Name: Une nouvelle méthode de Drug Administration à la sclérose en poisson zèbre ( Danio rerio) Et la quantification de retrait (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Découvrez une méthode d'administration simultanée d'éthanol chez Danio rerio pour étudier les comportements de sevrage. Cette technique réduit la variabilité et permet une quantification précise de l'anxiété par suivi du mouvement.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Toutes les procédures et les tests comportementaux ont été approuvés par le Conseil d&#39;éthique de la recherche animale de l&#39;Université MacEwan sous le numéro de protocole 11/06/12, qui est en conformité avec le Conseil canadien pour les directives de protection des animaux pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 1. Préparer Réservoirs de dosage, des solutions et le schéma d&#39;administration <ol><li> Préparer un calendrier d&#39;administration tels que les animaux sont traités dans le même environnement et dans le même temps de la journée pour éviter les facteurs de confusion de temps ou de sollicitation à des stimuli visuels. </li><li> Obtenir le plus grand nombre, 1,5 L, réservoirs en polypropylène de frai claires identiques nécessaires pour le nombre de tailles de groupe. Utilisez les groupes de 8 poissons par bassin, ce qui permet pour 2 groupes de poissons à tester par jour plus tard dans la procédure (voir l&#39;étape 3). Utiliser une cuve de retenue et une cuve de dosage par groupe (2x nombre total de groupes). <ol><li> Placez 400 um inserts de frai dans tous les bassins de rétention. Famal les réservoirs avec de l&#39;eau ou de l&#39;habitat eau par osmose inverse à la bonne température (pour le poisson-zèbre, 25-28 ° C) qui est compatible avec le poisson de température sont normalement logés à. REMARQUE: Il peut y avoir des interactions chimiques indésirables entre certains médicaments et les composants chimiques de l&#39;eau de l&#39;habitat tamponnée. Dans cette situation, utiliser de l&#39;eau par osmose inverse tamponné avec des sels d&#39;aquarium minimales ou pas pour l&#39;administration du médicament, ainsi que pour les groupes de contrôle. </li><li> Veiller à ce que les réservoirs sont dans un environnement neutre pour éviter de conditionnement du poisson à des stimuli visuels extérieurs pendant le dosage. </li></ol></li><li> Préparer la solution de médicament. Mélanger la quantité appropriée de ce médicament avec de l&#39;eau de l&#39;habitat dans les bassins de ponte. Préparation de la solution d&#39;éthanol à 0,2% en combinant 3 ml d&#39;éthanol à une forte teneur (95% d&#39;éthanol non dénaturé) avec 1497 ml d&#39;eau. Préparation de la solution d&#39;éthanol à 1,4% en combinant 21 ml d&#39;éthanol avec 1 479 ml d&#39;eau. </li></ol> 2. La compensation poisson et EtProcédure d&#39;administration Hanol <ol><li> Filet de pêche avec soin à partir de leurs réservoirs de l&#39;habitat et le transfert dans le réservoir de retenue approprié contenant l&#39;insert de frai. Idéalement, abritera le poisson dans l&#39;insert de frai pour éliminer compensation tout à fait. </li><li> Avec tous les poissons dans leurs réservoirs de stockage respectifs, soulevez doucement le frai insérer sur le réservoir de stockage et le placer dans le réservoir de solution appropriée des médicaments (figure 1A). <ol><li> Noter le temps de dosage requis. Utiliser 30 min dans la solution d&#39;éthanol à la procédure décrite ici. </li><li> Si possible, les assistants aident au transfert de tous les groupes expérimentaux à la solution de médicament à la fois à assurer un temps de dosage précis. Sinon, transférer un groupe à la fois et de garder trace de dosage fois (figure 1A) de groupes individuels. </li></ol></li><li> A la fin de la période de traitement nécessaire, retirer le poisson de la solution d&#39;éthanol en soulevant soigneusement l&#39;insert de fraide la solution de médicament et mettre doucement dans le réservoir de retenue. </li><li> Doucement net les poissons dans les réservoirs de rétention et remettez-les dans leur habitat jusqu&#39;à la prochaine fois de dosage régulier, ou placer le frai insérer dans le réservoir de retenue pour éliminer filet. </li><li> Comme