Amélioration dans le gel sulfo-réductrices glycomique β-élimination complète pour O-liés et par spectrométrie de masse

L’objectif global de cette procédure est de récolter les glycanes Olink. Ceci est accompli en résolvant d’abord les glycoprotéines par la page SDS. La deuxième étape consiste à laver les morceaux de gel contenant la glycoprotéine d’intérêt.

Ensuite, les glycanes olink sont libérés par élimination bêta réductrice. La dernière étape est le glycane par méthylation avec partition de phase. En fin de compte, les glycanes méthylés perm sont analysés par spectrométrie de masse en tandem pour détecter les structures et quantifier les abondances.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la chromatographie liquide à haute performance, est que notre méthode sépare les glycanes neutres et chargés par méthylation dans une partition de phase rapide. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la glycoscience en permettant une caractérisation complète des glycanes ou des glycanes liés libérés par les glycoprotéines résolues. Avant de commencer cette procédure, éliminez les glycoprotéines à l’aide de l’électrophorèse sur gel.

Après l’électrophorèse, placez le gel sur une plaque de verre et excisez la région d’intérêt à l’aide d’un scalpel propre pour augmenter le rendement en glycanes OG. Transférez la bande de gel d’intérêt sur une autre plaque de verre et coupez le morceau en cubes d’environ deux millimètres. Transférez les petits morceaux de gel dans un tube en verre à vis de 13 x 100 millimètres avec une spatule micros en acier inoxydable.

Ensuite, ajoutez un millilitre de bicarbonate d’ammonium ou ambi de 25 millimolaires dans le tube d’échantillon. Après avoir bouché le tube avec un bouchon à vis en téflon, mélangez doucement le contenu en effleurant le tube avant de le laisser reposer pendant 10 minutes. Retirez ensuite délicatement l’ambage du tube en verre.

À l’aide d’une pipette de pâturage ou de verre, ajoutez un millilitre d’acéto nitrile dans le tube de verre pour couvrir complètement les morceaux de gel. Après avoir bouché le tube, mélangez doucement le contenu en tapotant le tube avant de le laisser reposer pendant 10 minutes. Lorsque vous avez terminé, retirez l’acéto nitrile du tube en verre.

Après avoir répété les étapes précédentes jusqu’à ce que la couleur bleu vif soit éliminée, ajoutez deux millilitres d’acétate d’éthyle et rebouchez le tube. Placez le tube à quatre degrés Celsius pendant la nuit en agitant de bout en bout. Une fois le lavage à l’acétate d’éthyle retiré, effectuez trois lavages avec deux millilitres d’eau déminéralisée.

Une fois les morceaux de gel séchés, ajoutez 500 microlitres d’une solution d’hydroxyde de sodium de 100 millimolaires. Et restons debout pendant trois à cinq minutes sur la glace pour équilibrer le gel aux conditions de base qui améliorent la récupération des glycanes. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de boro-hydrure de sodium de deux molaires dans de l’hydroxyde de sodium de 100 millimolaires, ce qui donne des concentrations finales d’un boro-hydrure de sodium molaire dans de l’hydroxyde de sodium de 100 millimolaires.

Après avoir délicatement mélangé le tube, incubez l’échantillon à 45 degrés Celsius pendant 18 heures. Pendant la première heure d’incubation, mélangez doucement le tube toutes les 15 minutes. Une fois que la réaction d’élimination bêta est terminée et que le tube a été placé sur de la glace, ajoutez lentement 10 % d’acide acétique goutte à goutte.

Pour neutraliser la base, agitez doucement le tube d’échantillon entre les ajouts d’acide acétique, centrifugez le tube pour éliminer les bulles et éviter les débordements si nécessaire. Pour faire une petite colonne de verre, grattez et cassez l’extrémité d’une pipette de pâturage ou de verre à l’aide d’un cutter en céramique de sorte que le cône de la pointe de la pipette mesure environ un centimètre de long. Après avoir écarté un bouchon de laine de verre, poussez-le vers la pointe, formant un support pour le lit de résine.

Fixez la colonne de pipette à l’aide d’une épingle à linge et placez-la sur un tube à essai en verre. Ensuite, lavez la pipette vide contenant de la laine de verre avec un millilitre de méthanol et trois millilitres d’acide acétique à 5 %. Après tourbillonnement de la résine échangeuse d’hydrogène Dow X dans de l’acide acétique à 5 %.

Transférez suffisamment de liquide pour produire un volume de lit d’un millilitre dans la colonne de pipette de pâturage, rincez la colonne avec cinq volumes d’acide acétique à 5 % en vérifiant l’apparition de particules de résine dans le débit. Après avoir placé la colonne sur un nouveau tube en verre à vis de 16 x 125 millimètres, chargez l’échantillon sur la colonne. Une fois que le flux a été recueilli, éluez les glycanes contenant au moins trois volumes d’acide acétique à 5 % dans le même tube.

Après lyophilisation, ajoutez 300 microlitres d’acide acétique à 10 % dans du méthanol dans le tube d’échantillon séché. Après le vortex, éliminer le triméthylbate résultant par évaporation sous un courant d’azote à 37 degrés Celsius. Après avoir répété les étapes de remise en suspension et de séchage au moins quatre fois, reconstituez l’échantillon dans de l’acide acétique à 5 %.

