Name: Tueur antigène artificielle cellules présentatrices (KaAPC) dutilisation efficace In Vitro Lépuisement des lymphocytes T humains spécifiques de lantigène (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Découvrez la génération de cellules présentatrices d'antigènes artificielles cytotoxiques (KaAPC) pour l'épuisement in vitro des lymphocytes T spécifiques d'antigènes humains. Cette méthode offre une approche ciblée pour le traitement des maladies auto-immunes.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) et KFO 146 (MF), le ministère de la Défense DOD subvention PC 040972 (MO) et l&#39;Institut national de la santé accorde RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)

1 Production de HLA-A2-Ig Based KaAPC <ol><li> Préparer le tampon de borate stérile. Ajouter une solution 0,1 M d'acide borique dans l'eau et ajuster le pH à 7,0. Filtre stérile (0,22 um) tampon et conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer le tampon de lavage des billes stérile. Utiliser une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium et magnésium. Ajouter sérum AB humain pour 3% de concentration finale. Ajouter de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 2 mM de concentration finale. Ajouter de l'azoture de sodium (NaN 3) pour une concentration finale de 0,01%. Filtre stérile (0,22 um) tampon et conserver à 4 ° C. </li><li> Transférer 250 ul de billes époxy (environ 100 x 10 6 billes) en stock dans un stérile, bouchon à vis du flacon de verre. </li><li> Ajouter 250 ul de tampon borate. </li><li> Mettez flacon de verre sur un aimant et laissez perles adhèrent pendant 2 min; tampon aspirer et enlever flacon en verre de l'aimant. </li><li> Lavez perles une fois avec 1 ml de tampon borate. </li><li> Remettre les billes dans 550 pl de 0,018 pg/ Ml HLA-A2-Ig et 3,64 pg / ml d'anticorps anti-CD95 humain mAb (clone CH11) et mélanger doucement en secouant. (S'il vous plaît voir la section de discussion pour plus d'informations.) </li><li> Incuber flacon en verre à une extrémité de la coiffe sur l'extrémité, à 4 ° C pendant 24 heures. </li><li> Isoler perles à 300 g pendant 2 min. </li><li> Placez flacon de verre sur un aimant pendant 2 minutes et aspirer la «solution de chargement KaAPC"; enlever flacon en verre de l'aimant, ajouter 1 ml de tampon de lavage de perles et remettre soigneusement en secouant. </li><li> Répétez l'étape deux fois 1,10. </li><li> Incuber flacon en verre sur un rotateur à 4 ° C pendant 24 h dans 1 ml de tampon de lavage des billes. A ce stade, tous les sites de liaison de protéines résiduel sera bloqué par du sérum AB humain contenu dans le tampon de lavage des billes. </li><li> Isoler perles à 300 g pendant 2 min. </li><li> Lieu flacon en verre sur un aimant pendant 2 minutes et aspirer tampon de lavage de perles; enlever flacon en verre à partir de l'aimant et de remplacer la solution avec 1 ml de PBS. </li></ol> 2 Contrôle de la qualité, le peptide en cours de chargement, Wincinération, stockage, et la stabilité de KaAPC <ol><li> Transférer 1,5 x 10 5 KaAPC dans un tube FACS et laver avec 1 ml FACS tampon de lavage. </li><li> Remettre les billes dans 100 pl de tampon de lavage FACS et ajouter 1 pl d'anti-IgG1 de souris PE (pour la détection de la partie Fc de la molécule HLA-A2-Ig) et 1 pi d'anticorps anti-IgM de souris FITC (clone R6-60.2, pour la détection de l'anticorps monoclonal anti-CD95 humain). </li><li> Incuber pendant 15 min à 4 ° C, laver avec 1 ml FACS tampon de lavage, et remettre en suspension dans 250 ul de tampon de lavage FACS et lire coloration par cytométrie en flux. </li></ol><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500"> Figure 1 QC tache d'un lot KaAPC fait comme indiqué dans la section de protocole. Coloration a été réalisée