Imagerie in vivo de Dauer spécifique neuronale Rénovation en C. elegans

L’objectif global de cette procédure est d’imager le remodelage spécifique du douaire des neurones sensoriels dans l’élégance de la mer. Ceci est accompli en extrayant d’abord la phéromone brute dour de la culture liquide. La deuxième étape consiste à mesurer la puissance de la phéromone brute.

Ensuite, la phéromone est utilisée pour induire la formation de durs chez l’animal exprimant la GFP dans les deux neurones IL. La dernière étape consiste à monter l’animal sur la lame du microscope pendant l’étape DMT et à effectuer une imagerie en direct pour montrer l’arborisation des dendrites. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuroplasticité, telles que la façon dont les neurones se remodèlent en réponse aux conditions environnementales.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du remodelage de l’IL deux, elle peut également être appliquée à d’autres événements spécifiques tels que le remodelage du pharynx. Pour commencer cette procédure, cultivez l’OP 50 e coli d’une seule colonie pendant la nuit à 37 degrés Celsius tout en secouant 100 millilitres de bouillon à 200 tr/min. Ensuite, cultivez l’élégance N deux C sur des boîtes de Pétri de 15 à 26 centimètres avec de la gélose NGM assise avec 50 microlitres d’e coli jusqu’à ce que les bactéries soient presque épuisées.

Ensuite, cultivez une culture d’e coli dans quatre litres de bouillon LB en inoculant un millilitre de Coli et en secouant à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Après cela, lavez les nématodes des plaques avec un millilitre de solution de basilic S. Transférez quatre à cinq plaques de nématodes dans un erlenmeyer d’un litre de milieu S, centrifugez l’e coli à 650 g pendant 10 minutes, puis retirez le surnageant, suspendez chaque pastille bactérienne dans 10 millilitres de solution de basilic S.

Après cela, transférez des quantités égales de bactéries remises en suspension dans chaque flacon de nématodes. Placez le ballon sur un agitateur orbital à température ambiante entre 100 et 150 tr/min pendant quatre jours jusqu’à ce que la solution commence à s’éclaircir, ce qui indique un épuisement des aliments. Une fois que la nourriture est épuisée, cultivez l’e coli dans quatre cultures d’un litre de bouillon pendant la nuit.

Ensuite, centrifugez les bactéries à 650 G pendant 10 minutes. Ajoutez les pastilles bactériennes dans les fioles du milieu S avec les nématodes, et retournez tous les fioles du milieu S dans la chambre orbitale pendant trois à quatre jours supplémentaires jusqu’à ce que la nourriture soit à nouveau épuisée. Ensuite, transférez une aliquote d’un millilitre de solution dans une boîte de Pétri et comptez le nombre de nématodes au microscope à dissection.

Ensuite, centrifugez les nématodes à 4 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, jetez la pastille de nématode et conservez le surnageant. Filtrez ensuite le surnageant à travers le papier filtre watman numéro un. Filtrez davantage le surnageant à l’aide d’unités de filtration sous vide stériles de 45 micromètres.

Ensuite, ajoutez le filtrat dans un bécher de deux litres avec la barre d’agitation. Placez-le sur une plaque d’agitation chauffante dans une hotte, portez à ébullition en remuant et évaporez-le à environ 200 millilitres. Par la suite, transférez la solution dans un bécher de 500 millilitres et continuez à bouillir jusqu’à ce qu’il reste environ 50 millilitres.

Laisser refroidir et centrifuger pendant cinq minutes à 1000 G.Versez ensuite le snat dans un bécher de 100 millilitres et jetez la pastille. Ensuite, faites bouillir le snat en une croûte brune. Retirer du feu et briser la croûte avec la spatule Ensuite.

Ajoutez suffisamment d’éthanol à 200 degrés pour couvrir la croûte. Couvrez le bécher avec du paraform et laissez-le reposer toute la nuit à température ambiante. Versez ensuite l’éthanol dans un bécher propre et mettez-le de côté.

