Name: Cultures organotypique de tranche détudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Découvrez la culture organotypique de tranches cérébrales pour étudier la dynamique des oligodendrocytes et la myélinisation chez la souris. Cette méthode préserve l'architecture tissulaire tout en permettant l'imagerie cellulaire sur plusieurs jours.

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Ce travail a été financé par des subventions de la National Multiple Sclerosis Society (RG4179 à A.N.), des National Institutes of Health (NIH R01NS073425 et R01NS074870 à A.N.) et de la National Science Foundation (A.N.). Nous remercions le Dr Frank Kirchhoff (Université de la Sarre, Homburg, Allemagne) pour la fourniture de souris transgéniques PLPDsRed. Nous remercions Youfen Sun pour son aide dans le maintien de la colonie de souris transgéniques.

NOTE: Toutes les procédures d&#39;animaux suivent les directives et ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) à l&#39;Université du Connecticut. NOTE: Pour ces expériences constitutifs NG2cre 18 (JAX # 008533) et inductibles NG2creER 16 (JAX # 008538) de souris transgéniques a traversé à Z / EG 19 (JAX # 003920) ou gtRosa26: YFP reporter 20 (JAX # 006148) lignes respectivement ont été utilisés à l&#39;image des cellules NG2 et de leur progéniture. Pour l&#39;image oligodendrocytes matures, PLPDsRed souris transgéniques 21 ont été utilisés. Pour la survie compatibles, les tranches peuvent être isolés à partir de souris jusqu&#39;à 10 jours après la naissance à la fois du cerveau et le cervelet. 1 tranche Préparation <ol><li> Dans une hotte de culture, de placer des inserts de culture de tissu à six plaques à puits et ajouter 1 ml de milieu de culture de la tranche (recette dans la section des réactifs). Placer les plaques dans l&#39;incubateur de culture cellulaire à 37 ° C avec 5% de CO 2 d&#39;au moins 2 heures avant la dissection. </li><li> Stériliser tous les outils et broyeur de tissus avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> tampon de bulle de dissection (recette dans la section des réactifs) avec 95% O 2, 5% de CO 2 sur la glace pendant au moins 15 min avant le début de la dissection. </li><li> Anesthésier souriceaux en les plaçant sur de la glace pendant 5-10 min selon des protocoles approuvés animaux. Déterminer la profondeur de l&#39;anesthésie appropriée en confirmant que les souris ne répondent pas à la queue et pieds pincement. </li><li> Décapiter les animaux à l&#39;aide de ciseaux pointus, suivant des protocoles d&#39;animaux. Enlever rapidement le crâne sur le cerveau et le cervelet en faisant d&#39;abord une coupe sagittale suivie par incision latérale, en utilisant des outils stérilisés. Couper les nerfs crâniens de la surface ventrale du cerveau et du cervelet avec soin par laminage du tissu sur le côté. </li><li> Passer tissu stérile dans une boîte de 35 mm contenant du tampon oxygéné de dissection glacée. </li><li> En utilisant une lame de rasoir, couper le cervelet et le cerveau antérieur. Ensuite, faire une coupe mi-sagittal thropouah le cerveau et le cervelet, la séparation des hémisphères. </li><li> Coupez les 300 coupes coronales et sagittales um d&#39;épaisseur du cerveau et du cervelet avec un hachoir manuel de tissu. REMARQUE: Un hachoir manuel de tissu permet un traitement rapide de dissection à la culture incubation sans la nécessité d&#39;intégration agarose. Un vibratome peut également être utilisé comme décrit précédemment 9. </li><li> Transfert tranches séparées dans le tampon de dissection froide fraîchement barboter sur la glace. </li><li> Utiliser une petite dissection ou pesant spatules pour séparer les sections individuelles et de les transférer à préincubée six plats et avec des inserts de culture. </li><li> Retirez tout tampon de dissection excès de la surface de l&#39;insert de culture en utilisant une pipette de transfert