comme décrit dans la section 2 du protocole HLA-A2-Ig a été détectée en utilisant un anticorps anti-souris-IgG1 mAb PE, alors que l'anti-CD95 humain, (anti-Fas) a été détectée avec un anticorps anti-souris-FITC IgM mAb (voir protocole en soiction 2.2) (ligne bleue). Graphiques noirs pleins représentent billes vides colorées avec un anticorps anti-souris-PE IgG1 ou mAb anti-souris-FITC IgM mAb, respectivement. Numéros dans le coin supérieur droit indiquent l'intensité de fluorescence moyenne (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="4"><li> Pour peptide transfert de charge 20 x 10 6 KaAPC dans un nouveau flacon de verre stérile, placer sur un aimant pendant 2 minutes, aspirer PBS et remettre les billes dans 500 ul de PBS frais de 5 ug de peptide (Gardez à l'esprit, les peptides que HLA-A2 restreint sera lier sur le dimère!). </li><li> Magasin chargé KaAPC à 4 ° C jusqu'à l'utilisation, pendant au moins 3 jours pour donner suffisamment de peptide chargement sur le dimère HLA-A2-Ig. </li><li> Immédiatement avant utilisation, lavez le peptide chargé KaAPC comme indiqué dans 1.14; répétez cette étape au moins 6x. NOTE: Il s'agit d'une étape cruciale pour assurer que le peptide libre a to être complètement supprimé pour éviter les faux résultats positifs de mise à mort; peptide libre résiduel a été montré pour induire l'apoptose dans les cultures de cellules T antigène-spécifiques 9. Pour exclure un effet de peptide soluble, exécuter les échantillons de contrôle surnageant de peptide chargé et lavé KaAPC (voir 3.8). </li><li> Comptez perles en utilisant hémocytomètre et étiqueter avec la date, le nom de peptide et de la concentration. REMARQUE: Loaded KaAPC restent fonctionnelles à 4 ° C pendant au moins un mois. Après un mois, le rechargement avec le même peptide permet KaAPC à être utilisé pendant un an. </li></ol> 3. KaAPC Essai in vitro de tuer <ol><li> Préparez le support de co-culture. Préparer un milieu RPMI complet additionné de 3% de T facteur de croissance de cellules (fabriqué au laboratoire 6) donneur et 3% de plasma autologue. Si donneur de plasma autologue n'est pas disponible, utiliser du sérum humain AB inactivé par la chaleur. </li><li> Préparer la liaison préparation tampon AnnexinV. Dissoudre 8,12 g de chlorure de sodium (NaCl) et de 0,12 g calcchlorure de ium (CaCl 2) dans 990 ml ddH 2 O.Add 10 ml de tampon HEPES 1M. </li><li> Générer des cellules T spécifiques de l'antigène humain. (Pour un protocole détaillé s'il vous plaît voir une publication précédente 7 en utilisant des cellules présentatrices de l'antigène artificielles (VAMP)). Assurez-vous que la spécificité de peptide est au moins&gt; 75% tel que déterminé par tétramère coloration. </li><li> Pour chaque échantillon, incuber 2 x 10 5 cellules T spécifiques de l'antigène / puits (dans une plaque à 96 puits à fond rond) dans 200 ul de milieu de co-culture à un ratio de 1: 1 avec KaAPC pendant 48 heures dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Échantillons de récolte et transférer dans un tube FACS; laver avec 1 ml AnnexinV tampon de liaison, centrifuger à 300 g pendant 5 min, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 100 pi de tampon de liaison AnnexinV </li><li> échantillons de taches avec 1 pi AnnexinV FITC et 5 pi 7-AAD pendant 10-15 min à température ambiante, laver avec 1 ml de tampon de liaison AnnexinV; centrifuger à 300 g pendant 5 min, éliminer le surnageant uned remettre en suspension dans un tampon de liaison 250 pi AnnexinV </li><li> Lire immédiatement les échantillons sur cytomètre de flux. </li><li> Préparer les échantillons suivants pour déterminer la destruction spécifique de l'antigène par KaAPC: cellules T seulement; Lymphocytes T anti-CD95 + soluble; Cellules T + déchargés KaAPC; Cellules