Name: Analyse métabolomique de cerveau de rat par la Résolution nucléaire Haute spectroscopie par résonance magnétique dextraits de tissus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Découvrez l'analyse métabolomique du cerveau de rat par spectroscopie RMN haute résolution. Cette méthode permet d'obtenir des profils métaboliques détaillés pour étudier les changements neurochimiques liés aux maladies neurologiques.

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Soutien du Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 et 7339) est vivement remercié.

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<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLutz%2C+NW+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+biochemical+pathways+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+adjuvant+arthritis+a+comparative+metabolomic+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study.</a> PLoS ONE. 8, e56101(2013).</li>
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<li>Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+AN+%22Biophysical+tools+for+biologists%22">Biophysical tools for biologists</a>. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).</li>
<li>Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+study+of+regional+metabolism+after+forebrain+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats.</a> Stroke. 20, 633-640 (1989).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La spectroscopie de RMN est une méthode efficace pour mesurer les concentrations des composés chimiques en solution d&#39;une manière très reproductible et précise. Cependant, pour obtenir des données de haute qualité, il est nécessaire de respecter certaines règles concernant la préparation et l&#39;analyse des échantillons. Dans la détermination de concentrations de métabolites par spectroscopie RMN, ni la production ni la réception du signal de RMN domine l&#39;erreur de quantification, à moins que l&#39;intensité d&...

