>Costar&nbsp ;</td><td>3428</td><td>6 inserts par plaque</td></tr><tr><td>BGJb media</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>12591-038</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>de PenStrep (10 000 U/ml de pénicilline ; 10 000 mg/ml de streptomycine)</td><td>Gibco</td><td>&nbsp ; 15140</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A0278</td><td>faire 5 mg/ml de bouillon, filtrer, aliquote et stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Pipette à bouche (ensemble de tube d’aspirateur Drummond 1-15 pouces)</td><td>Fisher</td><td>&nbsp ; 21-180-10</td><td>Retirez l’ensemble aspirateur et remplacez-le par un 1 000 &micro ; l pointe de pipette qui agit comme un adaptateur pour brancher une pipette Pasteur en verre de 6 pouces.</td></tr><tr>Pipettes <td></td><td></td><td></td><td>pasteur en verre de 6 pouces</td></tr><tr><td>Tubes capillaires</td><td>World Precision Instruments&nbsp ;</td><td>TW100F-4</td><td>tirer sur les aiguilles</td></tr><tr><td>4 % de paraformaldéhyde</td><td></td><td></td><td>fabriqué en 1 x PBS, pH à 7,3</td></tr><tr><td>Plaques de culture</td><td>Falcon&nbsp ;</td><td></td><td></td>353037</tr><tr><td>Moustiquaire en acier inoxydable à mailles fines</td><td>achat en quincaillerie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membranes en polycarbonate</td><td>Thomas scientific&nbsp ;</td><td>4663H25</td><td>alternativement, coupez les membranes Corning Costar 3428 sur les supports transwell</td></tr><tr><td>Achat instantané de colle</td><td>à la quincaillerie</td><td>à base de gel de</td><td></td>préférence</tr><tr><td>35 x 10 mm</td><td>Falcon&nbsp ;</td><td></td><td></td>351008</tr><tr><td>7 % d’agarose</td><td>Sigma</td><td>&nbsp ; A9414</td><td>préparer w/v dans 1x DPBS, chauffage pour dissoudre dans un bain d’eau</td></tr><tr><td>minutien pins</td><td>Fine Science Tools&nbsp ;</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Milieux sans rouge de phénol (DMEM)</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (100 mg/ml)</td><td>AnaSed&nbsp ;</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356231</td><td>matrice de membrane basale, facteur de croissance réduit, sans rouge de phénol</td></tr><tr><td>3-4 % d’agarose</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A9414</td><td>préparer w/v dans 1x DPBS, chauffage pour dissoudre dans un bain d’eau</td></tr><tr><td>Imagerie des intestins</td><td></td><td></td><td></td>fixes</tr><tr><td>Nom du matériel/de l’équipement</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires/Description</td></tr><tr>achat de<td>vaseline</td><td>à la</td><td></td> pharmacie <td>utilisée pour fabriquer VALAP : parts égales vaseline, lanoline, paraffine</td></tr><tr><td>lanoline</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>L7387</td><td>utilisé pour fabriquer VALAP : parts égales de vaseline, lanoline, paraffine,</td></tr><tr><td>paraffine</td><td>Surgipath</td><td>39601006</td><td>utilisé pour fabriquer VALAP : parts égales de vaseline, de lanoline, de paraffine</td></tr><tr><td>70 % de glycérol dans 1 x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Focus clear et Mount Clear</td><td>CelExplorer Labs Co.</td><td>&nbsp ; F101-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Pâte à modeler</td><td>achat dans un magasin</td><td></td><td></td>de fournitures d’art</tr><tr><td>double ruban</td><td></td><td></td><td></td></tr> adhésif <tr><td>coton-tige écouvillons moules</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>en plastique, 10mm x 10mm x 5 mm)</td><td>Tissue Tek&nbsp ;</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>lames</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lamelles lingettes</td> de laboratoire Kimberly Clark 34155 peluches lingettes tâches délicates <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Theiler tableau de stadification&nbsp ;</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/%20downloads/theiler2.pdf">http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ téléchargements/theiler2.pdf</a></td></tr><tr><td>Microscope confocal Leica SP5X&nbsp ;</td><td>Leica</td><td></td><td>Utilisé pour réaliser l’imagerie en direct&nbsp ;</td></tr><tr><td>Support Leica DMI 6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Utilisé pour réaliser l’imagerie en direct&nbsp ;</td></tr><tr><td>Milieu de montage aqueux (Prolong Gold)</td><td>Sondes moléculaires&nbsp ;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Nom du matériau/de l’équipement</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires/Description</td></tr><tr><td>24 plaque de puits</td><td>Costar</td><td>&nbsp ; 3524</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>T-8787</td><td>utilisé pour fabriquer une solution de perméabilisation : 0,5 % Triton X-100 dans 1 x</td></tr><tr><td>sérum</td><td></td><td></td> de chèvre PBS <td>utilisé pour fabriquer une solution de blocage : 4 % de sérum de chèvre, 0,1 % de Tween20 dans 1 x PBS</td></tr><tr><td>Tween20&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>&nbsp ; Réf. P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

souris foetal entier intestin système de culture pour ex vivo manipulation des voies de signalisation et d'imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

