Multimodales méthodes optiques Microscopie Reveal Polyp tissus Morphologie et structure dans Caribbean Reef construction Coraux

L’objectif global de l’expérience suivante est d’imager en 3D des polypes coralliens d’un à deux millimètres d’épaisseur pour comprendre la structure fine ainsi que les pigments coralliens et leur localisation. Pour ce faire, l’échantillon est d’abord incorporé dans de la cire, puis il est coupé en sections d’un micron à l’aide d’un microtome. Ensuite, une technique de bloc de bloc personnalisée est utilisée pour imager les polypes coralliens et reconstruire l’image 3D.

À l’aide de plusieurs images 2D, on obtient des résultats qui montrent la capacité de la technique à résoudre les détails structurels fins du tissu corallien sans compromettre son intégrité structurelle. Démonstration de la procédure. Aujourd’hui, ce sera le Dr Maunde Siva guru, un collaborateur de mon groupe de recherche.

Pour préparer la cire de préfiltration, faites fondre 3,6 grammes de bœuf en flocons dans un bécher en verre sur une plaque chauffante. Ensuite, ajoutez 400 milligrammes de Soudan. Quatrièmement, pour minimiser la fluorescence du fond de cire, mélangez bien et attendez qu’une solution rouge translucide soit obtenue.

Ajoutez ensuite 81 grammes de paraffine et mélangez bien. Ensuite, ajoutez 15 grammes de barre VI granulaire blanche et faites fondre complètement dans le même bécher. Une fois fondu, mélangez-le à nouveau pour obtenir une solution de cire complètement mélangée.

Ajoutez maintenant le mélange dans une bouteille en verre et fermez sans serrer avec un couvercle. Placez la bouteille en verre dans un four à convection à 60 degrés Celsius pour maintenir les ingrédients à l’état liquide et pour que toutes les infiltrations aient lieu. Cette solution peut être faite à 200 millilitres et divisée en deux bouteilles de 100 millilitres.

Un pour l’infiltration et un pour l’encastrement final Des échantillons de coraux de construction de récifs des Caraïbes ont été collectés en UA et fixés dans du para formaldéhyde sur le terrain. Pour intégrer les tissus coralliens pour SBFI, il faut d’abord laver les polypes coralliens collectés sur le terrain et les stocker à quatre degrés Celsius dans du para formaldéhyde. Ensuite, lavez-les en PB S3 fois pendant cinq minutes à chaque fois lorsqu’ils sont prêts à être imagés.

Détartrez les polypes dans la solution ex Cal two pendant 24 heures ou jusqu’à ce que les polypes soient totalement dépourvus de carbonate de calcium. Incuber plusieurs polypes coralliens décalcifiés en un seul bloc dans une série à 25, 50, 75 et 100 % d’éthanol, suivi d’un x xylène. Remplacez les échantillons pendant 30 minutes à chaque séance pour les déshydrater.

Placez ensuite les polypes traités dans 100 % de xylène. Remplacer dans un four à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, remplacez par une solution fraîche et incubez pendant encore 30 minutes.

Orientez les polypes avec le sommet vers le bas et la surface aussi plate que possible. Faites des solutions de deux à un, un à un et un à deux. Substitut de xylène et cire de préfiltration.

Dans des tubes Falcon de 50 millilitres, incubez les polypes coralliens avec ces trois concentrations croissantes de cire de préfiltration, suivies de trois incubations dans de la cire de préfiltration à 100 % pendant 30 minutes à une heure à chaque fois. Transférez maintenant l’échantillon dans la cire d’enrobage. Retirez la cire d’enrobage après 30 minutes, puis remplacez-la par de la cire d’enrobage fraîche et poursuivez l’incubation pendant au moins quatre heures à 65 degrés Celsius.

Ensuite, photographiez le bloc. Ceci est nécessaire car une fois incrusté dans la cire, l’emplacement de l’échantillon deviendra invisible car la cire rouge d’enrobage est opaque. Ensuite, placez de petites gouttes de cire à point de fusion élevé autour du nouveau moule d’enrobage en acier inoxydable préchauffé et laissez-le refroidir.

