Name: Activité de la télomérase dans les différentes régions du cerveau de souris: la télomérase non-radioactifs Répétition protocole damplification (TRAP) Dosage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Découvrez le dosage TRAP non radioactif pour mesurer l'activité de la télomérase dans les régions cérébrales de souris. Cette méthode efficace révèle les différences entre cerveaux masculins et féminins.

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Ce travail a été partiellement soutenu par la technologie B.G. Negev et la contribution de Linda Powers.

Les expérimentations animales ont été approuvés par le comité d&#39;éthique pour l&#39;expérimentation animale dans l&#39;Université Ben Gourion (IL-39-08-2010). Extraction de la protéine 1 de cerveau de souris <ol><li> Préparer 3 tubes de 15 ml contenant chacun 5 ml de solution et placer les tubes Ringer sur la glace. </li><li> Sacrifier la souris en utilisant l&#39;isoflurane (ATTENTION - utiliser hotte chimique) pendant 10-20 sec suivie par dislocation cervicale et décapitation immédiate. </li><li> Retirez le cerveau du crâne et de rincer pendant quelques secondes avec la solution de Ringer glacée pour éviter d&#39;endommager les tissus du cerveau. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une lame chirurgicale, séparer le cervelet (CR) et le tronc cérébral (BS) à partir du cortex frontal. Ensuite, séparer le cervelet du tronc cérébral et couper le lobe frontal (FL) du cortex frontal; supprimer le bulbe olfactif du lobe frontal. Placez les régions 3 du cerveau dans les désignés tubes de 15 ml. </li><li> Homogénéiser le tissu dans chaque tube. Ajouter frsolution glace chair froide Ringer sorte que chaque tube contient le même volume et centrifuger pendant 7 minutes à 800 x g. </li><li> Eliminer le surnageant et ajouter 100 ul de tampon de lyse CHAPS à chaque tube. Bien mélanger, en faisant passer plusieurs fois la solution (~ 10) à travers une seringue de 1 ml avec une aiguille 21 G, et laisser incuber sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Transférer le contenu de chaque tube dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse et centrifuger pendant 30 min à 13 000 x g. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse et déterminer la concentration de protéine en utilisant un procédé précédemment établi. Conserver les extraits de protéines dans des aliquotes de 10 pi à -80 ° C. </li></ol> 2. TRAP Essai Préparation des instruments, des solutions de réaction, et de protéines calculs de dilution <ol><li> Préparer nombre approprié de tubes de micro-centrifugation de protéines marquées pour des dilutions de l&#39;extrait et du tampon de réaction de télomérase. Effectuer toutes pipetage dans le protocole à l&#39;aide des conseils de filtrage pour éviter la contamination. </li&gt; <li> Décongeler les solutions suivantes sur glace: TRAP mélange réactionnel 10x, TS primaire, dNTP, extraits UPW et de protéines (voir tableau des matériaux pour les réactifs et réactifs concentrations). </li><li> Diluer la solution de l&#39;extrait de protéine à une concentration finale de 1 ug / ul avec de l&#39;eau ultra-pure (UPW). </li></ol> 3. télomérase Réaction <ol><li> Préparer la télomérase mélange réactionnel en ajoutant ce qui suit à un tube de micro-centrifugeuse: 2 pl TRAP mélange (10x), 1 pl TS primaire (0,1 ug), 1 dNTP pi (10 mm) et 15 pi UPW. Pour de multiples échantillons, multiplier les volumes mentionnés ci-dessus par le nombre d&#39;échantillons, plus 1. </li><li> Ajouter 19 ul du mélange réactionnel dans chaque tube de réaction et ajouter 1 pl de l&#39;extrait de protéine diluée (1 mg de protéines) à chaque tube pour un volume final de 20 ul. </li><li> Placer les tubes de réaction dans un bain d&#39;eau préchauffé à 30 ° C pendant 45 min. </li></ol> 4 La réaction PCR <ol><li> Quinze kmn avant la fin de la réaction de la télomérase, dégeler les solutions suivantes: ACX amorces, Titanium Taq tampons, UPW. </li><li> Préparer mélange réactionnel de PCR en ajoutant ce qui suit à un tube de micro-centrifugeuse: 2,5 pi titane Taq Buffer (10x), 1 pl ACX primaire (0,1 ug), 2 pl UPW (1 pi quand IC est utilisé) et 0,5 ul titane Taq polymérase (50x). Pour de multiples échantillons, multiplier les volumes mentionnés ci-dessus par le nombre d&#39;échantillons plus 2. </li><li> Ajouter 6 ul du mélange PCR dans chaque tube PCR et ajouter la totalité du volume de la réaction télomérase (20 pi) dans chaque tube pour un volume final de 26 ul. </li><li> Insérez les tubes PCR à un thermo cycleur PCR et exécuter le programme suivant: - 90 ° C - 2 min. - 94 ° C -. 30 sec * - 60 ° C -. 30 sec * - 72 ° C -. 45 sec * - 72 ° C - 2 min. Magasin de produits PCR à -20 ° C. * = 34 cycles </li></ol> 5 Agarose Mini-gel Préparation, échantillons Courir, et Gel coloration <ol><li> Ajouter 25 ml de tampon d&#39;électrophorèse frais (TBE) et une barre d&#39;agitation dans un bécher qui est 2-4 fois le volume de la solution tampon et saupoudrer lentement 1,125 g de la haute résolution (HR) de poudre d&#39;agarose alors que la solution est rapidement agité . Retirez la barre d&#39;agitation, couvrir le bécher avec un film plastique et percer dans un petit trou pour la ventilation. Chauffer le bécher dans le micro-ondes à puissance &quot;Low&quot; pendant 3 minutes, puis passer à la puissance &quot;High&quot; et chauffer la solution à impulsions courtes avec soin de ne pas causer de renverser. Notez que lorsque la mousse créée par chauffage devient grosses bulles et disparaît après quelques secondes, l&#39;agarose est prêt. </li><li> Couler le gel dans un appareil mini-gel horizontal, après que le gel se solidifie à température ambiante, le gel permet de refroidir pendant 20 min à 4 ° C avant utilisation. </li><li> Chargez chaque voie avec 25 ul d&#39;échantillon de TRAP (produits de PCR TRAP 20 pi et 5 pi 6x colorant gel-chargement) et de fonctionner à 110 V pendant 3 heures dans un 4 ° C chambre froide. </li><li> Préparer nucléiques 3x tache d&#39;acide solution de travail en ajoutant 15 pl 10.000 fois acide nucléique tache, solution stock à 50 ml Double Eau distillée (DDW) avec 0,1 M de NaCl (0,29 g). Colorer le gel pendant 20 min en remuant doucement. </li><li> Utilisez transilluminateur UV avec 302 nm de longueur d&#39;onde pour afficher les bandes d&#39;ADN TRAP échelle. </li></ol>