T + peptide non apparenté chargé KaAPC; Cellules T + peptide apparenté chargé KaAPC; T + surnageant de cellules peptide apparenté KaAPC chargé. </li></ol><img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500"> . Figure 2 KaAPC dosage tuant peptide chargé KaAPC ou des billes de commande (HLA-A2-Ig seulement perles) ont été cultivées pendant 48 heures à un rapport de 1: 1 avec des cellules CMVpp65 spécifiques de T (~ 80%), récolté et ensuite coloré avec du AnnexinV et l'iodure de propidium (PI) pour déterminer l'apoptose par cytométrie de flux (voir la section 3.3 à 3.7 du protocole). "apparenté" se réfère à des billes chargées de CMVpp65 et «non apparentée» pour êtreannonces chargés de Mart-1 peptide. Les chiffres indiquent le pourcentage de cellules T viables dans le quadrant inférieur gauche de chaque parcelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="9"><li> Pour effectuer les expériences s'entrecroisent-, générer des cellules T spécifiques de l'antigène de deux spécificités différentes. </li><li> En outre évaluer les capacités d'appauvrissement spécifique de l'antigène de KaAPC avec une analyse simultanée de l'élimination spécifique d'un antigène des cellules T dans la population hétérogène de cellules T. (Pour un protocole détaillé s'il vous plaît voir Schütz et al. 10). </li></ol>

<ol><li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li>
<li>Schütz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((artificial+antigen-presenting+cells%3A+the+synthetic+embodiment+of+a+%E2%80%9Cguided+missile%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a “guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li>
<li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+but+not+immature+Fas+ligand+%28CD95L%29-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), At 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12759415">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12759415</a> 5406-5413 (2003).</li>
<li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells+by+Fas+ligand+%28FasL%2FCD95L%29-expressing+Killer-dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li>
<li>Schütz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+%28CD95L%29-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li>
<li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li>
<li>Chiu, Y. -L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li>
<li>Schütz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+artificial+antigen-presenting+cells%3A+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li>
<li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li>
<li>Schütz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li>
<li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+letters%22%5BJournal%5D)">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li>
<li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+nanotechnology%2C+biology%2C+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li>
<li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+shape+dependence+of+CD8%2B+T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li>
</ol>

CS et MF n&#39;ont rien à divulguer. En vertu d&#39;un accord de licence entre NexImmune et de l&#39;Université Johns Hopkins, les Drs. Schneck et Oelke ont droit à des actions de la royauté reçues par l&#39;Université sur les ventes de produits AAPC décrites dans cet article. Ils possèdent également NexImmune actions, qui est soumise à certaines restrictions au titre de la politique de l&#39;Université. Dr Schneck est un membre de la société »du Conseil d&#39;administration et du conseil consultatif scientifique. Les termes de cet arrangement sont gérés par l&#39;Université Johns Hopkins, conformément à son conflit d&#39;intérêts politiques.