mentionné précédemment, si possible dans les paramètres de l&#39;équipement de locaux d&#39;élevage, les animaux de la maison même réservoir et insertion de reproduction qui est utilisé comme réservoir de stockage. Cela permettra d&#39;éliminer complètement filets pendant la procédure d&#39;administration. </li></ol> 3. tests comportementaux <ol><li> Obtenir une lumière / obscurité arène 9,5 cm de large par 55 cm de long et 9,5 cm de profondeur avec un plancher imperméable blanc (figure 1B). Fixez papier non réfléchissant blanc et noir étanche sur les parois intérieures de la scène à l&#39;aide du velcro, avec la moitié de l&#39;arène couverte en blanc et à moitié recouvert de noir. Remplir l&#39;arène à une profondeur de 5 cm avec de l&#39;eau de l&#39;habitat à une température de 25-28 ° C. Maintain cette température tout au long de l&#39;essai. </li><li> Minimaliser stimuli visuels externes en construisant une enceinte à trois faces blanc pour l&#39;arène pour être situé dans. Assurer la zone de test a diffuser un éclairage zénithal qui ne provoque pas de réflexions sur la surface de l&#39;eau, mais est suffisamment lumineux pour le logiciel de suivi de mouvement, ou par la poste quantification -hoc manuel à partir d&#39;images vidéo. </li><li> Placer l&#39;arène dans l&#39;enceinte et définir les enregistrement et d&#39;analyse de mouvement paramètres du logiciel de suivi du comportement. Réglez la durée de l&#39;essai de 5-15 min, en fonction de la question de recherche. NOTE: Ici, nous avons utilisé 5 min. </li><li> Transporter le groupe de poissons à tester à la zone de recherche dans le réservoir de l&#39;habitat et de les placer à l&#39;extérieur de l&#39;enceinte de l&#39;arène. Acclimater les poissons pendant 10 minutes. </li><li> Un poisson doucement net du groupe et endroit approprié dans le centre de la lumière / obscurité arène, en étant sûr de libérer le poisson quand il est positionné parallèlement à l&#39;axe de l&#39;arène pour avoid sollicitant le poisson à la lumière ou de la zone sombre. </li><li> Commencez comportement enregistrement immédiatement après que l&#39;animal est relâché. Soyez attentif aux problèmes de logiciels avec le suivi du poisson ou pour le saut de poisson ou de gel. Tournez la scène à 180 ° après la moitié des sujets ont été testés pour éviter les facteurs de confusion en raison de biais résultant de quelle extrémité de l&#39;arène est orientée vers l&#39;extrémité ouverte de l&#39;enceinte. </li><li> Après la fin du procès, doucement net et retirer le poisson de l&#39;arène pour un réservoir de retenue ou réservoir de l&#39;habitat. </li></ol> 4. Analyse <ol><li> Examiner le temps passé à la lumière par rapport à des zones sombres. Pour chaque groupe et chaque poisson, obtenir le temps relatif passé dans les zones claires et sombres et d&#39;analyser l&#39;aide d&#39;un t -test d&#39;un échantillon (ou de Wilcoxon rank test pour les données non paramétrique; différence de (la moitié du temps d&#39;essai totale) 150 sec) pour déterminer si les groupes préfèrent nettement une zone sur l&#39;autre. </li><li> Pour comparer les préférences, calculer un instaindice rence en soustrayant le temps passé dans la zone la lumière du temps passé dans la zone sombre et comparer les différences entre les groupes. tests t peut être utilisé pour comparer deux groupes. Comparez plusieurs groupes avec une analyse unidirectionnelle de variance en utilisant le test HSD post hoc de Tukey le cas échéant (ou Kruskal-Wallis test avec comparaison multiple de Dunn de test post hoc des données non paramétrique). </li><li> Comparer la vitesse, le nombre de transitions de zone, sinueux, et l&#39;immobilité entre les groupes. Utilisez une analyse de variance en utilisant le test HSD post hoc de Tukey le cas échéant (ou Kruskal-Wallis test avec comparaison multiple de Dunn de test post hoc des données non paramétrique). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs reconnaissent Joshua Gallup pour l&#39;utilisation de sa photographie équipement utilisé pour la figure 1. Ce travail a été soutenu par un en sciences naturelles et en génie Conseil de recherches en subvention (CRSNG) du Canada Discovery (à TJH).