Les modèles murins ont été utilisés largement dans la recherche du cerveau 1. Corrélation génotype-phénotype ont été étudiés dans le cerveau de souris et de rats par l&#39;étude de l&#39;expression des gènes à l&#39;ARN et / ou les taux de protéine, d&#39;une part, et les phénotypes morphologiques, fonctionnelles, électrophysiologiques et / ou du comportement de l&#39;autre 6.2. Toutefois, pour bien comprendre les mécanismes liant phénotype génotype, il est impératif d&#39;enquêter sur les événements moléculaires en aval de l&#39;expression des protéines, c&#39;est à dire. le métabolisme des substrats biochimiques des enzymes qui agissent sur ​​7. Cette exigence a conduit, au cours des 10 à 15 dernières années, à une renaissance de la recherche métabolique dans de nombreuses branches de la biologie 8,9. Alors que les études métaboliques classiques ont souvent été axées sur les détails de voies spécifiques, la nouvelle approche métabolomique est orientée vers une enquête englobe tout du profil métabolique global du tissu à l&#39;étude.Une conséquence de ce concept est une nécessité évidente pour les outils d&#39;analyse qui minimisent biais en faveur des voies et / ou classes de composés métaboliques spécifiques. Cependant, un dosage biochimique classique est basé sur une réaction chimique particulière d&#39;un analyte spécifique qui doit être déterminée avant le dosage est effectué. En revanche, les techniques spectroscopiques telles que la résonance magnétique (RMN) nucléaire et la spectrométrie de masse (MS) (i) sont basés sur certaines moléculaires propriétés (physiques) des composés biochimiques, dont chacune donne lieu à une ou plusieurs signaux distincts dans un spectre détectées au cours d&#39;une expérience; et (ii) détecter un grand nombre de composés différents par expérimentation. Ainsi, chaque spectre contient les informations combinées de toute une série de métabolites. Pour cette raison, les méthodes spectroscopiques sont des outils appropriés pour la métabolomique, comme aucune sélection préalable doit être faite en ce qui concerne la nature de l&#39;analyte à mesurer huit </sup&gt;. En conséquence, ces techniques se prêtent naturellement à des études exploratoires car ils facilitent grandement la détection de changements métaboliques inattendues. Bien que la spectroscopie RMN et MS peuvent être utilisés indifféremment pour l&#39;analyse de nombreux métabolites, chaque méthode présente des avantages et des inconvénients qui ont été récemment examinés 10 spécifiques. En bref, la spectroscopie RMN peut généralement être effectuée à partir des extraits bruts et ne nécessite pas la séparation chromatographique de composés de l&#39;échantillon avant l&#39;analyse. En revanche, MS fonctionne avec du gaz ou la chromatographie liquide (GC ou LC) séparation, sauf pour certains développements récents tels que l&#39;imagerie par spectrométrie de masse. Dans quelques cas particuliers, tels que l&#39;analyse des sucres, la séparation des cristaux liquides peut devenir une nécessité pour la spectroscopie RMN et, car les lignes de résonance des différents sucres se chevauchent de manière significative au proton (1 H) Les spectres de RMN. Néanmoins, 1 H spectroscopie RMN sans chrséparation omatographic reste la méthode la plus populaire métabolomique, presque universellement appliquée RMN. En général, la préparation de l&#39;échantillon est plus longue et complexe pour MS que pour la spectroscopie RMN. Problèmes graves en raison des effets de matrice sont beaucoup moins fréquents en spectroscopie RMN que dans les États membres où elles peuvent conduire à des signaux considérablement atténués. Métabolite quantification peut être réalisée avec les deux méthodes. Cependant, plusieurs types de composés sont nécessaires pour la MS en raison de variations dans les effets de matrice et de l&#39;efficacité d&#39;ionisation entre les métabolites. En revanche, une seule norme par échantillon est nécessaire pour une analyse spectroscopique RMN car dans des conditions de mesure appropriés, la dernière méthode est intrinsèquement grâce quantitatives à la réponse RMN strictement linéaire par les noyaux observés. Un inconvénient majeur de RMN est sa sensibilité relativement faible. MS, en particulier LC-MS, est plus sensible que la RMN de plusieurs ordres de grandeur; pour cette raison, la SEP est préférable à la RMN pourl&#39;analyse des composés d&#39;origine à des concentrations très faibles. D&#39;autre part, la nature non destructive de l&#39;expérience de RMN est un net avantage sur MS; de cette façon, la RMN peut être effectuée plusieurs fois sur le même échantillon, par exemple, pour les différents noyaux de RMN-actifs tels que le 1 H, du phosphore 31 (31 P), le carbone 13 (13 C), du fluor 19 (19 F) etc., étant donné qu&#39;aucun produit est consommé par RMN, par opposition à des mesures de sclérose en plaques. Les deux RMN et MS peuvent être utilisés dans des modes différents, chacun d&#39;eux étant optimale pour la détection de composés possédant des caractéristiques chimiques. Par exemple, 31 P RMN est souvent mieux que 1 H RMN pour l&#39;analyse de composés phosphorylés modérément concentrée, bien que presque tous les métabolites phosphorylés contiennent également des protons. Cependant, leurs signaux RMN 1 H peuvent être masquées par une signaux H RMN d&#39;autres composés, non phosphorylés, tandis que le secondévidemment pas provoquer un bruit de fond dans 31 