L'étape la plus critique dans le protocole est d'assurer le rapport approprié de signaux 1 (peptide CMH) et le signal 2 (anti-Fas mAb). Nous avons effectué des expériences de titrage intensifs à définir le rapport idéal pour le signal 1 et 2; il est devenu évident que des variations minimes en raison de différences dans le dimère HLA-A2 Ig ou concentrations des anti-Fas mAb peuvent interférer avec le fonctionnement du KaAPC. Ainsi, la concentration des deux signaux doit toujours être vérifiée et la qualité des deux protéines doit être testé fréquemment, même si il est ordonné à partir d'une source commerciale. En outre, les concentrations doivent toujours être déterminées par le même essai que différents tests de détection peut résulter en des concentrations différentes. La fonctionnalité de la molécule HLA-A2-Ig peut également être altérée en raison de repliement incomplètes et / ou inefficace peptide chargement. En outre molécules dimères peuvent agréger à des degrés divers, ce qui pourrait avoir un impact sur l'activité fonctionnelle de la protéine. Par conséquent, l'actual quantité de dimère nécessaire pour la génération d'un KaAPC fonctionnel spécifique et peut varier. En outre, nous avons constaté que la gamme idéale pour la mort de signal induisant anti-Fas mAb sur KaAPC est extrêmement serré. Dans nos mains quantités supérieures 3,64 pg / ml conduit à la destruction non spécifique des cellules T Fas positif alors que les montants ci-dessous 3,64 pg / ml ont abouti à une activité de destruction réduit la dose en fonction. Bien que ces conditions semblent assez serré, attention à ces détails se traduira par la création d'un KaAPC fonctionnelle et spécifique. Bien que le phénotype courant KaAPC est fonctionnel pour la déplétion des cellules T activées spécifiques de l'antigène, des expériences initiales ciblant les cellules T spécifiques de l'antigène ou naïves au repos démontré aucune induction significative de l'apoptose spécifique de l'antigène que ces populations ont réduit l'expression de Fas. Par conséquent, on pourrait envisager l'ajout d'un signal de co-stimulation sur le KaAPC pour induire la régulation à la hausse de Fas sur cellules T au repos pour faire tourner lesdans une cible pour la KaAPC. Même si cela est possible les trois signaux devront être titré soigneusement pour assurer un phénotype fonctionnel KaAPC. Réglage de la plate-forme de bourrelet à une matrice biocompatible ou biodégradable améliorera KaAPC en application vivo. Récemment, Shen et al. Ont rapporté le succès de l'utilisation in vivo de KaAPC utilisant des billes 5 um de latex conjuguées à l'anti-Fas (clone Jo2) et anti-His / H2-K b -TRP2 11. Nous avons pu montrer que le concept général de cellules présentatrices de l'antigène artificielles (AAPC) peut être transféré avec succès à partir um dimensionné pour des particules de taille nm 12 et que la fonctionnalité est influencé par la géométrie des particules 13. Ainsi, en faisant varier la taille et / ou la forme de la future KaAPC designs on peut être capable d'avoir un impact sur ​​la fonctionnalité in vivo et la bio-distribution, qui pourrait être essentiel pour la réussite du traitement de maladies auto-immunes spécifiques d'organes. <p class='"jove_content"&gt;' kaapc surmonter les principales faiblesses des strat d base de cellules comme un outil facile utiliser the shelf le temps et co approche efficace qui est ind l bailleurs fonds pr ne sont pas cibles soi ou signalisation meurtre paracrine sensible aux fonctions effectrices cytolytiques ctl. n la maladie concern compter sur leur type hla sp bien qu nombreux antig hla-a2 restreint appropri pour diab gvhd multiples scl ont identifi>2, le développement de plus HLA de classe I dimère molécules ainsi que l'identification permanente de nouveaux antigènes pertinents auto-immunes va encore accroître et d'élargir l'applicabilité de KaAPC. En outre on pourrait envisager d'utiliser KaAPC réalisé à différents épitopes de cibler des antigènes multiples simultanément. En résumé, KaAPC représentent une technologie de plate-forme flexible pour unespécifiques à Tigen de déplétion des lymphocytes T. Leur nature "lego-like" permet l'inclusion de nouveaux signaux tels que co-stimulation ou d'inhibition supplémentaires tels que PD1 ou TRAIL sur différentes matrices, ce qui pourrait élargir et d'améliorer leur ultérieure in vitro et in vivo applicabilité. Nous présentons ici le protocole étape par étape pour générer KaAPC, l'approche basée sur le premier bourrelet pour l'élimination des cellules T spécifiques de l'antigène à partir de mélanges de cellules T avec des spécificités différentes. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500"> Figure 3 KaAPC éliminer CTL d'une façon spécifique à l'antigène marqué PKH26 activé Fas + CTL effecteurs mémoire et PKH67 marqué CMVpp65 CTL spécifique du même donneur ont été mélangés à un rapport 1:. Rapport 1 et co-cultivées avec des CMVpp65 KaAPC pendant 48 h. Des cultures témoins ont été traitées avec KaAPC déchargé, ou 1 ug / mldes anti-Fas soluble-mAb (clone CH11). Une perte minimale de cellules viables a été déterminée dans des cultures de CTL mixtes non traités (T mix). Données de FACS originales pour chaque population de CTL du mélange T sont présentés. Analyse de l'apoptose a été effectuée comme précédemment publié par déclenchement séparé des deux populations de cellules T 10. Numbers représentées dans les quadrants supérieur gauche représente% du nombre total de cellules. La figure illustrant est dérivé d'une expérience représentative de trois expériences indépendantes. Cette recherche a été publié à l'origine dans le sang. . Schütz, C. et al tueur Les cellules présentatrices de l'antigène artificielles: une nouvelle stratégie pour supprimer les cellules T spécifiques de sang.. 2008; 111, 3546-52. Droit d'auteur de l'American Society of Hematology. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Au cours des deux dernières décennies, beaucoup de progrès ont été réalisés dans la compréhension des mécanismes pathogènes de maladies auto-immunes. Cependant, les traitements les plus courants comptent encore sur les corticostéroïdes, ainsi que des médicaments immunosuppresseurs tels que les analogues de la purine, des agents alkylants et des inhibiteurs de la calcineurine 1. L&#39;utilisation de ces médicaments a considérablement amélioré le pronostic des patients, mais le traitement ne fournit pas un remède du dysfonctionnement immunologique sous-jacente. En outre, les patients deviennent vulnérables aux infections et au développement d&#39;un cancer. Par conséquent, le but ultime pour le traitement de maladies auto-immunes de cellules T à médiation et le rejet d&#39;allogreffe est de cibler spécifiquement seulement les cellules T provoquant une maladie alors que, en même temps, laissant le système immunitaire restant intacte et compétente pour lutter contre les troubles immunologiques. En utilisant des cellules présentatrices d&#39;antigène (APC) comme un traitement pour supprimer les réponses de cellules T périphériques a été décrite pour la première dèsles années 1970 par plusieurs groupes. Depuis de nombreuses approches à base de cellules ont été développés (revue dans Schütz et al. 2). Stratégies utilisant FasL exprimant killer-APC que les cellules immunomodulatrices ont montré des résultats prometteurs indiquant un potentiel thérapeutique pour le traitement de l&#39;auto-immunité, le rejet d&#39;allogreffe et les infections chroniques. Cependant, il ya des limites importantes des stratégies utilisant FasL Killer-APC qui ont finalement limité leur applicabilité clinique; (I) la production ou l&#39;isolement d&#39;APC est temps, du travail et coûteux (ii) des patients atteints de cytopénie dû à une immunosuppression fournissent des quantités et de la qualité des cellules limitées (iii) le revêtement ou la transduction des APC avec les signaux induisant l&#39;apoptose tels que les résultats de FasL dans très phénotypes variables et (iv) Killer-APC sont sensibles à des fonctions effectrices cytotoxiques de lymphocytes T en réduisant par conséquent leur potentiel thérapeutique. Par conséquent, il est difficile de garantir une reproductibilité phéno Killer-APC définitype qui peut être utilisé pour la modulation spécifique de l&#39;antigène de réponses des lymphocytes T in vivo. Sur la base de nos travaux précédents avec FasL exprimer Killer-APC 3-5 et les cellules présentatrices de l&#39;antigène artificielles (AAPC) 6,7 nous avons développé une approche basée perles (KaAPC) pour l&#39;inhibition ou l&#39;élimination spécifique de l&#39;antigène des cellules T