<ol><li>Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+telomerase+in+cell+senescence+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis.</a> Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).</li>
<li>Cong, Y., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+human+telomerase+beyond+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Actions of human telomerase beyond telomeres.</a> Cell Res. 18, 725-732 (2008).</li>
<li>Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTichon%2C+A+%22Curr.Mol.+Med%22">Curr.Mol. Med</a>. 13, 1010-1022 (2013).</li>
<li>Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+TERT+associates+to+RNA+granules+in+fully+mature+neurons%3A+Role+in+the+translational+control+of+the+cell+cycle+inhibitor+p15INK4B%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B.</a> PloS one. 8, e66602(2013).</li>
<li>De Jesus, B. B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+telomerase+activation+in+extending+health+span+and+logevity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential of telomerase activation in extending health span and logevity.</a> Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).</li>
<li>Blackburn, E., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase%3A+An+RNP+enzyme+synthesizes+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).</li>
<li>Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+telomerase+activity+and+TERT+expression+during+brain+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice.</a> J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).</li>
<li>Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+activity+in+the+subventricular+zone+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice.</a> Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).</li>
<li>Eitan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Telomerase-increasing+compound+in+mouse+brain+delays+the+onset+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis.</a> EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).</li>
<li>Kim, N. W., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantification+and+characterization+of+telomerase+activity+by+the+telomeric+repat+amplification+protocol+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP).</a> Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Analyse de l&#39;activité de la télomérase dans le cerveau de la souris par le test TRAP est constitué de quatre étapes principales: 1) l&#39;extraction des protéines à partir de régions spécifiques du tissu cérébral 2) TS élongation d&#39;amorce par la télomérase - réaction télomérase 3) l&#39;amplification des produits de la réaction de télomérase par PCR 4 ) séparation des produits de PCR en utilisant un gel d&#39;agarose de haute résolution. Ce test TRAP modifié répond à deux grandes dif...