Versez un petit volume de cire fraîchement fondue et de cire de litière de la deuxième aliquote et placez rapidement le polype de corail vers le bas sur le point de cire blanche. Placez ensuite un porte-échantillon en plastique sur le plateau en acier inoxydable et versez plus de cire d’enrobage afin que la cire remonte à la surface du moule en plastique. Sortez maintenant toute l’installation du four à 65 degrés Celsius et laissez-la refroidir sur un banc ou une surface fraîche jusqu’à ce que la cire durcisse complètement.

Après cela, placez le bloc desséché dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière pour un stockage à long terme afin de sectionner le bloc. Tout d’abord, coupez-le et coupez des sections d’un micron. À l’aide d’un microtome, capturez l’image de la face lisse du bloc, qui contient l’échantillon.

toujours. Lorsqu’une section est retirée, l’échantillon apparaît lorsque la cire blanche commence à disparaître. Ensuite, capturez les images avec une caméra monochrome à l’aide d’un filtre fluorescent ajusté pour capter l’autofluorescence des chromatophores ou l’image du polype corallien, trois à quatre carottes décalcifiées de chaque échantillon.

Pour effectuer une imagerie par fluorescence à deux photons, placez les noyaux de polypes de corail lavés dans du paraformaldéhyde à 4 % à l’envers dans une parabole à fond de verre couverte à l’aide d’un laser à deux photons à 780 nanomètres d’excitation et imagez trois à quatre polypes à deux grossissements différents à l’aide d’un objectif 10 x. Ensuite, utilisez le mode de balayage de tuiles pour collecter environ 25 à 100 images par plan focal en XY à des intervalles de 10 ou 20 microns. Collectez ensuite 50 à 100 images à travers l’axe Z à des intervalles de 10 ou 20 microns, ce qui représentera environ 5 000 à 10 000 images au total par polype corallien.

Après cette image, trois à quatre zones de polypes représentent un noyau et une espèce de corail. Stockez ensuite toutes les images au format de données brutes sur le disque dur du système. Dans cette procédure, recadrez les données 2D pour réduire la taille du fichier en vous concentrant sur un seul polype à l’aide de l’outil de recadrage carré et compilez-le en un seul fichier TIF.

Dans le logiciel d’acquisition. Ouvrez les fichiers assemblés des données SBFI ou les multiples piles Z en mosaïque de deux sections optiques de photons dans le module de programme de surpasse EMERIS sous le projet d’algorithme de volume, les données SBFI rendues en 3D. À l’aide d’une projection d’ombre, créez un mode ISOSURFACE où les voxels sont seuils pour créer un motif de surface solide.

Visualisez les projections 3D à l’aide d’un algorithme d’écrêtage simple aux modes orthogonaux XY, xz et YZ pour révéler la structure et la forme 3D des coraux. Animez ensuite les projections à l’aide d’un module d’animation d’images clés. Dans le même programme erris, générez des fichiers vidéo à 5 % de compression et générez des clips vidéo au format VI en utilisant des modalités de volume 3D et d’isosurface.

Voici les deux images 3D de polypes coralliens en fluorescence photonique de M Anis et M fa Lata. Ces deux images ont été capturées sans séparation spectrale des composants en utilisant une excitation de 780 nanomètres du laser à deux photons avec le signal optique collecté de 450 à 700 nanomètres, et ces deux images ont été collectées avec la même excitation, mais deux détecteurs à tube photomultiplicateur ont été utilisés simultanément pour collecter les données de deux composants, l’un de 500 à 550 nanomètres et l’autre de 650 à 720 nanomètres. Il s’agit d’images recouvertes d’un revêtement en profondeur.

Le rouge est le moins profond et le bleu sont les composants les plus profonds en 2D. oui. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de préparer correctement l’échantillon incrusté de cire rouge. La combinaison de l’imagerie en série du visage et de la microscopie à deux pieds sur fluorescence permet d’analyser la pigmentation des coraux et la structure cellulaire sur une variété d’échelles de lentilles.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de manipuler et d’imager les coraux constructeurs de récifs et leurs propriétés spectrales en trois dimensions.