Des études antérieures portant sur ​​l&#39;administration de médicaments chez le poisson zèbre ont simplement compté sur la compensation du poisson pour les transporter à partir de leur réservoir d&#39;origine dans la solution médicamenteuse 12,16. La compensation est pas toujours cohérente et prend souvent plus de temps que prévu en raison de la réaction de fuite du poisson zèbre, qui a la variabilité individuelle importante. Méthodes de transfert classiques, tout en étant utiles, peuvent être améliorées en ...

Le poisson zèbre (Danio rerio) est une petite espèce de poissons téléostéens originaires de l&#39;Inde qui est un organisme modèle utile pour comportementale 1 et 2,3 médicale recherche. Le poisson zèbre sont aussi couramment utilisé dans l&#39;essai de diverses substances pharmacologiques afin de caractériser leur impact sur le comportement. Diverses doses et schémas d&#39;administration de médicaments ont été utilisés pour étudier le comportement du poisson zèbre après l&#39;administration de composés tels que des stimulants, des anxiolytiques 4 et 5 de l&#39;éthanol 8/6. Notre laboratoire a étudié les effets de différents schémas d&#39;administration de l&#39;éthanol sur l&#39;anxiété poisson zèbre et de la locomotion à la lumière / obscurité essai bien validé 9, 20, aussi communément appelé le test scototaxic. Un nouveau procédé d&#39;administration de l&#39;éthanol a été développé pour améliorer l&#39;efficacité de répétition, l&#39;administration quotidienne pendant une longue période de temps (21 jours) 6 </sjusqu&#39;à&gt;. Méthodes précédemment utilisées étaient pratique, cependant, nous avons cherché à développer une méthode qui réduit filet, avec ses coûts de temps associées, et a permis simultanée, l&#39;administration chronométré précisément de la drogue de l&#39;intérêt pour un grand nombre de poissons. Dans la recherche utilisant de l&#39;éthanol traditionnel, le poisson zèbre sont déduits et transféré d&#39;un réservoir à un autre contenant le mélange approprié de l&#39;éthanol et de l&#39;eau 10-12. Bien que cette méthode est largement acceptée, filets de poisson zèbre peut augmenter la variabilité dans le temps nécessaire pour introduire et retirer le poisson de la solution médicamenteuse. Par conséquent, l&#39;exposition exacte du composé d&#39;intérêt peut varier au cours d&#39;une expérience impliquant des doses répétées. Une méthode qui permet de réduire les sources d&#39;erreurs résultant de la variabilité des temps de transport est donc souhaitable. Avec notre méthode, nous sommes en mesure de déplacer tous les poissons en même temps, résultant en temps de dosage identique dans chaque poisson. Après l&#39;exposition de l&#39;éthanol (décrit ici), le poisson-zèbre peut être testé en number de tests comportementaux, y compris ceux qui évaluent l&#39;anxiété. Dosage des groupes de poissons à l&#39;aide de la nouvelle méthode a des applications pratiques au-delà de la capacité de se répliquer et de normaliser le dosage entre les sujets et entre les groupes de poissons avec précision. L&#39;avènement d&#39;un nouveau logiciel qui permet de faire le suivi de plusieurs poissons à la fois peut voir les chercheurs utilisent nos méthodes pour assurer la