jetable ou une pointe P 200 de la pipette. Deux à trois cerveau antérieur ou trois tranches de cervelet peut être placé sur un insert de culture. REMARQUE: Pour obtenir des résultats cohérents avec les cultures du cerveau antérieur, il est idéal pour les tranches couvrant la partie antérieure d&#39;un tiers de corps calleux(Figure 1A) afin d&#39;étudier les deux régions grises et blanches matière dans la même tranche. Chaque animal donne généralement de six tranches de cerveau antérieur et les six tranches de cervelet. </li><li> Placez les six plaques ainsi dans l&#39;incubateur et remplacer le milieu de la tranche avec 1 ml de milieu de tranche 1 jour après la préparation de tranche, puis tous les deux jours jusqu&#39;à ce que la tranche fixation. </li><li> Selon l&#39;expérience, utiliser des tranches après 5-7 jours de culture. Utilisez uniquement des tranches qui deviennent transparent après les quelques premiers jours et jeter ceux qui ont des zones opaques inégales. REMARQUE: les régions opaques dans les tranches sont visibles à l&#39;œil nu et apparaissent comme un amas de cellules sombres en contraste de phase. Après la technique a été maîtrisé, morts tranches opaques sont rares, en moins de 1-5% des tranches. </li></ol> 2. imagerie time-lapse de la division cellulaire et NG2 Oligodendrocyte différenciation REMARQUE: Pour effectuer laps de temps imagerie de NG2 la prolifération et la différenciation cellulaire, nous utilisons NG2cre: souris ZEG 16qui expriment l&#39;EGFP dans les cellules NG2 et de leur progéniture (figure 1C-E). expression de rapporteur dans cette ligne est suffisamment robuste pour obtenir des images en direct des cellules GFP + dans les tranches immédiatement après la coupe pour une période de temps d&#39;au moins quatre semaines. Les images les plus nettes sont obtenues après la période initiale de l&#39;amincissement de la tranche, qui se produit au cours des 3-5 premiers jours de culture. <ol><li> Tout au long de l&#39;expérience, garder les tranches dans un incubateur de culture de cellules à 37 ° C et ne retirez que pour de brèves périodes de temps (moins de 15 min par tranche), en gardant le couvercle sur la plaque de six puits tandis que d&#39;imagerie. </li><li> En utilisant un microscope inversé à fluorescence équipé d&#39;une caméra numérique, de capturer des images au premier point de temps à l&#39;aide d&#39;un objectif 10X. REMARQUE: premiers points de temps varient par l&#39;expérience et peuvent être le jour où les coupes ont été préparés ou n&#39;importe quel moment après le temps. </li><li> Capturez des images à partir de plusieurs régions à un point de temps dans les deux zones de la matière grise et blanche de la tranche. Remarque èmee région imagée par des sites spécifiques au sein de la tranche et de la cartographie de la position de l&#39;image sur un schéma qui peut être utilisée pour des séances de formation d&#39;image ultérieures. Points de repère utiles peuvent inclure des bords des tranches et / ou l&#39;orientation de faisceaux de matière blanche. L&#39;image de quatre à huit endroits sur chaque tranche à chaque point de temps. </li><li> Capturer les images subséquentes à un intervalle de 4-6 heures si l&#39;examen de la division des cellules NG2 et la différenciation des oligodendrocytes, idéalement plus de 5-7 jours. </li><li> Capturer une image finale de toutes les régions et de fixer les tranches immédiatement. Ajouter 1 ml de fixateur (PFA 4% avec 0,1 M de L-lysine 0,01 M métaperiodate de sodium) à la partie inférieure de l&#39;insert de culture, puis ajouter 1 ml d&#39;autre sur le dessus des tranches. Prenez soin de ne pas injecter le fixateur directement sur la tranche, car il peut se détacher de la membrane. Fixer le tissu pendant 30 minutes et procéder à l&#39;immunohistochimie en utilisant des marqueurs spécifiques au stade de développement tel que décrit dans la