spectres RMN P. Dans une situation analogue, 19 F analyse RMN est préférable pour les composés fluorés, par exemple, les médicaments fluorés (pas de signaux de fond de métabolites endogènes), tandis que le cas particulier de RMN 13 C est d&#39;un intérêt presque exclusivement si le sort de 13 C précurseurs métaboliques marqués exogènes doivent être suivis, en raison de la très faible abondance naturelle de l&#39;isotope 13 C (environ 1%). Beaucoup de spectromètres de masse travaille en mode ion négatif ou en mode d&#39;ions positifs. Par conséquent, il est important de savoir à l&#39;avance si l&#39;analyse des ions à observer sont chargés positivement ou négativement. Nous nous concentrons ici sur un protocole pour l&#39;analyse du métabolome de tissu cérébral par 1 H et 31 spectroscopie RMN P parce que cette méthode donne un grand nombre de concentrations de métabolites importants à faible coût en termes de (i) le temps nécessaire pour la préparation des échantillons d&#39;une (ii) l&#39;effort nécessaire pour le métabolite quantification. Toutes les expériences peuvent être effectuées en utilisant l&#39;équipement d&#39;un laboratoire de chimie par voie humide classique et un centre de la spectroscopie RMN à haute résolution. D&#39;autres exigences sont décrites dans la section ci-dessous de protocole.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Virbac</td><td>Vetflurane</td><td>Anesthésique pour animaux</td></tr><tr><td>Vaporisateur Isoflurane</td><td>Ohmeda</td><td>Isotec 3</td><td>Nouveau modèle disponible : Isotec 4</td></tr><tr><td>Scalpel, ciseaux, pinces, pinces</td><td>Harvard Apparatus Fisher Scientific</td><td>divers divers</td><td>Matériel chirurgical pour animaux</td></tr><tr><td>Outil de congélation</td><td>homebuilt</td><td>n/a</td><td>Pince avec plaques en aluminium, à insérer dans l’azote liquide pour le refroidissement</td></tr><tr><td>Dewar</td><td>Nalgene</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>Azote liquide</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Azote gazeux</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Évaporateur d’azote</td><td>Organomation Associates</td><td>N-EVAP 111</td><td>Peut être remplacé par un appareil de construction artisanale</td></tr><tr><td></td><td>Mortier Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>Z247472</tr><tr><td>Pilon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247510</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur</td><td>de tissus Kinematica</td><td>Polytron</td><td>Avec tubes à essai adaptant l’arbre de l’homogénéisateur</td></tr><tr><td>Balance électronique</td><td>Sartorius</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3641</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366910</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger en verre</td><td>Kimble</td><td>45500-15, 45500-30</td><td>Kimax 15 ml, tube de 30 ml</td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger</td><td>Kimble</td><td>45150-2</td><td>Kimax tube de 2 ml ; doit remplacer le tube « Eppendorf » s’il est compatible avec le rotor de la centrifugeuse</td></tr><tr><td>Pipettes en polystyrène</td><td>Costar Corning</td><td></td><td>Stripettes Volumes de 5 et 10 ml</td></tr><tr><td>Deutérochloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431915</td><td>99,96 % deutéré</td></tr><tr><td>Oxyde de deutérium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>423459</td><td>99,96 % deutéré</td></tr><tr><td>Chlorure de deutérium</td><td>Alpha Aesar</td><td>42406</td><td>20 % dans l’oxyde de deutérium Deutéroxyde</td></tr> de <tr><td>sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164488</td><td>30 % dans l’oxyde de deutérium</td></tr><tr><td>Lyophiliseur</td><td>Christ</td><td>Alpha 1-2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse à froid</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre</td><td>Eutech Cybernetics</td><td>Cyberscan</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0922</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de césium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516988</td><td></td></tr><tr><td>tubes RMN</td><td>Wilmad</td><td>528-PP</td><td></td></tr><tr><td>Insert coaxial de tige RMN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278513</td><td>By Wilmad</td></tr><tr><td>Pipettes RMN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z255688</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>Research</td><td>Avec pointes pour des volumes de 0,5 à 1 000 &mu ; l</td></tr><tr><td>Spectromètre RMN Pipet-Aid</td><td>Drummond</td><td>XP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bruker</td><td>AVANCE 400</td><td>avec sonde et autres accessoires</td></tr><tr><td>Logiciel RMN</td><td>Bruker</td><td>TopSpin 1.3</td><td>version plus récente disponible : Topspin 3.2</td></tr><tr><td>Composés étalons solubles dans l’eau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>composés</td> <td>étalons phospholipidiquesAvanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich</td><td>divers divers diverses</td><td>Source de plasmalogènes, mais peut être < Pureté de 70 à 80 %</td></tr><tr><td>Méthylènediphosphonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9508</td><td></td></tr><tr><td>TSP-d4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse métabolomique de cerveau de rat par la résolution nucléaire haute spectroscopie par résonance magnétique d&#39;extraits de tissus