La télomérase est une ribonucléoprotéine composé de télomérase transcriptase inverse (TERT), la sous-unité catalytique de la télomérase, et un composant d&#39;ARN (TERC). Le rôle canonique de la télomérase est de préserver la bonne longueur des télomères en ajoutant des séquences répétitives (TTAGGG) aux extrémités télomériques, favorisant ainsi l&#39;intégrité du génome, et une prolifération cellulaire. Autres rôles ont été attribués à TERT dans les cellules, c&#39;est à dire qu&#39;il confère une résistance à l&#39;apoptose induite par divers agent endommageant 2, protège les cellules souches mésenchymateuses humaines du stress oxydatif 3, et joue un rôle pro-survie dans les neurones complètement différenciées par son association à TIA1 ARN positif 4 granules. TERT et est exprimé principalement actif dans les cellules somatiques et de division dans la plupart des types de cancers, alors que les niveaux d&#39;expression et l&#39;activité enzymatique sont étroitement régulés dans les cellules ne se divisant pas 5,6. Des études ont montré que dans le rcerveau Odent, l&#39;activité de la télomérase devient indétectable par jour postnatal 10, tandis que TERT ARNm est maintenue à des niveaux inférieurs à l&#39;âge adulte 7. D&#39;autres études ont démontré l&#39;activité télomérase à l&#39;intérieur de la zone sous-ventriculaire adulte, le bulbe olfactif, l&#39;hippocampe et dans le cervelet et le cortex adulte 8. Nous avons récemment démontré que les nouveaux composés qui augmentent l&#39;expression et l&#39;activité de la télomérase dans le cerveau et la moelle épinière des cordons exercent des effets neuroprotecteurs de la N-méthyl-D-aspartate (NMDA) - souris injectées, ont retardé l&#39;apparition et la progression de la maladie de sclérose latérale amyotrophique dans SOD1 transgénique souris et augmente la survie des motoneurones dans la moelle épinière de ces souris 9. Pour bien comprendre le rôle pro-survie de la télomérase dans les neurones et dans le cerveau, il est essentiel de développer un test rapide simple et relativement sensible pour la détection de l&#39;activité de la télomérase dans les différentes régions du cerveau. Le télomérique rprotocole d&#39;amplification épéter (TRAP) est un essai sensible bien connu combinant l&#39;activité de la télomérase canonique et la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Dans cet essai, la télomérase ajoute TTAGGG répète sur un substrat de la télomérase (TS amorce) oligonucléotide, suivie d&#39;une amplification PCR qui génère des 6 paires de bases (pb) échelle d&#39;ADN à l&#39;aide du TS amorce inverse -. ACX marqué au 32P dCTP son sont utilisés pour détecter le faible quantité de produits de PCR. L&#39;échelle d&#39;ADN est résolu par électrophorèse sur gel de séquençage de Polyacrylamide (PAGE). Tant l&#39;intensité des bandes d&#39;ADN et la longueur de l&#39;échelle d&#39;ADN reflètent la quantité de molécules d&#39;enzymes actives et leur aptitude à la maturation, respectivement 10. Cette analyse traditionnelle détient des difficultés majeures: Le danger de l&#39;exposition à des substances radioactives, de grandes et difficiles à gérer séquençage PAGE et la consommation de temps de gel fonctionnement et l&#39;exposition du film du produit radioactif (nuit dans les deux cas). </p&gt; Ce protocole offre un test d&#39;agarose non radioactif amélioration mini-gel à base. Le pb échelle ADN 6 est résolu en utilisant un gel à 4,5% d&#39;agarose à haute résolution et la détection est réalisée en utilisant très sensible aux taches d&#39;acide nucléique. La combinaison de l&#39;utilisation à haute résolution d&#39;agarose des mini-gel et sensible aux taches d&#39;acide nucléique propose dosage facile à manipuler, permet d&#39;éliminer le risque d&#39;exposition à la radioactivité et de raccourcir considérablement la durée totale de l&#39;essai de 3 jours à plusieurs heures.