auto-réactifs dans vitro. KaAPC se composent d&#39;un dimère HLA-A2-Ig (signal 1) et un mAb anti-Fas (signal inducteur de l&#39;apoptose) immobilisé de manière covalente sur une surface d&#39;une perle paramagnétique 4,5 um de latex. Ils épuiser les cellules T spécifiques de l&#39;antigène de manière à médiation par Fas / FasL à partir de cultures de multiples spécificités de lymphocytes T de façon spécifique à l&#39;antigène et indépendant de l&#39;activation induite par la mort des cellules (AICD) voie. Dose apoptose dépendante dans les cellules T cibles est rapidement induite déjà après 30 min 8. KaAPC peut être facilement généré de manière contrôlée assurant un défini sur l&#39;étagère phenotype et de surmonter la plupart des lacunes des stratégies d&#39;épuisement à base de cellules. Par conséquent, KaAPC afficher un grand potentiel pour le traitement de maladies auto-immunes de lymphocytes T médiation et le rejet d&#39;allogreffe, faire progresser le domaine des stratégies de traitement de lymphocytes T spécifiques.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sérum AB humain</td><td>Atlanta biologiques</td><td>S40110</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>M-450 billes époxy</td><td>Invitrogen/Dynal</td><td>14011</td><td></td></tr><tr><td>MPC-1 aimant</td><td>Invitrogen/Dynal</td><td>12001D</td><td></td></tr><tr><td>Flacon en verre à vis</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338AA</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD95 (clone CH11)</td><td>Milliore</td><td>05-201</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A2-Ig dimère</td><td>BD/Pharmingen</td><td>551263</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-tube 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>anti-souris IgG1 PE</td><td>BD/ Pharmingen</td><td>559320</td><td></td></tr><tr><td>anti-souris IgM FITC</td><td>BD/Pharmingen</td><td>553408</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Merck</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de calcium Sigma/Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>cellgro/Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>gibco/life technologies</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>96 puits Rond plaque inférieure</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>AnnexinV FITC</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA577-1001-1000</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD/Pharmingen</td><td>51-68981E</td><td></td></tr><tr><td>Tubes FACS</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr></tbody></table>

tueur antigène artificielle cellules présentatrices (kaapc) d'utilisation efficace in vitro l'épuisement des lymphocytes t humains spécifiques de l'antigène

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Le traitement actuel de cellules T immunes médiées repose essentiellement sur les stratégies d&#39;immunosuppression globale, ce qui, à long terme, est accompagné par des effets secondaires indésirables comme une diminution de la capacité de lutter contre les infections ou les tumeurs malignes. Par conséquent, de nouvelles approches doivent être développées que les cellules cibles que la maladie de médiation et de laisser le système immunitaire reste intact. Au cours de la dernière décennie, une variété de stratégies d&#39;immunothérapie à base de cellules de moduler T à médiation cellulaire réponses immunitaires ont été développés. La plupart de ces approches reposent sur des cellules présentatrices d&#39;antigènes induisant une tolérance (APC). Cependant, en plus d&#39;être techniquement difficile et encombrant, de telles approches à base de cellules sont très sensibles aux réponses des cellules T cytotoxiques, ce qui limite leur capacité thérapeutique. Ici, nous présentons un protocole pour la génération de cellules présentatrices de l&#39;antigène artificielles tueuses non cellulaire (KaAPC), ce qui permet la déplétion des cellules T pathologiques tout en laissant la resystème immunitaire restant intact et fonctionnel. KaAPC est une solution alternative à l&#39;immunothérapie cellulaire qui a un potentiel pour le traitement de maladies auto-immunes et les rejets d&#39;allogreffes par la régulation des réponses des cellules T indésirables d&#39;une manière spécifique de l&#39;antigène.