La plupart des processus morphogénétiques dans l&#39;intestin du foetus ont été déduites à partir des coupes minces de tissus fixés, présenter des instantanés de changements au cours des stades de développement. Des informations en trois dimensions à partir de coupes sériées minces peut être difficile à interpréter en raison de la difficulté de reconstituer des coupes en série et parfaitement maintenir l&#39;orientation correcte du tissu sur coupes sériées. Les études récentes de Grosse et al., 2011 soulignent l&#39;importance des trois dimensions informations pour comprendre la morphogenèse des villosités de l&#39;intestin en développement 1. Reconstruction tridimensionnelle de cellules intestinales individuellement marqués ont démontré que la majorité des cellules épithéliales de l&#39;intestin contact avec les deux surfaces apicales et basales. En outre, la reconstruction en trois dimensions du cytosquelette d&#39;actine à la surface apicale de l&#39;épithélium a démontré que la lumière intestinale est continue et que les lumières secondaires sont un artefact de sectioning. Ces deux points, ainsi que la démonstration de la migration nucléaire interkinetic dans l&#39;épithélium intestinal, définis l&#39;épithélium intestinal en développement un épithélium pseudo et non stratifiées comme le pensait auparavant 1. La capacité d&#39;observer l&#39;épithélium en trois dimensions a été décisif pour démontrer ce point et la redéfinition de la morphogenèse épithéliale dans l&#39;intestin du foetus. Avec l&#39;évolution des technologies d&#39;imagerie multi-photonique et logiciel de reconstruction tridimensionnelle, la capacité de visualiser intact, le développement des organes s&#39;améliore rapidement. Excitation à deux photons permet une pénétration moins dommageable plus profondément dans les tissus à haute résolution. Imagerie à deux photons et la reconstruction 3D de l&#39;ensemble des intestins de souris fœtales à Walton et al., 2012 ont contribué à définir le modèle de villosités excroissance 2. Nous décrivons ici un ensemble de système de culture d&#39;organe qui permet le développement ex vivo de villosités et extensions de ce système de culture pour permettreles intestins pour être en trois dimensions imagé au cours de leur développement.

Culture des explants entiers de l'intestin fœtal permet l'analyse de la localisation, la distribution, et la durée des molécules de signalisation qui coordonnent le développement intestinal, comme ce système permet la manipulation de la signalisation avec des réactifs pharmacologiques ou des protéines recombinantes. Le système de culture Transwell (Figure 1A, reproduit à partir de Walton et al., 2012) 2 fournit une interface air-liquide, ce qui permet de placer la drogue ou de protéi...

La technologie d’imagerie améliorée permet l’imagerie tridimensionnelle des organes au cours du développement. Nous décrivons ici un système complet de culture d’organes qui permet l’imagerie en direct des villosités en développement dans l’intestin fœtal de la souris.

Souris foetal entier Intestin Système de culture pour Ex Vivo Manipulation des voies de signalisation et d'imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

L’objectif global de cette procédure est de cultiver des cultures d’organes entiers d’intestins embryonnaires de souris, ex vivo, permettant ainsi la modulation des voies de signalisation cellulaire. Ceci est accompli en prélevant d’abord des intestins de souris sur des fœtus entre le 12,5e et le 18e jour embryonnaire. La deuxième étape consiste à placer les intestins dans une plaque de culture transwell ou d’imagerie en direct.Ensuite, traitez les intestins avec des milieux préparés avec les inhibiteurs pharmacologiques des voies de signalisation cellulaire ou du lieu. L’aro accélère imbibé de protéines recombinantes pour modifier la signalisation cellulaire au-dessus des intestins. La dernière étape consiste à imager les intestins cultivés, soit en coupes épaisses, soit en montant de trou.En fin de compte, l’imagerie confocale suivie d’une reconstruction tridimensionnelle est utilisée pour visualiser comment la modulation des voies de signalisation cellulaire a affecté le développement des couches tissulaires lors de la formation des villosités. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car le tissu embryonnaire est très délicat et nécessite une grande prudence l

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Souris foetal entier Intestin Système de culture pour Ex Vivo Manipulation des voies de signalisation et d'imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités

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