reproductibilité et la précision dans leurs expériences. Compte tenu de l&#39;utilisation généralisée de poisson zèbre comme organisme modèle pour neurosciences comportementales, cette méthode permettra d&#39;accroître l&#39;efficacité et de praticité dans les futures études pharmacologiques. Dans le paradigme actuel, un calendrier de dosage répété était employé qui reflète approximativement horaires de consommation humaine. Les poissons ont été assignés au hasard à l&#39;un des trois groupes: contrôle, quotidien modéré, ou hebdomadaire frénésie. Le programme de dosage était de 21 jours dans la durée, choisi parce qu&#39;il a dépassé de manière significative les temps d&#39;exposition dans les études précédentes 7. poissons de commande reçu alco zérohol, poisson quotidien modéré reçu 0,2% d&#39;alcool une fois par jour, et le poisson hebdomadaire binge reçu 1,4% d&#39;alcool une fois par semaine. La tâche clair / foncé a été utilisé pour évaluer l&#39;anxiété après 2 jours de retrait. Ceci est un test relativement simple à administrer qui utilise une arène rectangulaire dans laquelle les parois d&#39;un côté, sont de couleur blanche et de l&#39;autre côté sont sombres 9. Poisson zèbre adulte préfèrent robuste le côté sombre de la scène dans des conditions de contrôle 6,9,13. Augmentation de l&#39;anxiété est opérationnel correspond à beaucoup plus de temps passé dans la zone sombre et une diminution de l&#39;anxiété peut supposer lorsque le poisson passe relativement plus de temps passé dans la zone de lumière. Avec le logiciel de suivi de mouvement, d&#39;autres variables d&#39;information peuvent également être quantifiés, y compris la vitesse moyenne, l&#39;immobilité, sinueux, et les transitions zone 14. La méthode de dosage développé dans notre laboratoire peut appliquer à toute recherche dans lequel les composés solubles dans l&#39;eau sont administrés une ou plusieurs zebrafish. Beaucoup d&#39;autres agents pharmacologiques qui peuvent bénéficier de cette méthode sont actuellement testés chez le poisson zèbre. Généralement les composés testés sont la nicotine, le chlordiazépoxyde, la buspirone, et la scopolamine, que l&#39;on dissout d&#39;une manière similaire à l&#39;éthanol; en mélangeant la quantité appropriée de la substance chimique dans l&#39;eau. Par conséquent, la portée générale de cette procédure est beaucoup plus large et non limitée à l&#39;éthanol. En outre, après l&#39;administration de médicaments pour plusieurs jours, la tâche de lumière / obscurité est seulement un des nombreux tests comportementaux qui pourraient être employées. Après l&#39;administration du médicament ou durant le retrait, d&#39;autres tests populaires qui peuvent être utilisés comprennent le test de plongée roman de réservoir 15 et des tests de comportement social tels que shoaling 16. La procédure suivante présente une méthode efficace de transfert à plusieurs reprises des groupes de poissons ou individuelle dans des solutions contenant un composé pharmacologique d&#39;intérêt. En outre, le processus de test anxiété avec le test lumière / obscuritédans les groupes de poissons qui sont en retrait après avoir été exposés à de longues listes d&#39;administration d&#39;alcool sera décrit.