Une fois que l’échantillon a été chargé sur une colonne C 18 équilibrée, collectez le flux dans un tube à bouchon à vis en verre de 13 x 100 millimètres. Éluez les glycanes OOG avec trois millilitres d’acide acétique à 5 % dans le même tube. Ensuite, lyophilisez l’échantillon pour préparer le réactif de base pour la méthylation permanente.

Ajoutez 400 microlitres d’hydroxyde de sodium à 50 % dans un tube à vis en verre propre de 13 x 100 millimètres. Ajoutez ensuite 800 microlitres de méthanol anhydre dans le même tube. Ajoutez quatre millilitres d’oxyde de diméthylsulf anhydre et un vortex pour générer un précipité blanc.

Centrifugez l’échantillon à 600 fois G pendant une minute pour granuler le précipité. Après avoir jeté le surnageant et ajouté quatre millilitres d’oxyde de diméthylsulf anhydre dans le vortex de pastilles, le réactif Répétez quatre fois de plus jusqu’à ce que la suspension de base devienne translucide. Dissoudre la base granulée dans trois millilitres d’oxyde de diméthylsulf anhydre et mélanger doucement en pipetant de haut en bas avec une pipette de pâturage propre.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’oxyde de diméthylsulf anhydre à l’échantillon séché et au vortex. Pour le remettre en suspension, ajoutez 300 microlitres de boue de base remise en suspension à l’échantillon, et ajoutez immédiatement 100 microlitres de méthane ITOM. Scellez le tube avec un capuchon doublé de téflon et mélangez vigoureusement pendant cinq minutes par vortex.

Pour arrêter la réaction de méthylation permanente, placez le tube sur de la glace et ajoutez deux millilitres d’acide acétique à 5 %. Après le vortex, pipetez la solution cinq fois vers le haut et vers le bas pour réduire le volume restant de méthane ITOM par évaporation. À ce stade, ajoutez deux millilitres de di chlorométhane à l’échantillon après vortex et centrifugation.

Transférez la couche aqueuse supérieure dans un nouveau tube de verre de 13 x 100 millimètres. Après avoir répété le lavage aqueux de la couche de dichlorométhane, combinez la deuxième phase aqueuse avec la première couche aqueuse. Une fois que le lavage à l’eau de la phase de chlorométhane a été répété deux à trois fois, transférez la phase de méthane de chlore dans un tube en verre propre avec une pipette de pâturage propre.

Ensuite, séchez la phase organique sous un jet d’azote à 42 degrés Celsius. Après avoir équilibré une colonne C 18 et y avoir chargé la couche aqueuse. Lavez la colonne C 18 avec de l’eau, puis éluez les o glycanes sulfatés méthylés permanents dans un nouveau tube de verre avec deux millilitres de 50 % d’acéto nitrile, analysez les glycanes OG méthylés permanents par infusion directe dans un spectromètre de masse approprié à l’aide d’une source de nano électropulvérisation à un débit de seringue de 0,4 à 0,6 microlitres par minute à 210 degrés Celsius.

La température capillaire pour la fragmentation par dissociation induite par collision dans le MSM S et la MS multidimensionnelle d’un instrument à piège ionique appliquent 30 à 40 % d’énergie de collision. Des échantillons de glycanes olink méthylés perm libérés de la mucine bovine à l’aide de l’élimination bêta réductrice d’ingel sont illustrés ici dans le panneau supérieur. Le spectre est dominé par un contaminant polydispersé dérivé du gel de polyacrylamide. Le panneau inférieur démontre que le lavage à l’acétate d’éthyle des morceaux de gel avant l’élimination bêta élimine ce problème.

Des glycanes endossés ont été libérés de la mucine sous-maxillaire bovine par élimination bêta réductrice d’Ingel à l’aide de morceaux de gel coupés en petits ou en gros. La récupération des glycanes à partir de petits morceaux de gel était presque dix fois supérieure à celle des grandes tranches de gel. Les glycanes méthylés permanents neutres sont récupérés dans la phase organique de chlorométhane.

Alors que la permanente onique, les glycanes méthylés sont quantitativement répartis dans la phase aqueuse. L’efficacité et la simplicité de la méthode de partition de phase facilitent considérablement le débit d’échantillons et les approches analytiques ultérieures. Des O glycanes perm méthylés non sulfatés ont été récupérés de la phase organique, et tous les glycanes sul méthylés perm ont été récupérés de la phase aqueuse, ce qui facilite l’identification et la caractérisation de glycanes sulfatés et non sulfatés presque isobares.

Ces glycanes ne diffèrent que de 0,1 unité de masse et seraient difficiles à résoudre sans séparer physiquement les deux espèces par partition de phase après son développement. Cette technique a permis une exploration approfondie de la diversité des glycanes dans des échantillons de tissus, des cellules cultivées, des systèmes modèles et des échantillons de patients. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de palmer et de répartir avec succès tous les glycanes liés libérés par les protéines gly.

Résolu par la page SDS.