section 4. </li><li> Tranches lavage avec du phosphate de sodium 0,2 M tampon 3 x 10 m. Si nécessaires, des tranches de conserver à 4 ° C à 0,2 M tampon phosphate de sodium pendant 1-3 jours avant immunomarquage mais idéalement effectuer de coloration dans les 24 heures. Passez par immunohistochimie comme décrit ci-dessous dans la section 4 pour déterminer la proportion de cellules qui sont différenciées en oligodendrocytes (figure 2D-F). </li></ol> 3. destin cartographie de NG2 descendance de la cellule en utilisant des souris transgéniques inductible Reporter dans les cultures Slice NOTE: Pour suivre le destin des cellules NG2 d&#39;un point de temps particulière dans la culture, NG2creER inductibles: souris transgéniques YFP peuvent être utilisés. <ol><li> Induire une recombinaison Cre et expression du reporteur par l&#39;ajout de 100 nM 4OHT dissous dans de l&#39;éthanol au milieu de culture. REMARQUE: cellules positives Reporter devraient apparaître dans les 1-2 jours à une efficacité d&#39;induction de ~ 20-25% YFP cellules NG2 + + / NG2 + et à ce point de temps seront tous des cellules au stade de cellules NG2 (Figure 2A-C) </li><li> Fixer et laver la tranches, à différents points dans le temps après diverses manipulations (décrits dans les sections 2.5 et 2.6). </li></ol> 4 Slice immunohistochimie <ol><li> Couper les membranes avec les tranches attachées sur les inserts à l&#39;aide d&#39;un scalpel. </li><li> Transfert tranches de puits individuels d&#39;une solution saline 24 plaque contenant bien tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant un ensemble de pinces à épiler, en prenant soin de ne pas perturber la composition de la tranche d&#39;enlèvement de la membrane. </li><li> Transférer les tranches sur une plaque à 24 puits avec une solution de blocage contenant 5% de sérum normal de chèvre (NGS) et 0,1% de Triton-X100 dans du PBS pendant 1 heure. </li><li> Incuber les tranches d&#39;anticorps primaire O / N à 5% NGS dans du PBS à 4 ° C. Pour identifier les cellules au stade de la cellule NG2, en utilisant des anticorps dirigés contre le récepteur PDGFRa et NG2. Pour identifier les oligodendrocytes différenciés, utiliser un anticorps à l&#39;antigène polypose adénomateuse coli (APC; clone CC1). </li><li> Sur la deuxième tranches de lavage de jour en PBS 3 x15 min, puis incuber dans Antibo secondairemeurt dans 5% NGS dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante. Laver les tranches dans du PBS 3 x15 min et monter sur des lames. Montage de tranches vers le haut et face à la membrane diapositive de sorte que la membrane ne sera pas entre l&#39;objectif et le tissu. </li></ol>

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<li>Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine%3A+a+neuron-glial+transmitter+promoting+myelination+in+the+CNS+in+response+to+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials.</a> Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).</li>
<li>Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+local+protein+synthesis+and+initial+events+in+myelination+by+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials.</a> Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).</li>
<li>Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometric+and+spatial+constraints+of+the+microenvironment+induce+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents

La myélinisation dans le système nerveux central est essentiel pour une communication efficace neuronale et la survie des axones 22. Cellules NG2 génèrent en permanence des oligodendrocytes myélinisantes à l&#39;âge adulte, tout en maintenant une population résidente dans la plupart des régions du cerveau 16,23 - 25. Certains mécanismes génétiques et moléculaires qui régulent la différenciation de ces cellules ont été décrits, mais beaucoup reste à découvrir. Cultures organotypique sont un outil co...