<table><tbody><tr><td>TRAP Mix (10x)</td><td></td><td></td><td>Fabriqué manuellement, mélangez les éléments suivants dans UPW : 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8,2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0,5 % TWEEN (acheté chez Sigma). Les aliquotes sont congelées à -20 °C.</td></tr><tr>Solution <td></td><td></td><td>de Ringer</td><td>Fabriquée manuellement, mélangez les éléments suivants dans DDW : 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4&middot ; H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,802 g/L de D-(+)-glucose anhydre.</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Minrad INC.</td><td>NDC 60307-110-10</td><td>Manipuler avec précaution dans un capot chimique</td></tr><tr><td>dNTPs (10 mM)</td><td>Amorce Sigma</td><td>D7295</td><td></td></tr><tr><td>TS (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')Oligos d’ADN</td> <td>Sigma</td><td></td><td>commandés au format DRY et UPW ajoutés selon la concentration requise</td></tr><tr><td>Amorce ACX (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3')</td>Oligos d’ADN <td>Sigma</td><td></td><td>commandés au format DRY et UPW ajoutés selon les besoins concentration</td></tr><tr><td>Titane Taq Polymérase/Tampon</td><td>Clontech</td><td>S1792/S1793</td><td></td></tr><tr><td>Agarose haute résolution</td><td>Sigma</td><td>A4718</td><td>Toute agarose haute résolution de haute qualité peut être sutible</td></tr><tr><td>Appareil mini-gel</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4466</td><td></td></tr><tr><td>Teinture d’acide nucléique (GEL-RED)</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Amorce IC (5'-ATCGCTTCTCTCGGCCTTTT-3')</td> Oligos d’ADN <td>Sigma</td><td></td><td>commandés au format DRY et UPW ajoutés en fonction de la concentration requise</td></tr><tr><td>Tampon de lyse CHAPS</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>9852S</td><td>Ajouter PMSF (inhibiteur de protéase) à une concentration finale de 1 mM</td></tr><tr><td>d’eau ultra pure (UPW)</td><td>Biological Industries</td><td>01-866-1B</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 souris</td><td>HARLAN Laboratories INC.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

activité de la télomérase dans les différentes régions du cerveau de souris: la télomérase non-radioactifs répétition protocole d&#39;amplification (trap) dosage

