Tueur antigène artificielle cellules présentatrices (KaAPC) d'utilisation efficace In Vitro L'épuisement des lymphocytes T humains spécifiques de l'antigène

L’objectif global de cette expérience est de générer une cellule présentatrice d’antigène tueuse artificielle non cellulaire basée sur HLA IG, ou K-A-A-P-C pour l’épuisement des populations de cellules T autoréactives ou indésirables. Ceci est réalisé en liant d’abord de manière covalente les molécules HLA IG et les anticorps monoclonaux Antifa sur des particules de fer dextran de taille cellulaire pour la génération du K-A-A-P-C fonctionnel. Ensuite, les K-A-A-P-C sont chargés de différents peptides d’intérêt pour cibler la population de lymphocytes T spécifiques de l’antigène indésirable.

En fin de compte, une analyse cytrique en flux peut être effectuée pour mesurer la destruction des lymphocytes T par les cellules apparentées chargées par l’antigène. K-A-A-P-C. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons rencontré des problèmes en travaillant sur le développement d’une cellule présentatrice d’antigène tueur à base de cellules alors que nous, en même temps, nous travaillons sur le développement d’une plate-forme basée sur le rythme. Pour générer d’abord K-A-A-P-C, ajoutez 250 microlitres de billes d’époxy d’un stock et 250 microlitres de tampon de borate fraîchement préparé dans un flacon en verre stérile à vis et à vis.

Placez le flacon sur un aimant pour laisser les billes adhérer au bout de deux minutes, aspirez le tampon et retirez le flacon de l’aimant. Lavez une fois les billes avec un autre millilitre de tampon alésage huit, puis mettez-les en suspension dans 550 microlitres de HLA A deux IG et anti-humain CD 95 MAB. Secouez doucement le flacon pour mélanger les billes avec les anticorps, puis incubez les billes sur un rotateur bout à bout à quatre degrés Celsius pendant 24 heures.

Le lendemain, faites tourner les billes pendant deux minutes à 300 G et à température ambiante et replacez le flacon sur l’aimant. Au bout de deux minutes, aspirez le tampon de chargement. Retirez le flacon de l’aimant et lavez les billes dans un millilitre de tampon de lavage en les secouant soigneusement.

Après le troisième lavage, faites pivoter le flacon dans un millilitre de tampon de lavage de billes fraîches pour bloquer tout site de liaison protéique résiduel. Le lendemain, faites tourner à nouveau les perles et replacez le flacon sur l’aimant. Au bout de deux minutes, aspirez le tampon de lavage.

Retirez le flacon de l’aimant et ajoutez un millilitre de PBS dans le KAPC. Pour vérifier la qualité des billes, transférez 1,5 fois 10 à la quinte du K-A-A-P-C dans un tube de fax et lavez-les avec un millilitre de tampon de lavage de fax Resus. Suspendre la pastille de bille dans 100 microlitres de tampon de lavage et ajouter un microlitre d’IgG anti-souris, un PE pour détecter le HLA A, deux IG et un microlitre d’IG ANTI SOURIS MFI TC pour détecter l’anti-humain CD 95 MAB.

Ensuite, après une incubation de 15 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les billes dans un millilitre de tampon de lavage de fax Resus. Suspendez-les dans 250 microlitres de tampon de lavage et lisez les échantillons sur un cytomètre en flux pour le chargement des peptides. Transférez deux fois 10 à la septième du K-A-A-P-C dans un nouveau flacon en verre stérile.

Ensuite, après avoir placé les billes sur l’aimant pendant deux minutes, aspirez le PBS et remettez les billes en suspension dans 500 microlitres de PBS frais contenant cinq microgrammes de peptide. Étiquetez le flacon avec la date et le nom du peptide chargé, K-A-A-P-C. Ensuite, stockez le K-A-A-P-C chargé à quatre degrés Celsius pendant au moins trois jours pour permettre une charge suffisante de peptides sur le HLA A à deux dimères IG pour effectuer un test de destruction in vitro A-K-A-A-P-C.

Lavez le PEPTIDIQUE K-A-A-P-C comme démontré au moins six fois pour éliminer tous les peptides libres. Ensuite, transférez K-A-A-P-C et deux fois 10 cellules T spécifiques de l’antigène cinquième dans un puits par échantillon d’une plaque à fond rond de 96 puits dans 200 microlitres de milieu de co-culture dans un rapport de un à un après 48 heures de culture dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Transférez les échantillons dans les tubes de télécopie correspondants appropriés et lavez-les dans un millilitre d’un tampon de liaison nexin five.

Ensuite, mettez les granulés en suspension dans 100 microlitres d’un tampon de liaison nexin five, puis incubez les échantillons dans un microlitre d’un FITC nexin five et cinq microlitres de seven a a d à température ambiante. Après 10 à 15 minutes, laver les échantillons avec un millilitre d’un tampon de liaison nexin five et remettre les granulés en suspension dans 250 microlitres d’un tampon de liaison nin five. Ensuite, lisez immédiatement les échantillons sur un cytomètre en flux.

K-A-A-P-C affiche HLA A deux IG et Antifa MAB en même temps, ce qui, par rapport aux approches cellulaires, n’est pas altéré par les efficacités de codage ou de transduction et peut être facilement modulé pendant la production. K-A-A-P-C sont capables d’appauvrir les lymphocytes T spécifiques de l’antigène in vitro lorsqu’ils sont chargés avec un peptide apparenté, tandis que non apparenté est chargé. K-A-A-P-C n’épuise pas les lymphocytes T, donc K-A-A-P-C induit l’apoptose des lymphocytes T d’une manière spécifique à l’antigène.

Par la suite, lorsque K-A-A-P-C sont utilisés pour la déplétion sélective de lymphocytes T spécifiques de l’antigène à partir d’un mélange de différentes spécificités de lymphocytes T uniquement, une cytotoxicité minimale s’échappe dans les lymphocytes T voisins. Ainsi, K-A-A-P-C représente un outil exquis pour la déplétion in vitro de l’antigène spécifique de l’antigène humain des cellules T spécifiques de l’antigène activé avec une applicabilité clinique potentielle pour le traitement des maladies auto-immunes et des rejets d’allogreffes après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie cellulaire pour explorer de nouvelles approches pour le traitement des maladies auto-immunes médiées par les lymphocytes T et des rejets de greffe.