Cultures tranche Organoytpic du système nerveux central se sont avérées extrêmement utiles pour l&#39;étude de la biologie des neurones et des cellules gliales dans un système semiintact: 1 - 4. Ces cultures sont relativement simples à adopter et à conserver de nombreux avantages des cultures de cellules dissociées primaires telles que la manipulation de l&#39;environnement extracellulaire et un accès facile pour l&#39;imagerie des cellules vivantes à long terme répétées et des enregistrements électrophysiologiques 5 - 9. En outre, des cultures de tranches de tissu cytoarchitecture maintenir en 3 dimensions, la connectivité neuronale régionale, et la plupart des types cellulaires majeurs sont présents dans le système. Ces propriétés font de ces cultures un système unique et pratique pour étudier le comportement de cellules individuelles et de la physiologie des interactions cellulaires et environnementaux. NG2 cellules sont une population de cellules gliales dans le système nerveux central des mammifères, qui continuent à proliférer et à produire myelinating oligodendrocytes pendant le développement embryonnaire et postnatal 10. Ils ont été largement étudiés dans des cultures primaires de cellules dissociées, et le développement récent des lignées de souris transgéniques avec expression spécifique des cellules NG2 des protéines fluorescentes a facilité la cartographie du destin in vivo et des enregistrements électrophysiologiques dans des préparations de tranches aiguës. Même avec ces études, on sait peu sur la dynamique temporelle de NG2 la prolifération cellulaire et la différenciation des oligodendrocytes. Bien que la culture de cellules dissociées est largement utilisé pour l&#39;installation par rapport à des manipulations pharmacologiques et génétiques, il n&#39;est pas adapté pour interroger les différences fonctionnelles de ces cellules dans les différentes régions du cerveau en particulier quand il est souhaitable de maintenir le cadre de la micro-cellulaire. Cultures Slice offrent une alternative simple qui se prête à des manipulations pharmacologiques et ont été utilisées pour étudier la myélinisation des oligodendrocytes 11,12, celluleréponse parti- après lysolécithine (LPC) ou anticorps induit une démyélinisation 13,14, et l&#39;induction de la remyélinisation par un traitement pharmacologique 15. Une méthode pour enquêter et effectuer l&#39;imagerie en direct et les tissus fixés (ou postfixation) analyse de NG2 la prolifération cellulaire et la différenciation des oligodendrocytes dans les cultures organotypique prises de fois le cerveau et le cervelet est décrit. Il s&#39;agit d&#39;une méthode puissante qui peut être utilisé pour étudier le sort cellulaire des cellules NG2 simples après la division 16 et de découvrir la région et la différence d&#39;âge-dépendante du facteur de croissance induit la prolifération des cellules NG2 17. Cette technique relativement simple est largement accessible à approfondir cellule intrinsèque et / ou l&#39;environnement mécanismes de régulation de la physiologie de ces cellules gliales et leur réponse à l&#39;activité neuronale ou lésions de la myéline.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fort>Milieu de culture en tranches</fort></td></tr><tr><td>Minimum Essentiel</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td>50 %</td></tr><tr><td>Hank' s Solution saline équilibrée</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>25 %</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td>25mM</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td>1mM</td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>1mg/L</td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>0.4mM</td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Hyclone</td><td>SH30074.03</td><td>25 %</td></tr><tr><td colspan="4">Titrer à pH 7,22 avec du NaOH, filtrer avec un filtre sur le dessus de la bouteille et stocker à 4 degrés Celsius</td></tr><tr><td colspan="4">Dissection Buffer</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>124mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>3.004mM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>1.25mM</td></tr><tr><td>MgSO4 (anhydre)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>4.004mM</td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>2mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>26mM</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Acide</td> <td>ascorbiqueSigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>2.0mM</td></tr><tr><td>Adénosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>0.075mM</td></tr><tr><td colspan="4">Filtre avec filtre sur le bouchon de la bouteille et stocker à 4 degrés Celsius, oxygéner avec 95 %O2 5 %CO2 avant utilisation</td></tr><tr><td colspan="4">Autres réactifs et fournitures</td></tr><tr><td>4-hydroxy tamoxifène (4OHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904</td><td>100nM</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>EM Sciences</td><td>19200</td><td>4 %</td></tr><tr><td>L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6027</td><td>0.1M</td></tr><tr><td>Métaperiodate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1878</td><td>0.01M</td></tr><tr><td>Anticorps anti NG2 de lapin</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>AB5320</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticorps anti CC1 de souris</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>OP80</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Ki67 de souris</td><td>Vision Biosystems</td><td>NCL-Ki67-MM1</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Anticorps anti-NeuN de souris</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticorps secondaires spécifiques à l’espèce</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal (NGS)</td><td></td><td></td><td>5 %</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>0.10 %</td></tr><tr><td>Milieu de montage avec inserts de membrane de culture millicellulaire DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>0,45&mu ; Fisher</td><td>Scientific</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Filtres à bouchon de bouteille</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25F</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95 % O2 5 % CO2 mélange</td><td></td><td></td><td></td>gazeux</tr><tr><td>Phosphate Saline tamponnée (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stérile à six puits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatules de dissection (hippocampe) ou de pesée Hachoir</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>à tissus manuel ou automatique</td></tr><tr><td>Lames de</td><td></td><td></td><td></td>rasoir</tr><tr><td>Pipettes de transfert jetables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri stériles de 35 mm et 60 mm Stéréomicroscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phase inversée Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pare-agrumes à flux laminaire Incubateur</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>culture tissulaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Microcope <td></td><td></td><td></td>à<td>fluorescence inversée</td></tr></tbody></table>

cultures organotypique de tranche d&#39;étudier oligodendrocyte dynamics et myélinisation

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Les cellules exprimant NG2 (polydendrocytes, les cellules précurseurs d&#39;oligodendrocytes) sont la quatrième grande population de cellules gliales dans le système nerveux central. Au cours du développement embryonnaire et postnatal elles prolifèrent activement et génèrent oligodendrocytes myélinisantes. Ces cellules ont souvent été étudiés dans des cultures primaires dissociées, co-cultures de neurones, et dans le tissu fixe. Utilisation de lignées de souris transgéniques nouvellement disponibles tranche systèmes de culture peuvent être utilisés pour étudier la prolifération et la différenciation des cellules de la lignée des oligodendrocytes dans les deux régions de la matière grise et blanche du cerveau et le cervelet. Cultures tranches sont préparées à partir de souris postnatales et sont maintenues en culture pendant 1 mois. Ces rondelles peuvent être imagées à plusieurs reprises au cours de la période de culture cellulaire pour étudier le comportement et les interactions. Cette méthode permet la visualisation de la division cellulaire NG2 et les étapes menant à la différenciation des oligodendrocytes, tout en permettant une analyse détaillée de région dépendent cellules oligodendrocytes et NG2 hétérogénéité fonctionnelle. Ceci est une technique puissante qui peut être utilisé pour étudier les signaux intrinsèques et extrinsèques qui influent sur ​​ces cellules au cours du temps dans un environnement cellulaire qui ressemble étroitement à celle trouvée in vivo.

Des exemples de données représentatives sont donnés ci-dessous qui ont été obtenus à partir de cultures de tranche de la fois le cerveau et le cervelet de P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP et PLPDsRed lignées de souris transgéniques. Cellules NG2 peuvent être visualisés sur plusieurs jours dans du cerveau antérieur et le cervelet tranches (figure 1B-D, la vidéo 1) et le phénotype de ces cellules peut être déterminé qu'après la fixation et immunologique avec des anticorps NG2 et CC1 (figure 1E).</str...

Une technique d’étude des cellules NG2 et des oligodendrocytes à l’aide d’un système de culture en tranches du cerveau antérieur et du cervelet est décrite. Cette méthode permet d’examiner la dynamique de prolifération et de différenciation des cellules au sein de la lignée des oligodendrocytes où l’environnement extracellulaire peut être facilement manipulé tout en maintenant la cytoarchitecture tissulaire.