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

La télomérase, une ribonucléoprotéique, est responsable du maintien de la longueur des télomères et donc la promotion de l&#39;intégrité génomique, la prolifération et la durée de vie. En outre, la télomérase protège les mitochondries de stress oxydatif et confère une résistance à l&#39;apoptose, ce qui suggère son importance possible pour le survivant de non-mitotique des cellules hautement actifs tels que les neurones. Nous avons démontré précédemment la possibilité de nouveaux activateurs de la télomérase pour augmenter l&#39;activité de la télomérase et d&#39;expression dans les diverses régions du cerveau de la souris et pour protéger les cellules des neurones moteurs du stress oxydatif. Ces résultats renforcent l&#39;idée que la télomérase est impliqué dans la protection des neurones à partir de diverses lésions. Pour souligner le rôle de la télomérase dans le cerveau, nous comparons ici l&#39;activité de la télomérase dans le cerveau mâle et femelle souris et sa dépendance à l&#39;âge. test TRAP est un procédé standard pour la détection de l&#39;activité de la télomérase dans différents tissus ou lignées cellulaires. Ici, nous démontrons l&#39;analysis de l&#39;activité télomérase dans les trois régions du cerveau de souris non dénaturant par extraction de protéines à l&#39;aide de CHAPS tampon de lyse suivi d&#39;une modification de la méthode TRAP standard. Dans cet essai, deux étapes, la télomérase endogène s&#39;allonge un substrat spécifique de la télomérase (TS d&#39;amorce) en ajoutant 6 répétitions TTAGGG pb (réaction de télomérase). Les produits de la réaction de télomérase sont amplifiés par réaction de PCR créer une échelle d&#39;ADN de six incréments de pb. L&#39;analyse de l&#39;échelle de l&#39;ADN est effectué par 4,5% en haute résolution électrophorèse sur gel d&#39;agarose suivie par une coloration avec très sensible aux taches d&#39;acide nucléique. Par rapport à la méthode TRAP traditionnels qui utilisent marqué au 32P radioactif dCTP de la détection de l&#39;ADN et de polyacrylamide électrophorèse sur gel de résolution de l&#39;échelle de l&#39;ADN, ce protocole offre un gain de test TRAP pour évaluer l&#39;activité de la télomérase dans le cerveau de la souris, ce qui démontre la capacité de temps de non-toxique détecter des différences dans telomerasl&#39;activité dans les différents e région du cerveau de la souris mâle et femelle.

Des extraits protéiques de cellules entières ont été préparés à partir du lobe frontal (FL), le tronc cérébral (BS) et le cervelet (CR), dérivé de la femelle et 3 souris CD-1 mâles de 3 1 CD aux âges de 1 et 3 mois pour l' test TRAP modifié et 3 souris CD-1 mâles à l'âge de 2 mois pour le test TRAP radioactifs. L'activité de télomérase a été détectée dans une ug de protéines extrait en utilisant le test TRAP à jour et 2 mg de protéines pour extraire le test TRAP radioactif. Détection de l'activité de la télomérase par l...

télomérase est exprimée dans le cerveau néonatal et également dans des régions distinctes du cerveau adulte. Nous présentons un test TRAP non toxique permettant de gagner du temps pour l’analyse de l’activité de la télomérase dans diverses régions du cerveau de la souris et la détection des différences d’activité de la télomérase entre les cerveaux des souris mâles et femelles.

Activité de la télomérase dans les différentes régions du cerveau de souris: la télomérase non-radioactifs Répétition protocole d&#39;amplification (TRAP) Dosage