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

Les études de l’expression génique au niveau de l’ARN et des protéines sont utilisées depuis longtemps pour explorer les processus biologiques sous-jacents à la maladie. Plus récemment, la génomique et la protéomique ont été complétées par une analyse quantitative complète du pool de métabolites présents dans les systèmes biologiques. Cette stratégie, appelée métabolomique, vise à fournir une caractérisation globale du complément de petites molécules impliquées dans le métabolisme. Alors que le génome et le protéome définissent les tâches que les cellules peuvent accomplir, le métabolome fait partie du phénotype proprement dit. Parmi les méthodes actuellement utilisées en métabolomique, les techniques spectroscopiques présentent un intérêt particulier car elles permettent d’analyser simultanément un grand nombre de métabolites sans sélection préalable pour des voies biochimiques spécifiques, permettant ainsi une approche large et impartiale. Ici, un protocole expérimental optimisé pour l’analyse métabolomique par spectroscopie RMN à haute résolution est présenté, qui est la méthode de choix pour une quantification efficace des métabolites tissulaires. Les points forts importants de cette méthode sont (i) l’utilisation d’extraits bruts, sans qu’il soit nécessaire de purifier l’échantillon et/ou de séparer les métabolites ; (ii) la nature intrinsèquement quantitative de la RMN, qui permet de quantifier tous les métabolites représentés par un spectre RMN avec un seul composé de référence ; et (iii) la nature non destructive de la RMN permettant l’utilisation répétée du même échantillon pour plusieurs mesures. La gamme dynamique des concentrations de métabolites pouvant être couvertes est considérable en raison de la réponse linéaire des signaux RMN, bien que les métabolites présents à des concentrations extrêmement faibles puissent être difficiles à détecter. Pour les composés les moins abondants, la méthode de spectrométrie de masse très sensible peut être avantageuse, bien que cette technique nécessite des procédures de préparation et de quantification d’échantillons plus complexes que la spectroscopie RMN. Nous présentons ici un protocole RMN adapté à l’analyse du cerveau du rat ; Cependant, le même protocole peut être appliqué à d’autres tissus avec des modifications mineures.