Cultures organotypique de tranche d&#39;étudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

L’objectif général de cette procédure est d’étudier la prolifération et la différenciation des cellules de la lignée des oligodendrocytes dans un environnement qui ressemble beaucoup à ce que l’on trouve in vivo. Ceci est accompli en préparant d’abord des cultures de tranches de quatre cerveaux et cervelet de souris transgéniques postnatales précoces. Les cellules individuelles des coupes sont ensuite imagées sur des périodes allant de quelques heures à quelques jours pour visualiser la dynamique cellulaire de leur prolifération et de leur différenciation.Après l’imagerie, l’immunohistochimie post-hoc des cellules est utilisée pour déterminer diverses caractéristiques cellulaires. En fin de compte, les résultats peuvent montrer la dynamique de la prolifération et de la différenciation cellulaires dans des conditions normales et après manipulation pharmacologique ou génétique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le charbon dissocié, les cultures de neurones et les cellules de la lignée liga incyte est que les cultures en tranches permettent de manipuler l’environnement acellulaire tout en conservant l’architecture cyto tissulaire.Toutes les procédures sur les animaux suivent les directives et ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Connecticut au moins deux heures avant la dissection. Préparez des inserts de culture tissulaire dans des plaques à six puits pour chacun. Ajoutez bien un millilitre de milieu de culture en tranches, puis transférez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone au moins 15 minutes avant la dissection.Mettez le tampon de dissection sur de la glace et commencez à le faire bouillonner avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Assurez-vous également que tous les outils et le hachoir à tissus sont stérilisés avec de l’éthanol à 70 %. Transférez le tissu dans une boîte stérile de 35 millimètres contenant un tampon de dissection oxygéné glacé.Ensuite, à l’aide d’une lame de rasoir, sectionnez le cervelet et le cerveau antérieur, puis effectuez une coupe sagittale à travers le cerveau antérieur et le cervelet séparant les hémisphères. Maintenant, à l’aide du hachoir manuel, faites des coupes coronales et sagittales de 300 microns d’épaisseur des quatre cerveaux et du cervelet. Chaque animal produit généralement six tranches de quatre cerveaux et six tranches de cervelet.Idéalement, il prélève des tranches couvrant le tiers antérieur du corps calleux afin d’étudier les régions de la matière grise et de la substance blanche dans la même tranche. Transférez les tranches séparées dans un tampon de dissection à froid fraîchement bullé sur de la glace dans le tampon, à l’aide d’une petite spatule de dissection ou de pesée. Séparez les sections individuelles et transférez-les dans des sections pré-incubées.Six boîtes de puits contenant des inserts de culture. Deux à trois tranches peuvent être placées sur une culture. Insérez la pipette de tout tampon de dissection en excès à la surface de la culture.Insérez et transférez les plaques dans l’incubateur jusqu’à ce qu’elles soient fixées. Le milieu de coupe doit être remplacé un jour après la préparation de la tranche, puis tous les deux jours jusqu’à la fixation de la tranche comme indiqué dans le protocole. Selon l’expérience, utilisez les tranches après cinq à sept jours.Dans la culture. N’utilisez que les tranches qui deviennent transparentes après les premiers jours et jetez celles qui ont des régions opaques inégales visibles à l’œil nu. Sous le contraste facial, ces régions opaques apparaissent comme un amas de cellules sombres.Si elle est effectuée correctement, les régions opaques mortes n’apparaissent pas dans plus d’une à 5 % des tranches. Pour effectuer une imagerie en accéléré de la prolifération et de la différenciation des cellules NG deux, utilisez des tranches âgées de trois à cinq jours de souris qui expriment EGFP dans les cellules NG deux. Ne laissez pas les diapositives descendre en dessous de 37 degrés Celsius pendant plus de 15 minutes.Par séance d’imagerie, en gardant la plaque fermée, utilisez l’objectif 10 x d’un microscope à fluorescence inversée pour capturer des images dans un premier