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

L’objectif global de cette procédure est de mesurer l’activité de la télomérase dans le tissu cérébral normal. Ceci est accompli en préparant d’abord des extraits de protéines de cellules entières à partir de divers tissus cérébraux comme source d’une enzyme télomérase active. La deuxième étape consiste à ajouter des quantités équivalentes d’extraits de protéines à un mélange réactionnel spécifique de télomérase contenant le substrat et les nucléotides nécessaires à l’activité de la télomérase.Ensuite, les produits de réaction de la télomérase sont amplifiés par PCR et analysés par électrophorèse sur gel aros haute résolution. La dernière étape consiste à visualiser les produits de réaction de la télomérase amplifiée en colorant le gel aros avec un agent de coloration de l’ADN très sensible. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme un test de piège radioactif ou des kits de test de piège commerciaux, est que ce protocole offre une alternative relativement efficace en termes de temps et de coût.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’activité de milliers de tissus cérébraux, elle peut également être appliquée à tout autre tissu vivant ou culture cellulaire. Avant de commencer cette procédure, préparez trois tubes de 15 millilitres contenant chacun cinq millilitres de solution de sonnerie. Placez les tubes sur de la glace après avoir retiré le cerveau d’une souris euthanasiée.Rincez le cerveau pendant quelques secondes avec une solution de sonnerie glacée pour éviter d’endommager les tissus cérébraux. À l’aide d’une lame chirurgicale, séparez le cervelet et le tronc cérébral du cortex frontal. Ensuite, séparez le cervelet du tronc cérébral.Retirez le bulbe olfactif du lobe frontal et coupez le lobe frontal du cortex frontal. Placez les trois régions du cerveau dans les tubes de 15 millilitres désignés, homogénéisez le tissu dans chaque tube. Ensuite, ajoutez une solution de sonnerie fraîche et glacée de sorte que chaque tube contienne le même volume et centrifugez pendant sept minutes à 800 fois G, retirez le surnageant et ajoutez 100 microlitres de tranches de chap.Tampon à chaque tube. Bien mélanger en passant la solution environ 10 fois dans une seringue d’un millilitre avec une nouille de calibre 21 incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Après 30 minutes, transférez le contenu de chaque tube dans un nouveau micro-tube de centrifugation et centrifugez pendant 30 minutes.À 13 000 fois, G, transférez le supinate dans un nouveau microtube à centrifuger. Après avoir déterminé la concentration en protéines à l’aide d’une méthode préalablement établie, stockez les extraits de protéines dans des aliquotes de 10 microlitres à moins 80 degrés Celsius. Commencez cette partie du protocole en préparant le nombre approprié de microtubes à centrifuger marqués pour les dilutions de l’extrait de protéine et le tampon de réaction de la télomérase pour les solutions suivantes sur glace.10 x Trap Reaction Mix DS Primer dn tps, l’eau ultrapure et les extraits de protéines diluent la solution de l’extrait de protéines à une concentration finale d’un microgramme par microlitre. À l’aide d’eau ultrapure, effectuez tous les pipetages à l’aide d’embouts filtrants pour éviter la contamination ou la réaction des télomères. Chaque échantillon nécessite un mélange réactionnel de télomères composé de deux microlitres de mélange de piège, d’un microlitre d’amorce TS, d’un microlitre de DN NTP et de 15 microlitres d’eau ultrapure pour plusieurs échantillons.Multipliez ces volumes par le nombre d’échantillons plus un, ajoutez 19 microlitres de mélange réactionnel MASE dans chaque tube réactionnel, suivi d’un microlitre d’extrait protéique dilué. Pour un volume final de 20 microlitres, placez les tubes de réaction dans un bain-marie préchauffé à 30 degrés Celsius pendant 45 minutes. 15 minutes avant la fin de la réaction des trois réactions, préparez-vous à l’amplification des produits de réaction en hachant les solutions suivantes, une amorce CX, un tampon d’adhérence en titane et de l’eau ultrapure.Chaque échantillon nécessite un mélange de réaction PCR composé de 2,5 microlitres de tampon technique de titane, d’un microlitre d’amorce CX, de deux microlitres d’eau ultrapure et de 0,5 microlitre de titane tech polymérase pour plusieurs échantillons. Multipliez ces volumes par le nombre d’échantillons plus deux. Ajoutez six microlitres du mélange de réaction PCR dans chaque tube PCR et ajoutez le volume entier avec la réaction mase dans chaque tube.Pour un volume final de 26 microlitres, insérez les tubes PCR dans un thermocycleur PCR et exécutez le programme suivant, 90 degrés Celsius pendant deux minutes, suivi de 34 cycles de 94 degrés Celsius pendant 30 secondes, 60 degrés Celsius pendant 30 secondes et 72 degrés Celsius pendant 45 secondes. Et deux dernières minutes à 72 degrés Celsius.Une fois la réaction PCR terminée, stockez les produits PCR à moins 20 degrés Celsius. Pour préparer les roses d’œufs à couler le mini gel en premier, ajoutez 25 millilitres de tampon d’électrophorèse TBE réfrigéré et un pain d’agitation dans un bécher de deux à quatre fois le volume de la solution tampon et commencez à agiter. Saupoudrez ensuite lentement 1,125 gramme de poudre aros haute résolution.Pendant que la solution s’agite rapidement, retirez la barre étoile. Couvrez le bécher d’une pellicule plastique et percez un petit trou pour la ventilation. Lors de la frappe de l’agros, il est essentiel d’atteindre le point d’ébullition pour dissoudre complètement l’agros.Assurez-vous d’accorder toute votre attention au bécher au micro-ondes pour vous assurer que la mousse générée ne débordera pas. Chauffez le bécher au micro-ondes à faible puissance pendant trois minutes, puis passez à puissance élevée et chauffez la solution par impulsions courtes en prenant soin d’éviter de renverser. Coulez le gel dans un mini appareil de gel horizontal et laissez-le se solidifier à température ambiante Une fois que le gel s’est solidifié, le gel pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.Avant l’utilisation pour l’électrophorèse, chargez chaque voie avec 25 microlitres d’échantillon de piège et faites fonctionner à 110 volts pendant trois heures dans une chambre froide à quatre degrés Celsius pendant que le gel coule. Préparez une solution de travail de trois colorants d’acide nucléique en ajoutant 15 microlitres de 10 000 de solution mère de colorant d’acide nucléique à 50 millilitres d’eau distillée double avec 0,1 molaire de chlorure de sodium. Lorsque l’électrophorèse des échantillons est terminée, colorez le gel pendant 20 minutes à température ambiante en le secouant doucement.Enfin, utilisez un illuminateur UV trans d’une longueur d’onde de 302 nanomètres. Pour voir l’échelle du piège, l’activité des télomères des bandes d’ADN a été détectée dans des régions du cerveau de la souris par les tests de piège traditionnels et modifiés. Une meilleure visualisation et résolution des produits d’ADN des télomères a été observée avec le test modifié, comme en témoignent la longueur et l’intensité de l’échelle d’ADN.Une réduction progressive des produits de l’ADN des télomères a été observée lorsque des concentrations décroissantes d’extraits de protéines ont été utilisées dans l’essai de piège modifié, ce qui suggère sa sensibilité pour la détection de l’activité des télomères à des concentrations plus faibles de protéines, la détection de l’activité de la télomérase par l’essai modifié dans trois régions du cerveau de souris femelles et mâles âgées d’un mois n’a montré aucune différence significative. Cependant, chez les souris âgées de trois mois, une activité télomérase plus élevée est montrée dans le lobe frontal et le tronc cérébral par rapport au cervelet, comme le révèlent l’intensité des bandes d’ADN et la longueur de l’échelle des produits de l’ADN. Au cours de la transition de la souris vers l’âge adulte, l’activité de Thoma Ray augmente dans le lobe frontal et diminue dans le tronc cérébral et le cervelet.L’activité des télomères semble également être plus élevée dans le lobe frontal chez les femelles. Contrairement à l’activité plus élevée des télomères dans le tronc cérébral et le cervelet chez les hommes, une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six à sept heures si elle est exécutée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer facilement l’activité de thoma dans le tissu de votre choix.