<table><tbody><tr><td>Système de logement de banc à trois étagères</td><td><a href="http://aquatichabitats.com/research-systems/z-hab-system/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aquatic Habitats</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de reproduction de 1,5 L avec déflecteur de 400 &amp;mu;m</td><td><a href="http://aquatichabitats.com/consumables/tanks-lids-and-baffles/info/nursery-tank-and-baffles/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aquatic Habitats</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol de grain pur</td><td><a href="http://www.luxco.com/brands/vodka-neutral-spirits-neutral-spirits-everclear" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Luxco, INC</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de suivi du mouvement Ethovision XT</td><td><a href="http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Noldus Information Technology</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td><a href="http://eshop.eppendorf.ca/categories/1" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Eppendorf Canada</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arena clair/obscur</td><td>Personnalisé</td><td></td><td>Construire selon la description de la procédure. 9,5 cm de large, 9,5 cm de profondeur, 55 cm de long.</td></tr></tbody></table>

une nouvelle méthode de drug administration à la sclérose en poisson zèbre ( danio rerio) et la quantification de retrait

A Novel Method of Drug Administration to Multiple Zebrafish (Danio rerio) and the Quantification of Withdrawal

Les tests d’anxiété chez le poisson-zèbre sont souvent étudiés en combinaison avec l’application de substances pharmacologiques. Dans ces études, les poissons sont régulièrement pêchés au filet et transportés entre les aquariums domestiques et les bassins de dosage. Afin d’améliorer la facilité d’administration des composés, une nouvelle méthode de transfert de poissons entre les réservoirs pour l’administration de médicaments a été développée. Des inserts conçus pour le frai ont été utilisés pour transférer des groupes de poissons dans la solution médicamenteuse, ce qui a permis un dosage précis de tous les poissons du groupe. Cela augmente la précision et l’efficacité du dosage, ce qui devient très important dans les longs calendriers d’administration répétée de médicaments. Nous avons mis en œuvre cette procédure pour l’utiliser dans une étude examinant le comportement du poisson-zèbre dans le test lumière/obscurité après avoir administré de l’éthanol avec des calendriers différents de 21 jours. Chez les poissons exposés à des quantités modérées d’alcool quotidiennement, il y avait une différence significative dans la préférence de l’endroit après 2 jours de retrait par rapport au groupe témoin. Cependant, aucune différence significative n’a été observée dans la préférence géographique dans un groupe exposé à une administration hebdomadaire de beuverie. 
Ce protocole peut être généralisé pour être utilisé avec tous les types de composés solubles dans l’eau et peut être utilisé dans n’importe quelle situation où le comportement des poissons pendant ou après de longs cycles d’administration de médicaments est examiné. Le test de la lumière et de l’obscurité est également une méthode précieuse pour évaluer les changements d’anxiété induits par le sevrage.

Pour assurer la précision et le contrôle dans le poisson zèbre avec les études pharmacologiques, il est important pour la durée du temps de l'administration d'éthanol uniforme et précise de la manière décrite ci-dessus. Notre procédé permet d'augmenter la facilité et le débit de la procédure de dosage. L'administration de l'éthanol soit toutes les semaines ou tous les jours binge-modérée horaire a donné lieu à des niveaux d'anxiété altérées, mesurées avec le / test sombre de la lumière, par rapport aux témoins. Lors d'u...

Une nouvelle méthode pour réduire la variabilité lors de l’exposition des poissons à des drogues est expliquée. Dans un essai scototaxique clair/foncé, on a constaté que les poissons exposés à divers types d’exposition à l’éthanol présentaient des niveaux d’anxiété modifiés pendant le sevrage.

Une nouvelle méthode de Drug Administration à la sclérose en poisson zèbre ( Danio rerio) Et la quantification de retrait

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely ...

L’objectif global de cette procédure est de doser des groupes de poissons avec de l’éthanol avec précision et efficacité afin d’évaluer les effets de doses répétées sur le comportement de sevrage. Ceci est accompli en dosant d’abord le poisson zèbre, à l’aide d’une nouvelle méthode qui a été développée pour permettre l’exposition simultanée à des groupes entiers de poissons pendant des périodes de temps précises. La deuxième étape consiste à continuer à doser le poisson selon un calendrier qui permet de tester les effets spécifiques du sevrage de l’éthanol.Ensuite, pendant le retrait, les poissons sont testés individuellement dans une tâche sombre et légère à l’aide d’un logiciel de suivi de mouvement pour enregistrer les mouvements. La dernière étape consiste à analyser les données afin d’étudier les effets du sevrage de l’éthanol sur le comportement du poisson zèbre. En fin de compte, l’administration répétée d’éthanol en utilisant la procédure décrite entraîne un effet transitoire mais marqué sur le comportement du poisson zèbre après deux jours de sevrage.Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’administration simultanée de médicaments à de grands groupes d

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La vidéo décrit le test de préférence clair-noir pour étudier le comportement lié à l’anxiété chez le poisson zèbre après l’exposition à l’éthanol.

