Cultures organotypique de tranche d'étudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation

L’objectif général de cette procédure est d’étudier la prolifération et la différenciation des cellules de la lignée des oligodendrocytes dans un environnement qui ressemble beaucoup à ce que l’on trouve in vivo. Ceci est accompli en préparant d’abord des cultures de tranches de quatre cerveaux et cervelet de souris transgéniques postnatales précoces. Les cellules individuelles des coupes sont ensuite imagées sur des périodes allant de quelques heures à quelques jours pour visualiser la dynamique cellulaire de leur prolifération et de leur différenciation.

Après l’imagerie, l’immunohistochimie post-hoc des cellules est utilisée pour déterminer diverses caractéristiques cellulaires. En fin de compte, les résultats peuvent montrer la dynamique de la prolifération et de la différenciation cellulaires dans des conditions normales et après manipulation pharmacologique ou génétique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le charbon dissocié, les cultures de neurones et les cellules de la lignée liga incyte est que les cultures en tranches permettent de manipuler l’environnement acellulaire tout en conservant l’architecture cyto tissulaire.

Toutes les procédures sur les animaux suivent les directives et ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Connecticut au moins deux heures avant la dissection. Préparez des inserts de culture tissulaire dans des plaques à six puits pour chacun. Ajoutez bien un millilitre de milieu de culture en tranches, puis transférez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone au moins 15 minutes avant la dissection.

Mettez le tampon de dissection sur de la glace et commencez à le faire bouillonner avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Assurez-vous également que tous les outils et le hachoir à tissus sont stérilisés avec de l’éthanol à 70 %. Transférez le tissu dans une boîte stérile de 35 millimètres contenant un tampon de dissection oxygéné glacé.

Ensuite, à l’aide d’une lame de rasoir, sectionnez le cervelet et le cerveau antérieur, puis effectuez une coupe sagittale à travers le cerveau antérieur et le cervelet séparant les hémisphères. Maintenant, à l’aide du hachoir manuel, faites des coupes coronales et sagittales de 300 microns d’épaisseur des quatre cerveaux et du cervelet. Chaque animal produit généralement six tranches de quatre cerveaux et six tranches de cervelet.

Idéalement, il prélève des tranches couvrant le tiers antérieur du corps calleux afin d’étudier les régions de la matière grise et de la substance blanche dans la même tranche. Transférez les tranches séparées dans un tampon de dissection à froid fraîchement bullé sur de la glace dans le tampon, à l’aide d’une petite spatule de dissection ou de pesée. Séparez les sections individuelles et transférez-les dans des sections pré-incubées.

Six boîtes de puits contenant des inserts de culture. Deux à trois tranches peuvent être placées sur une culture. Insérez la pipette de tout tampon de dissection en excès à la surface de la culture.

Insérez et transférez les plaques dans l’incubateur jusqu’à ce qu’elles soient fixées. Le milieu de coupe doit être remplacé un jour après la préparation de la tranche, puis tous les deux jours jusqu’à la fixation de la tranche comme indiqué dans le protocole. Selon l’expérience, utilisez les tranches après cinq à sept jours.

Dans la culture. N’utilisez que les tranches qui deviennent transparentes après les premiers jours et jetez celles qui ont des régions opaques inégales visibles à l’œil nu. Sous le contraste facial, ces régions opaques apparaissent comme un amas de cellules sombres.

Si elle est effectuée correctement, les régions opaques mortes n’apparaissent pas dans plus d’une à 5 % des tranches. Pour effectuer une imagerie en accéléré de la prolifération et de la différenciation des cellules NG deux, utilisez des tranches âgées de trois à cinq jours de souris qui expriment EGFP dans les cellules NG deux. Ne laissez pas les diapositives descendre en dessous de 37 degrés Celsius pendant plus de 15 minutes.

Par séance d’imagerie, en gardant la plaque fermée, utilisez l’objectif 10 x d’un microscope à fluorescence inversée pour capturer des images dans un premier temps. Point de la culture. Imagez quatre à huit emplacements sur chaque tranche à partir des zones de matière grise et blanche de la tranche.

