Souris foetal entier Intestin Système de culture pour Ex Vivo Manipulation des voies de signalisation et d'imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités

La technologie d’imagerie améliorée permet l’imagerie tridimensionnelle des organes au cours du développement. Nous décrivons ici un système complet de culture d’organes qui permet l’imagerie en direct des villosités en développement dans l’intestin fœtal de la souris.

L’objectif global de cette procédure est de cultiver des cultures d’organes entiers d’intestins embryonnaires de souris, ex vivo, permettant ainsi la modulation des voies de signalisation cellulaire. Ceci est accompli en prélevant d’abord des intestins de souris sur des fœtus entre le 12,5e et le 18e jour embryonnaire. La deuxième étape consiste à placer les intestins dans une plaque de culture transwell ou d’imagerie en direct.

Ensuite, traitez les intestins avec des milieux préparés avec les inhibiteurs pharmacologiques des voies de signalisation cellulaire ou du lieu. L’aro accélère imbibé de protéines recombinantes pour modifier la signalisation cellulaire au-dessus des intestins. La dernière étape consiste à imager les intestins cultivés, soit en coupes épaisses, soit en montant de trou.

En fin de compte, l’imagerie confocale suivie d’une reconstruction tridimensionnelle est utilisée pour visualiser comment la modulation des voies de signalisation cellulaire a affecté le développement des couches tissulaires lors de la formation des villosités. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car le tissu embryonnaire est très délicat et nécessite une grande prudence lors de la dissection et de la manipulation. Pour préparer la dissection, trempez les outils de dissection dans de l’éthanol à 70 %.

Placez la plaque de culture à six puits et les boîtes de Pétri de 10 centimètres avec le milieu BGJB sur de la glace. Retirez ensuite les intestins des fœtus euthanasiés. Disséquez-les un par un dans un X-D-P-B-S.

Retirez délicatement la rate de l’estomac, puis le pancréas de l’estomac et le duodénum supérieur. Après cela, séparez doucement l’épiploon, en le laissant attaché autant que possible et en séparant les connexions juste assez pour permettre à l’intestin d’être redressé. Placez ensuite les échantillons dans une plaque de Petri de 10 centimètres avec un milieu BGJB fonctionnel.

Ensuite, à l’aide d’une pipette buccale, transférez les morceaux intestinaux sur les puits de la plaque de culture. Retirez le support sous le puits de transbordement. Ajoutez ensuite 700 microlitres de milieu de traitement sous le trans.

Eh bien, par la suite, ajoutez 300 microlitres de produit de traitement goutte à goutte sur les intestins et laissez-le pénétrer à travers le transwell. Changez le milieu de traitement au moins une fois par jour ou plus souvent en fonction de la demi-vie du réactif de traitement. Vous pouvez également placer délicatement les billes agricoles sur les intestins à l’aide d’une pipette buccale avec une aiguille capillaire tirée.

Placez les perles avec une extrême prudence car une manipulation brutale endommagera l’intestin et empêchera le développement de villosités dans la zone blessée. Dans cette procédure, incorporez les intestins dans 7 % d’aros dans de petits moules en plastique et laissez les blocs d’aros refroidir et se solidifier. Ensuite, retirez les blocs aros des moules en plastique.

Collez les blocs aros à l’étape de collecte Vibram avec de la colle instantanée. Ensuite, remplissez l’étape de collecte avec un X-D-P-B-S glacé. Coupez les sections à une épaisseur de 100 à 150 micromètres.

Transférez ensuite les sections de l’étape de collecte dans un puits de la plaque à six puits pour le stockage à quatre degrés Celsius. Pour préparer les diapositives au montage, placez du ruban adhésif double face le long de la longue diapositive de chaque diapositive. Placez une goutte d’un XPBS dessus.

Ensuite, placez soigneusement cinq à 10 sections sur la diapositive. Dépliez toutes les sections et étalez-les sur une seule couche. De l’autre côté du toboggan.

Retirez tout excès d’aros ou de morceaux inégaux qui empêcheraient le glissement de recouvrement de reposer à plat. Utilisez soigneusement un mouchoir de laboratoire pour absorber l’excès d’un XPBS autour des sections. Ensuite, à une goutte de milieu de montage aqueux sur le dessus des sections.

Placez ensuite le couvercle dessus et scellez-le sur la lame avec du vaporisateur fondu. Ensuite, imagez les coupes viome sur un microscope confocal droit ou inversé. Utilisez maintenant de la colle instantanée pour coller une membrane de polycarbonate individuelle sur un écran à mailles fines.

Placez le tamis à mailles au centre du puits d’une plaque de culture. Placez ensuite l’intestin disséqué sur la membrane en polycarbonate et ajoutez une goutte de colle instantanée à chacune des extrémités. Ensuite, ajoutez un milieu de culture exempt de rouge de phénol sous la membrane de polycarbonate au centre du puits de la plaque de culture.

Ajoutez de l’eau sur le bord extérieur de la plaque de culture pour fournir de l’humidité. Étant donné que l’intestin fœtal subit des vagues péristaltiques de contraction en culture, ajoutez 100 microlitres de solution de xylazine à trois millilitres de milieu dans le puits central de la plaque pour contrôler le mouvement de l’intestin pendant l’imagerie. Effectuez l’imagerie en direct à l’aide d’un microscope à fluorescence confocal à deux photons sur un support vertical.

On voit ici les coupes efficaces de tissus duodénaux E 14, E 15 et E 16 fraîchement récoltés, colorés à l’ecat et au dpi. Ce segment intestinal a été récolté à E 14 et mis en culture pendant deux jours. À E 14, l’épithélium non modélisé était encore pseudo stratifié.

Après deux jours en culture, les VII sont visibles, bien qu’ils soient légèrement retardés par rapport au vii. À E 16, voici la reconstruction tridimensionnelle des coupes optiques du système vasculaire coloré au pcam dans le duodénum E 14, et cette figure montre les reconstructions tridimensionnelles des images confocales d’intestins sectionnés au viome E 15.5 qui étaient colorés par immunofluorescence d’anticorps. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer le tissu embryonnaire, de préparer les intestins pour la culture d’organes entiers et de préparer le tissu pour une imagerie tridimensionnelle de haute qualité.