Test de préférence lumière-obscurité : une méthode pour étudier le comportement lié à l’anxiété chez le poisson-zèbre

Les poissons-zèbres sont un organisme modèle important pour l’étude de l’homéostasie énergétique.  En utilisant un indicateur redox sensible au NADH2, alamar Blue, nous avons mis au point un test qui mesure le taux métabolique des larves de poisson-zèbre dans un format de plaque à 96 puits et peut être appliqué à la découverte de médicaments ou de gènes.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Dépense énergétique Assay

Le but du présent protocole est de mesurer le temps de transit des aliments fluorescent étiquetés dans le tube digestif du poisson-zèbre larvaire dans un mode haut débit.

Haut débit mesure du temps de Transit intestinale à l’aide de larve Zebrafish

Ce manuscrit décrit une méthode simple pour mesurer le stress comportemental chez le zébrafish adulte. L’approche profite de la tendance innée que le zébrafish préfèrent la moitié inférieure d’un réservoir quand dans un État stressant. Nous décrivons également les méthodes de couplage du dosage avec la pharmacologie.

Approches comportementales pour étudier le stress inné dans le Zébrafish

Les embryons de poissons zèbres sont utilisés pour évaluer la toxicité des composés chimiques. Ils se développent à l'extérieur et sont sensibles aux produits chimiques, permettant la détection de changements phénotypiques subtils. L'expérience ne nécessite qu'une petite quantité de composé, qui est directement ajouté à la plaque contenant des embryons, ce qui rend le système de test efficace et rentable.

Évaluation rapide de la toxicité des composés chimiques à l'aide d'embryons de poisson zèbre

Les modèles de xénogreffe de poisson zèbre permettent le dépistage des médicaments à haut débit et l’imagerie fluorescente des cellules cancéreuses humaines dans un microenvironnement in vivo. Nous avons mis au point un flux de travail pour le dépistage automatisé à grande échelle des médicaments sur des échantillons de leucémie dérivés du patient chez le poisson zèbre à l’aide d’une unité d’imagerie automatisée équipée d’un microscope à fluorescence.

Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Ici, nous présentons une batterie complète de tests comportementaux, y compris le nouveau réservoir, les bancs et les tests de préférence sociale, pour déterminer efficacement les effets neurotoxiques potentiels des produits chimiques (par exemple, la méthamphétamine et le glyphosate) sur les poissons-zèbres adultes en utilisant un seul réservoir. Cette méthode est pertinente pour la recherche sur la neurotoxicité et l’environnement.

Évaluation de la neurotoxicité chez Danio rerio adulte à l’aide d’une batterie de tests comportementaux dans un seul réservoir

Une nouvelle méthode d’injection intrapéritonéale (IP) chez le poisson-zèbre adulte est décrite. Lors de la manipulation de composés toxiques tels que la doxorubicine, cette procédure est plus efficace que les deux méthodes de propriété intellectuelle précédemment mentionnées. La technique est conçue pour être facilement adoptée par les chercheurs ayant une expérience limitée du modèle du poisson zèbre.

Une technique d’injection intrapéritonéale chez le poisson-zèbre adulte qui minimise les dommages corporels et la mortalité associée

Ce protocole décrit une procédure de dépistage de médicaments chez les larves de poisson-zèbre 3 à 7 jours après la fécondation, suivie d’une évaluation morphologique.

Dépistage de petites molécules et essais de toxicité chez les larves de poisson-zèbre à un stade précoce

Cette étude présente une méthode d’alimentation à base de gélatine qui permet une administration orale précise, non invasive et basée sur la masse corporelle, chez les poissons-zèbres adultes. Le protocole démontre une acceptation fiable de l’alimentation et, à titre de preuve de principe, une livraison réussie de MK-801, ce qui a entraîné les effets comportementaux attendus.

Une approche simple et précise basée sur l’alimentation pour la délivrance orale de médicaments chez les poissons

Découvrez une méthode d'administration simultanée d'éthanol chez Danio rerio pour étudier les comportements de sevrage. Cette technique réduit la variabilité et permet une quantification précise de l'anxiété par suivi du mouvement.

Une nouvelle méthode de Drug Administration à la sclérose en poisson zèbre ( Danio rerio) Et la quantification de retrait

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