De plus, imagez des points de repère utiles tels que les bords des tranches, des cellules particulières ou l’orientation des faisceaux de substance blanche à des fins de relocalisation. L’image du point temporel précédent peut être utilisée comme image de référence lors de la relocalisation pour la division cellulaire NG deux et la différenciation des oligodendrocytes. Capturez des images toutes les quatre à six heures pendant idéalement cinq à sept jours.

Si le marqueur inductible NG two cre, ER YFP est utilisé, induire l’expression du rapporteur à l’aide d’un milieu de culture avec 100 nanomolaires. Quatre hydroxytamoxifènes dissous dans l’activité du rapporteur d’éthanol devraient apparaître dans un délai d’un à deux jours. Pour la fixation, ajoutez un millilitre de fixateur au fond de la culture.

Insérez et ajoutez un autre millilitre sur les tranches. Ne versez pas le fixateur directement sur les tranches, sinon elles pourraient se détacher. Fixez le mouchoir pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, puis à l’aide d’un scalpel.

Découpez les membranes avec les tranches attachées. À l’aide d’une pince à épiler, transférez soigneusement les tranches dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits chargée de PBS. Ensuite, transférez les tranches dans une deuxième plaque à 24 puits chargée d’une solution bloquante contenant 5 % de sérum de chèvre normal et 0,1 % de tritton X 100 dans du PBS.

Laissez-les incuber dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante. Une fois bloquées, déplacez les tranches vers une plaque chargée d’anticorps primaires dans du PBS avec 5 % NGS. Laissez-les incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain.

Lavez les tranches dans du PBS. Ensuite, incubez les tranches avec des anticorps secondaires dans du PBS avec 5 % NGS. Laissez l’incubation durer une heure à température ambiante.

Poursuivez avec trois autres lavages en PBS comme précédemment et montez les tranches avec la membrane face à la lame afin qu’elle ne se trouve pas entre l’objectif et le tissu. Pour analyser la dynamique temporelle de la différenciation des oligodendrocytes, des images de la division cellulaire de NG two ont été obtenues à partir de cultures de coupes du cerveau antérieur de souris transgéniques P huit NG two creeg sur plusieurs jours, des séquences en accéléré ont été prises sur 122 heures. Le phénotype des cellules divisées a été déterminé avec des anticorps NG 2 et CC un.

La prolifération cellulaire a également été évaluée à l’aide d’une coloration immunohistochimique pour le marqueur de prolifération cellulaire. La cartographie de l’appât KI 67 des cellules NG deux a été réalisée après induction de la recombinaison CRE dans des coupes de souris NG deux CRE YFP. Deux jours après l’ajout de quatre hydroxy tamoxifène.

Un rapporteur YFP exprimant des cellules NG deux positives a été trouvé dans les cultures. Quatre jours plus tard, une proportion de ces cellules s’est différenciée en CC un oligodendrocytes positifs cytes. Des oligodendrocytes matures ont été imagés dans des cultures de tranches de cervelet à partir de P-L-P-D-S.

Des neurones Perkin myélinisés de souris rouges étaient présents dans ces cultures. Des images répétées ont montré que l’ajout de DS rouge myélinisant exprimant la chimie immunohisto des oligodendrocytes dans ces coupes a montré une expression substantielle de la protéine basique de la myéline. Enfin, l’imagerie à plus haute résolution temporelle a révélé des corps cellulaires oligodendrocytaires stables avec quelques mouvements mineurs dans les processus distaux.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des cultures de tranches à partir des quatre cerveaux et du cervelet, d’imager à plusieurs reprises des cellules uniques pendant des jours ou des heures et d’analyser le destin des cellules d’image à l’aide de l’immunohistochimie post-ho. En plus de l’imagerie, ces coupes permettent également de manipuler l’environnement cellulaire tout en utilisant des techniques de cartographie du destin telles que la recombinaison de crème inductible dans une tranche préparée.