Les caractéristiques de ce protocole comprennent la génération définie d&#39;un phénotype KaAPC qui affiche HLA-A2-Ig (signal 1) et anti-Fas mAb (signal d&#39;apoptose) en même temps, ce qui par rapport à des approches à base de cellules n&#39;est pas modifiée par revêtement ou des efficacités de transduction et peut être facilement modulés lors de la fabrication (figure 1). En outre, KaAPC, ne sont pas sensibles à des fonctions effectrices cytotoxiques des cellules T et leur fonction ne dépend pas de la qualité de cellules présentatrices d&#39;antigènes autologues avant et après la manipulation in vitro. KaAPC sont capables d&#39;épuiser les cellules T spécifiques de l&#39;antigène in vitro, lorsqu&#39;elles sont chargées avec le peptide apparenté, tandis que les non-apparenté chargé KaAPC sera pas épuiser les cellules T (figure 2). Par conséquent, KaAPC induire l&#39;apoptose des cellules T d&#39;une manière spécifique de l&#39;antigène. Par la suite, nous avons utilisé pour KaAPC déplétion sélective des cellules T spécifiques de l&#39;antigène à partir d&#39;un mélange de différents spe des lymphocytes Tcificities, démontrant que seule la cytotoxicité minimale fuyait dans les cellules voisines T (figure 3). Ainsi, KaAPC représentent un outil exquise pour déplétion in vitro spécifique d&#39;un antigène des cellules T spécifiques de l&#39;antigène humains activés par application clinique potentielle pour le traitement de maladies auto-immunes et les rejets d&#39;allogreffes.

Lignes directrices sont présentées pour la production de l&#39;antigène artificiel de tueur des cellules présentatrices, KaAPC, un outil efficace pour la déplétion in vitro de lymphocytes T spécifiques de l&#39;antigène humain et une solution alternative à l&#39;immunothérapie cellulaire pour le traitement de T maladies auto-immunes à médiation cellulaire à un antigène de façon spécifique sans compromettre le système immunitaire reste.

Tueur antigène artificielle cellules présentatrices (KaAPC) d'utilisation efficace In Vitro L'épuisement des lymphocytes T humains spécifiques de l'antigène

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

L’objectif global de cette expérience est de générer une cellule présentatrice d’antigène tueuse artificielle non cellulaire basée sur HLA IG, ou K-A-A-P-C pour l’épuisement des populations de cellules T autoréactives ou indésirables. Ceci est réalisé en liant d’abord de manière covalente les molécules HLA IG et les anticorps monoclonaux Antifa sur des particules de fer dextran de taille cellulaire pour la génération du K-A-A-P-C fonctionnel. Ensuite, les K-A-A-P-C sont chargés de différents peptides d’intérêt pour cibler la population de lymphocytes T spécifiques de l’antigène indésirable.En fin de compte, une analyse cytrique en flux peut être effectuée pour mesurer la destruction des lymphocytes T par les cellules apparentées chargées par l’antigène. K-A-A-P-C. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons rencontré des problèmes en travaillant sur le développement d’une cellule présentatrice d’antigène tueur à base de cellules alors que nous, en même temps, nous travaillons sur le développement d’une plate-forme basée sur le rythme. Pour générer d’abord K-A-A-P-C, ajoutez 250 microlitres de billes d’époxy d’un stock et 250 microlitres de tampon de borate fraîchement préparé dans un flacon en verre stérile à vis et à vis.Placez le flacon sur un aimant pour laisser les billes adhérer au bout de deux minutes, aspirez le tampon et retirez le flacon de l’aimant. Lavez une fois les billes avec un autre millilitre de tampon alésage huit, puis mettez-les en suspension dans 550 microlitres de HLA A deux IG et anti-humain CD 95 MAB. Secouez doucement le flacon pour mélanger les billes avec les anticorps, puis incubez les billes sur un rotateur bout à bout à quatre degrés Celsius pendant 24 heures.Le lendemain, faites tourner les billes pendant deux minutes à 300 G et à température ambiante et replacez le flacon sur l’aimant. Au bout de deux minutes, aspirez le tampon de chargement. Retirez le flacon de l’aimant et lavez les billes dans