Pour obtenir une meilleure résolution dans les spectres RMN métabolique de cerveau et d'autres extraits de tissus, il a longtemps été une pratique courante pour enlever ou ions masque de métal (le plus important: les ions paramagnétiques) présents dans des solutions d'extraction. Ceci a été réalisé soit en ajoutant un agent chélateur tel que l'EDTA ou le CDTA à l'extrait 19, ou par passage de l'extrait à travers une résine échangeuse d'ions telle que Chelex-100 20. Les résultats présentés dans <str...

La neurochimie du cerveau des mammifères est modifiée dans de nombreuses maladies neurologiques et systémiques. Des profils caractéristiques des métabolites cérébraux peuvent être obtenus efficacement à partir d’extraits bruts de tissu cérébral. À cette fin, la spectroscopie RMN à haute résolution est utilisée, permettant une analyse quantitative détaillée des concentrations de métabolites (métabolomique).

Analyse métabolomique de cerveau de rat par la Résolution nucléaire Haute spectroscopie par résonance magnétique d&#39;extraits de tissus

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des profils de métabolites à haute résolution à partir d’extraits de cerveau de rat. Ceci est accompli en récoltant d’abord des cerveaux de rats et en les congelant instantanément dans de l’azote liquide. La deuxième étape consiste à extraire les métabolites cérébraux en homogénéisant les tissus dans de l’eau de méthanol et de chloroforme, puis en éliminant les protéines dénaturées et les solvants organiques.Ensuite, les échantillons aqueux sont lyophilisés et tous les échantillons sont résolés dans des solvants bien définis. Pour une analyse spectroscopique RMN optimale, l’étape finale consiste à mettre en place et à optimiser soigneusement des expériences de RMN métabolomiques. En fin de compte, les spectres RMN sont nécessaires dans des conditions expérimentales bien définies et évalués à l’aide de protocoles de traitement de données optimisés.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du métabolisme cérébral, elle peut également être appliquée à d’autres tissus mous tels que les tumeurs, le foie, les reins et d’autres organes. Tout d’abord, retirez un échantillon de tissu cérébral congelé préalablement préparé du congélateur à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, transférez immédiatement l’échantillon de tissu dans un mortier partiellement rempli d’azote liquide.Utilisez un pilon froid à l’azote liquide pour briser le tissu cérébral congelé en petits morceaux qui s’insèrent facilement dans les tubes à essai utilisés pour l’homogénéisation des tissus. Après ce mélange, les petits morceaux de tissu cérébral congelé pèsent soigneusement 250 à 350 milligrammes de tissu et les transfèrent dans un tube à essai rempli d’un total de quatre millilitres de méthanol glacé. Chaque fois que des morceaux de tissu congelé sont ajoutés dans le tube à essai, homogénéisez-les immédiatement avec l’homogénéisateur de tissus.Une fois que le dernier morceau d’échantillon de cerveau de rat congelé a été ajouté dans le tube à essai et homogénéisé, transférez l’homogénat dans un flacon en verre supérieur ou égal à 20 millilitres. Fermez le bouchon à vis et placez l’homogénat sur de la glace pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez quatre millilitres de chloroforme glacé à l’homogénat et tourbillonnez complètement.Une fois terminé, placez l’homogénat sur de la glace pendant 15 minutes. Ajoutez quatre millilitres d’eau à l’homogénat après avoir bien tourbillonné, laissez l’homogénat se maintenir à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Pour une séparation de phase complète, transférez la solution d’homogénat de tissu cérébral dans un tube de 20 millilitres résistant au chloroforme et centrifugez l’échantillon à 13 000 G et quatre degrés Celsius pendant 40 minutes.Après la centrifugation, à l’aide d’une pipette à pâter, transférer la phase supérieure dans un tube approprié résistant au méthanol de 15 millilitres. Ensuite, utilisez une pipette à pâte fraîche pour transférer la phase inférieure dans un tube approprié, supérieur ou égal à un tube résistant au chloroforme de 15 millilitres, et placez-le sur de la glace tout en maintenant le tube avec la phase méthanol d’eau sur de la glace. Évaporez le méthanol en dirigeant un flux d’azote sec dans la solution d’extraction.Terminez le processus d’évaporation lorsque l’azote bouillonne. N’entraîne plus de réduction du volume dans la solution d’extrait. Après avoir placé le tube avec la phase chloroforme de méthanol sur de la glace, évaporez le méthanol en dirigeant un flux d’azote sec à la surface de la solution d’extraction.Lorsque tout le solvant s’est évaporé, fermez le tube et maintenez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’analyse RMN. Pour préparer la phase aqueuse à la lyophilisation, transférez l’échantillon aqueux dans un tube à centrifuger de 50 millilitres soigneusement rincé. Ensuite, congelez la solution d’extraction en faisant pivoter le tube de centrifugation dans de l’azote liquide de sorte que la surface interne du tube soit progressivement recouverte par le liquide congelé.Lorsque tout le liquide est gelé, couvrez le tube avec un bouchon à vis perforé pour permettre à la vapeur de s’échapper et placez le tube dans une bouteille de filtre à vide à col large. Après avoir fixé la bouteille au lyophilisateur, démarrez la lyophilisation, terminez le processus de lyophilisation. Lorsque l’échantillon est entièrement sec, conservez-le à moins 80 degrés Celsius dans un tube fermé jusqu’à ce qu’il soit utilisé pour l’analyse RMN.Pour l’analyse RMN du phosphore des phospholipides, dissoudre les lipides séchés dans 700 microlitres d’un mélange de cinq à quatre pour un de méthanol chloroforme deutéré et d’une solution aqueuse de CDTA de 200 millimolaires. Transférez l’échantillon dans un microtube à centrifuger à l’aide d’une micropipette à déplacement direct avec une pointe résistante au chloroforme. À ce stade, réglez la régulation de la température de la sonde RMN sur la valeur cible souhaitée, qui est généralement de 25 degrés Celsius pour centrifugeuse.La solution d’extrait de phospholipides à quatre degrés Celsius et 11 000 G pendant 30 minutes pour faire tourner les résidus solides dans l’échantillon. Une fois terminé, transférez 600 microlitres de super natin dans un tube RMN de haute qualité avec un diamètre extérieur de cinq millimètres. Préparez la tige coaxiale appropriée remplie d’une solution aqueuse de diphosphate de méthylène de 20 millimolaires à pH 7,0 pour le référencement et la quantification par décalage chimique.Placez cet insert dans le tube RMN rempli de la solution d’extrait de phospholipides. Ensuite, montez le tube RMN avec le cône approprié et transférez-le sur l’aimant RMN. Faites tourner l’échantillon à 15 à 20 hertz après avoir attendu que l’échantillon soit ajusté à la température définie.Minimisez soigneusement l’homogénéité du champ magnétique sur l’échantillon en ajustant les courants de bobine de cale dans l’axe et hors axe, réglez les paramètres d’acquisition du spectre RMN sur les valeurs optimales, qui peuvent varier en fonction de l’intensité du champ magnétique. Une fois l’acquisition du spectre terminée, traitez la décroissance par induction libre à l’aide de paramètres optimisés afin d’obtenir les meilleurs résultats pour toute la gamme des résonances phospholipidiques. Répétez le traitement en utilisant au moins deux procédures de filtrage différentes.Enfin, filtrer les signaux très faibles et larges sans chevauchement significatif par l’isation pour augmenter le rapport signal sur bruit. Dans cette expérience, des raies spectrales extrêmement étroites ont été obtenues pour toutes les régions spectrales analysées, même dans les régions très encombrées. Les pics à une distance inférieure à 0,01 P PP M sont presque complètement séparables à 400 mégahertz.En conséquence, l’analyse qualitative et quantitative des nombreux pics petits, mais actuellement non attribués, peut être envisagée dans le rétrécissement futur de la ligne en choisissant 1000 millimolaires au lieu de 200. L’ACD était souhaité, mais il a entraîné une superposition des signaux phospholipidiques et un rétrécissement de la ligne en choisissant 277 Kelvin au lieu de 297. Kelvin était souhaité, mais entraînait également une superposition de signaux phospholipidiques.Une diminution de la concentration de CDTA de 200 millimolaires à 50 millimolaires n’entraîne qu’une augmentation modeste de la largeur des lignes et un changement presque nul dans les changements chimiques. Cependant, notez que la concentration tissulaire dans l’extrait CDTA de 50 millimolaires est deux fois moins élevée que dans l’extrait CDTA de 200 millimolaires. Expliquant les lignes relativement étroites, un grand nombre de phospholipides quantifiables ont été détectés couvrant une gamme de concentration considérable.La résolution spectrale est même suffisante pour détecter régulièrement le fractionnement partiel de certains pics. En conséquence, une analyse qualitative et quantitative d’autres sous-groupes de phospholipides peut être envisagée à l’avenir. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer chaque étape avec un soin extrême pour garantir une analyse optimale des métabolites.

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