temps. Point de la culture. Imagez quatre à huit emplacements sur chaque tranche à partir des zones de matière grise et blanche de la tranche.De plus, imagez des points de repère utiles tels que les bords des tranches, des cellules particulières ou l’orientation des faisceaux de substance blanche à des fins de relocalisation. L’image du point temporel précédent peut être utilisée comme image de référence lors de la relocalisation pour la division cellulaire NG deux et la différenciation des oligodendrocytes. Capturez des images toutes les quatre à six heures pendant idéalement cinq à sept jours.Si le marqueur inductible NG two cre, ER YFP est utilisé, induire l’expression du rapporteur à l’aide d’un milieu de culture avec 100 nanomolaires. Quatre hydroxytamoxifènes dissous dans l’activité du rapporteur d’éthanol devraient apparaître dans un délai d’un à deux jours. Pour la fixation, ajoutez un millilitre de fixateur au fond de la culture.Insérez et ajoutez un autre millilitre sur les tranches. Ne versez pas le fixateur directement sur les tranches, sinon elles pourraient se détacher. Fixez le mouchoir pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, puis à l’aide d’un scalpel.Découpez les membranes avec les tranches attachées. À l’aide d’une pince à épiler, transférez soigneusement les tranches dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits chargée de PBS. Ensuite, transférez les tranches dans une deuxième plaque à 24 puits chargée d’une solution bloquante contenant 5 % de sérum de chèvre normal et 0,1 % de tritton X 100 dans du PBS.Laissez-les incuber dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante. Une fois bloquées, déplacez les tranches vers une plaque chargée d’anticorps primaires dans du PBS avec 5 % NGS. Laissez-les incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain.Lavez les tranches dans du PBS. Ensuite, incubez les tranches avec des anticorps secondaires dans du PBS avec 5 % NGS. Laissez l’incubation durer une heure à température ambiante.Poursuivez avec trois autres lavages en PBS comme précédemment et montez les tranches avec la membrane face à la lame afin qu’elle ne se trouve pas entre l’objectif et le tissu. Pour analyser la dynamique temporelle de la différenciation des oligodendrocytes, des images de la division cellulaire de NG two ont été obtenues à partir de cultures de coupes du cerveau antérieur de souris transgéniques P huit NG two creeg sur plusieurs jours, des séquences en accéléré ont été prises sur 122 heures. Le phénotype des cellules divisées a été déterminé avec des anticorps NG 2 et CC un.La prolifération cellulaire a également été évaluée à l’aide d’une coloration immunohistochimique pour le marqueur de prolifération cellulaire. La cartographie de l’appât KI 67 des cellules NG deux a été réalisée après induction de la recombinaison CRE dans des coupes de souris NG deux CRE YFP. Deux jours après l’ajout de quatre hydroxy tamoxifène.Un rapporteur YFP exprimant des cellules NG deux positives a été trouvé dans les cultures. Quatre jours plus tard, une proportion de ces cellules s’est différenciée en CC un oligodendrocytes positifs cytes. Des oligodendrocytes matures ont été imagés dans des cultures de tranches de cervelet à partir de P-L-P-D-S.Des neurones Perkin myélinisés de souris rouges étaient présents dans ces cultures. Des images répétées ont montré que l’ajout de DS rouge myélinisant exprimant la chimie immunohisto des oligodendrocytes dans ces coupes a montré une expression substantielle de la protéine basique de la myéline. Enfin, l’imagerie à plus haute résolution temporelle a révélé des corps cellulaires oligodendrocytaires stables avec quelques mouvements mineurs dans les processus distaux.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des cultures de tranches à partir des quatre cerveaux et du cervelet, d’imager à plusieurs reprises des cellules uniques pendant des jours ou des heures et d’analyser le destin des cellules d’image à l’aide de l’immunohistochimie post-ho. En plus de l’imagerie, ces coupes permettent également de manipuler l’environnement cellulaire tout en utilisant des techniques de cartographie du destin telles que la recombinaison de crème inductible dans une tranche préparée.

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