un millilitre de tampon de lavage en les secouant soigneusement.Après le troisième lavage, faites pivoter le flacon dans un millilitre de tampon de lavage de billes fraîches pour bloquer tout site de liaison protéique résiduel. Le lendemain, faites tourner à nouveau les perles et replacez le flacon sur l’aimant. Au bout de deux minutes, aspirez le tampon de lavage.Retirez le flacon de l’aimant et ajoutez un millilitre de PBS dans le KAPC. Pour vérifier la qualité des billes, transférez 1,5 fois 10 à la quinte du K-A-A-P-C dans un tube de fax et lavez-les avec un millilitre de tampon de lavage de fax Resus. Suspendre la pastille de bille dans 100 microlitres de tampon de lavage et ajouter un microlitre d’IgG anti-souris, un PE pour détecter le HLA A, deux IG et un microlitre d’IG ANTI SOURIS MFI TC pour détecter l’anti-humain CD 95 MAB.Ensuite, après une incubation de 15 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les billes dans un millilitre de tampon de lavage de fax Resus. Suspendez-les dans 250 microlitres de tampon de lavage et lisez les échantillons sur un cytomètre en flux pour le chargement des peptides. Transférez deux fois 10 à la septième du K-A-A-P-C dans un nouveau flacon en verre stérile.Ensuite, après avoir placé les billes sur l’aimant pendant deux minutes, aspirez le PBS et remettez les billes en suspension dans 500 microlitres de PBS frais contenant cinq microgrammes de peptide. Étiquetez le flacon avec la date et le nom du peptide chargé, K-A-A-P-C. Ensuite, stockez le K-A-A-P-C chargé à quatre degrés Celsius pendant au moins trois jours pour permettre une charge suffisante de peptides sur le HLA A à deux dimères IG pour effectuer un test de destruction in vitro A-K-A-A-P-C.Lavez le PEPTIDIQUE K-A-A-P-C comme démontré au moins six fois pour éliminer tous les peptides libres. Ensuite, transférez K-A-A-P-C et deux fois 10 cellules T spécifiques de l’antigène cinquième dans un puits par échantillon d’une plaque à fond rond de 96 puits dans 200 microlitres de milieu de co-culture dans un rapport de un à un après 48 heures de culture dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Transférez les échantillons dans les tubes de télécopie correspondants appropriés et lavez-les dans un millilitre d’un tampon de liaison nexin five.Ensuite, mettez les granulés en suspension dans 100 microlitres d’un tampon de liaison nexin five, puis incubez les échantillons dans un microlitre d’un FITC nexin five et cinq microlitres de seven a a d à température ambiante. Après 10 à 15 minutes, laver les échantillons avec un millilitre d’un tampon de liaison nexin five et remettre les granulés en suspension dans 250 microlitres d’un tampon de liaison nin five. Ensuite, lisez immédiatement les échantillons sur un cytomètre en flux.K-A-A-P-C affiche HLA A deux IG et Antifa MAB en même temps, ce qui, par rapport aux approches cellulaires, n’est pas altéré par les efficacités de codage ou de transduction et peut être facilement modulé pendant la production. K-A-A-P-C sont capables d’appauvrir les lymphocytes T spécifiques de l’antigène in vitro lorsqu’ils sont chargés avec un peptide apparenté, tandis que non apparenté est chargé. K-A-A-P-C n’épuise pas les lymphocytes T, donc K-A-A-P-C induit l’apoptose des lymphocytes T d’une manière spécifique à l’antigène.Par la suite, lorsque K-A-A-P-C sont utilisés pour la déplétion sélective de lymphocytes T spécifiques de l’antigène à partir d’un mélange de différentes spécificités de lymphocytes T uniquement, une cytotoxicité minimale s’échappe dans les lymphocytes T voisins. Ainsi, K-A-A-P-C représente un outil exquis pour la déplétion in vitro de l’antigène spécifique de l’antigène humain des cellules T spécifiques de l’antigène activé avec une applicabilité clinique potentielle pour le traitement des maladies auto-immunes et des rejets d’allogreffes après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie cellulaire pour explorer de nouvelles approches pour le traitement des maladies auto-immunes médiées par les lymphocytes T et des rejets de greffe.

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