Ajoutez de l’éthanol frais pour couvrir la croûte et répétez trois fois les extractions pendant la nuit, puis regroupez les extraits. Après cela, utilisez une pompe à vide pour sécher les extraits d’éthanol. Si une pompe à vide n’est pas disponible, ajoutez l’extrait d’éthanol dans un bécher propre et réchauffez-le à 50 degrés Celsius tout en remuant dans une hotte.

Dissoudre ensuite le résidu dans 10 millilitres d’eau distillée stérile. Stérilisez cette solution à l’aide d’une seringue de 22 micromètres, filtrez et conservez-la à moins 20 degrés Celsius dans un millilitre. Un watts.

Dans cette procédure, pesez un micro tube à centrifuger. Ajoutez un millilitre de culture de nuit d’equali dans le tube et centrifugez à 17 000 G. Ensuite, retirez tout le nat. Pesez à nouveau le tube et déterminez le poids de la pastille bactérienne.

Ensuite, remettez le granulé en suspension avec un tampon M neuf pour une concentration finale de 4 % en poids par volume. Disposez 10 microlitres de suspension bactérienne au centre de chaque plaque de phéromones et conservez les plaques pendant la nuit. À température ambiante.

Transférez 10 à 15 gravitt dans des hermaphrodites de type sauvage sur les plaques de phéromones un jour après la mue à l’âge adulte. Conservez les assiettes à 25 degrés Celsius pendant trois à quatre heures. Ensuite, éliminez tous les hermaphrodites adultes.

Notez le nombre d’œufs pondus pour chaque assiette. Scellez les plaques avec du paraform et remettez-les à 25 degrés Celsius pendant trois jours avant de compter le pourcentage de faiseurs. Préparez maintenant les plaques de phéromones d’action en utilisant la valeur EC 90 et induisez les dépisseurs avec une souche porteuse d’un transgène rapporteur IL deux rapporteur intégré après la ponte des œufs.

Retirez les hermaphrodites adultes. Scellez les plaques avec du fil et incubez pendant 34 heures à 25 degrés Celsius la veille de l’imagerie. Faire une solution de 10 % en poids par volume d’agros dans un tampon M neuf avec de la phéromone de dosage à l’aliquote de concentration EC 90.

Environ 100 microlitres d’agros sur une lame de microscope, et placez rapidement mais doucement une autre lame sur le dessus pour créer une surface agricole plane Une fois que l’agros s’est solidifié, séparez les lames. Enveloppez-les dans du film alimentaire et conservez-les dans une chambre humide. Après la période d’incubation de 34 heures, examinez les plaques de phéromones à la recherche de nématodes qui ont cessé le pompage pharyngé.

Séparez les diapositives de sorte qu’une seule surface de la diapositive soit recouverte d’aros. Transférez un ou plusieurs nématodes sur un tampon 10 % agros avec un microlitre de billes de polystyrène de 0,1 micron, puis déterminez l’orientation du nématode. Capturez des images Zack d’une dendrite IL deux Q à un grossissement de 100 x avec l’intensité de fluorescence la plus faible possible toutes les 15 minutes ou au besoin pour l’expérience spécifique.

Cette figure montre les micrographies DIC à vue latérale droite de l’élégance C au cours des différentes étapes du moule austère. Il s’agit d’un animal L deux avec un bulbe pharyngé terminal arrondi typique. Environ trois heures après la mue en douaire, le bulbe terminal rétrécit et la cuticule L 2D commence à se détacher de la cuticule de douaire nouvellement formée.

Environ 10 heures après le début de la mue, l’animal a subi un rétrécissement radial important et un détachement de la cuticule L 2D. De temps en temps, le conduit excréteur tapissé de cuticules de l’étage L 2D peut encore être vu attaché au douaire en développement. On voit ici la micrographie épifluorescente en vue latérale d’un seul animal exprimant le rapporteur IL deux.

Ces médaillons montrent la dendrite IL deux Q à différents moments après le début de la mue du douaire. Un rapide des deux branches Q de l’IL se produit environ cinq heures après le début de la mue. Lorsque vous essayez de purifier la phéromone d’action, il est important de se rappeler d’utiliser une technique stérile pour éviter la contamination.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier et d’évaluer la puissance de la phéromone de douaire brute, ainsi que de l’utilisation de cette phéromone pour l’imagerie du remodelage spécifique de la dot in vivo.