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Le EpiMark 5-HMC et le kit d'analyse 5-MC peut être utilisé pour analyser et quantifier 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine au sein d'un locus de SPE spécifiques. Le kit distingue 5-MC à partir de 5-HMC par l'ajout de glucose pour le groupe hydroxyle de 5-HMC via une réaction enzymatique utilisant β-glucosyltransférase (T4-TBG). Lorsque 5-HMC survient dans le contexte de la CCBG, cette modification convertit un site clivable Mspl à un site non clivable.

Haute Sensibilité 5-hydroxyméthylcytosine détection dans le tissu cérébral des souris Balb / C

Une méthode précise, courte, sophistiqué et pas cher est décrit qui évalue la longueur des télomères dans de nombreux tissus et les espèces à l'aide de qRT-PCR. En outre, nous allons décrire un test simple pour évaluer l'activité de la télomérase comme un test de la colonne vertébrale complémentaire pour la longueur des télomères.

La longueur des télomères et de la télomérase activité; Une Yin et Yang de la sénescence cellulaire

Nous décrivons les procédures pour l'étiquetage et le génotypage des souris nouveau-nés et de générer des cultures de neurones primaires d'eux. Le génotypage est rapide, efficace et fiable, et permet pour l'extraction de l'acide nucléique automatisé. Ceci est particulièrement utile pour les souris néonatale létales et leurs cultures qui nécessitent l'achèvement préalable de génotypage.

Rapid génotypage des animaux Suivi par Établir des cultures primaires de neurones du cerveau

télomère et la télomérase jouent un rôle essentiel dans le vieillissement et la tumorigenèse. L’objectif de ce protocole est de montrer comment générer deux allèles knock-in de télomérase inductibles chez la souris et comment les utiliser dans les études de dégénérescence/régénération tissulaire et de cancer.

Utilisant murin inductible télomérase allèles dans les études de la dégénérescence des tissus / Régénération et cancer

ARN L’hybridation in situ (ISH) permet de visualiser les ARN dans les cellules et les tissus. Nous montrons ici comment la combinaison de l’ARNASCOPE ISH avec l’immunohistochimie ou les colorants histologiques peut être utilisée avec succès pour détecter les ARNm localisés aux axones dans des sections de cerveaux de souris et d’humains.

Détection de axonaux localisée ARNm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation

La transcriptase inverse de la télomérase humaine (TERT) synthétise non seulement l’ADN télomérique, mais aussi l’ARN bicaténaire par l’activité de l’ARN polymérase ARN-dépendante. Nous décrivons ici un essai nouvellement créé pour détecter l’activité de l’ARN polymérase ARN-dépendante du TERT endogène.

Détection semi-quantitative de l’activité de l’ARN polymérase ARN-dépendante de protéine de Transcriptase inverse de la télomérase humaine

Nous présentons ici un protocole visant à générer des clones de cellules de cancer contenant une balise de séquence MS2 à un subtélomère unique. Cette approche, en s’appuyant sur le système de MS2-GFP, permet la visualisation des transcriptions endogènes de télomérique répétition contenant RNA (TERRA) exprimée à partir d’un seul télomères dans les cellules vivantes.

Génération de Clones de cellules de Cancer de visualiser contenant répétition télomérique RNA TERRA exprimée à partir d’un seul télomères dans les cellules vivantes

Ici, nous décrivons un protocole pour générer un modèle de murin femelle viable avec l’inactivation non aléatoire de chromosome x, c.-à-d. le chromosome x maternellement hérité est inactif dans 100% des cellules. Nous décrivons également un protocole pour tester la faisabilité, la tolérabilité et la sécurité de la réactivation pharmacologique du chromosome X inactif in vivo.

Un modèle de souris non aléatoire pour la réactivation pharmacologique de Mecp2 sur le chromosome X inactif

Nous avons réussi à convertir le test de protocole d’amplification de télomère standard (TRAP) pour être utilisé dans les réactions en chaîne de la polymérase numérique des gouttelettes. Ce nouveau dosage, appelé ddTRAP, est plus sensible et quantitatif, ce qui permet une meilleure détection et analyse statistique de l’activité de la télomérase dans diverses cellules humaines.

PIÈGE numérique de gouttelettes (ddTRAP): adaptation du protocole de répétition d’amplification de télomère à la réaction en chaîne de la polymérase numérique des gouttelettes

La capacité de marquer de façon permanente les cellules souches et leur descendance avec un fluorophore à l’aide d’une lignée transgénique inductible traçant la lignée de souris permet une analyse spatiale et temporelle de l’activation, de la prolifération, de la migration et / ou de la différenciation in vivo. Le traçage de la lignée peut révéler de nouvelles informations sur l’engagement de la lignée, la réponse aux interventions et la multipotence.

Traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte

Découvrez le dosage TRAP non radioactif pour mesurer l'activité de la télomérase dans les régions cérébrales de souris. Cette méthode efficace révèle les différences entre cerveaux masculins et féminins.

Activité de la télomérase dans les différentes régions du cerveau de souris: la télomérase non-radioactifs Répétition protocole damplification (TRAP) Dosage (Vidéo) | JoVE Journal

Activité de la télomérase dans les différentes régions du cerveau de souris: la télomérase non-radioactifs Répétition protocole d'amplification (TRAP) Dosage

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