Fond plat Plateforme Air-levée: Une nouvelle méthode pour combiner Comportement avec la microscopie ou électrophysiologie sur Awake Rongeurs déplacer librement

Bonjour, je suis Hel Lin, étudiant de troisième cycle au Near Science Center de l’université d’Helsinki. Aujourd’hui, mes collègues et moi allons vous montrer comment effectuer des enregistrements optiques et électrophysiologiques dans la tête éveillée, mais autrement en mouvement libre et se comporter avec des animaux. Notre méthode crée un environnement tangible et familier pour que la souris puisse naviguer et explorer.

Lors d’une imagerie microscopique ou d’enregistrements électrophysiologiques sur cellule unique, qui nécessitent une fixation ferme de la tête de l’animal, nous implantons une fenêtre crânienne chronique et habituons la souris à une cage de maison mobile aéroportée, qui glisse sous les pieds de l’animal. Lors de la locomotion sur une surface plane, la cage de la maison mobile peut être positionnée sous un microscope vertical standard pour l’imagerie à deux photons ou placée dans un dispositif d’électrophysiologie pour des enregistrements par patch clamp dans le cerveau d’une souris éveillée. Toutes les procédures expérimentales présentées ici ont été approuvées par le comité d’éthique local.

Nous implantons des fenêtres crâniennes selon les protocoles publiés avec des modifications mineures lors de l’implantation de fenêtres crâniennes. L’animal est autorisé à récupérer pendant au moins deux ou trois semaines pendant cette période de récupération, la fenêtre retrouve normalement sa transparence. Les animaux présentant des signes d’inflammation postopératoire résiduelle sont exclus des expériences.

Entraînez les animaux sélectionnés pour une étude à les habituer à la fixation de la tête. Dans la cage de la maison mobile, manipulez la souris calmement pendant cinq à 10 minutes, en évitant les mouvements brusques et les bruits, puis remettez-la dans la cage de la maison. Répétez la procédure deux ou trois fois à intervalles inégaux.

La cage de maison mobile permet une fixation de la tête sans anesthésier l’animal avant la fixation de la tête. Utilisez un chiffon pour envelopper la souris deux ou trois fois à intervalles inégaux. Assurez-vous que l’animal reste calme lorsqu’il est enveloppé.

Sinon, répétez la procédure jusqu’à ce que la souris s’y habitue complètement. Commencez l’entraînement deux fois par jour des souris sur la cage de la maison mobile le lendemain de la fin de la manipulation. Pesez les animaux avant chaque séance d’entraînement.

Les animaux présentant une perte de poids supérieure à 10 % doivent être exclus de l’étude. Ajustez la position du bras de fixation de la tête pour qu’elle corresponde à la taille de l’animal dressé. Connectez l’entrée d’air de la cage de la maison mobile à la sortie d’air sous pression standard du laboratoire.

Assurez-vous que la pression de l’air est suffisante pour la flottaison libre de la cage domestique transportée par avion. Commencer l’entraînement des animaux habitués dans la cage de la maison mobile. Immobilisez la souris en l’enveloppant dans le chiffon.

Insérez le support métallique fixé à la tête de l’animal dans le bras de fixation de la tête et fixez-le fermement en serrant les vis. Activez le flux d’air pour faire léviter la cage d’accueil aéroportée. Retirez le chiffon et laissez la souris explorer la cage de la maison.

Au cours de la première séance d’entraînement, les souris peuvent présenter un comportement de gel et de tremblement et une érection de la queue. Pour habituer l’animal au bruit, assurez-vous d’une exposition constante aux sons ambiants en utilisant, par exemple, une traduction radio ou de la musique et des paroles enregistrées pendant toutes les séances d’entraînement ainsi que pendant les expériences. Pour éviter le stress chronique, utilisez un éclairage à lumière vive pendant la première heure de la séance d’entraînement.

Après la première heure, effectuez l’entraînement dans l’obscurité et utilisez une caméra proche infrarouge pour surveiller le comportement de l’animal. Lorsque la séance d’entraînement est terminée, libérez l’animal du bras de fixation de la tête en perdant les vis. Retournez l’animal dans la cage de la maison pendant au moins deux heures avant la prochaine séance d’entraînement.

Garder la souris dans une cage avec deux autres souris ou plus réduira le niveau de stress. En option, vous pouvez placer la cage transportée par avion avec l’animal dans sa cage d’origine. Cela enrichira l’environnement et pourra renforcer l’habitation de l’animal à la cage de la maison mobile.

Au cours de la dernière séance d’entraînement, les souris sont habituées à la fixation de la tête et doivent présenter un comportement sans stress en naviguant calmement autour de la cage domestique transportée par avion. En l’absence de lumière visible, la trajectoire de la locomotion de la souris peut être suivie en surveillant les mouvements de la cage avec une caméra proche infrarouge ou avec une souris d’ordinateur optique. Lors de séances d’entraînement prolongées qui durent plus d’une ou deux heures, envisagez de fournir de l’eau potable à la souris, soit manuellement, soit à l’aide d’un porte-pipette fixé au cadre de la cage de la maison mobile.

Le diagramme suivant résume la chronologie d’une étude expérimentale typique. L’étude commence par l’implantation de la fenêtre crânienne deux semaines avant la manipulation des souris et se poursuit par huit séances d’entraînement deux fois par jour. L’étude typique comprend un certain nombre de séances d’imagerie ou de séances d’enregistrement par patch clamp espacées de quelques heures à plusieurs jours ou semaines.

Des expériences optiques et électrophysiologiques peuvent être réalisées en parallèle avec des stimuli et des lectures cognitifs ou comportementaux. La microscopie à deux photons est une technologie optique non linéaire unique qui permet de visualiser en temps réel les structures cellulaires et même subcellulaires dans les couches corticales profondes du cerveau d’un rongeur. Pour effectuer une expérience d’imagerie microscopique à deux photons, placez un animal dressé dans la cage de la maison mobile, ajustez les bouchons pour protéger l’optique du microscope contre les dommages accidentels.

Nettoyez la vitre de protection de la fenêtre crânienne pour enlever les particules de poussière. Déposez un liquide d’immersion sur la vitre de protection. Nous recommandons d’utiliser une solution de visque car l’eau s’évapore rapidement.

La plate-forme peut être placée au-dessus d’une table optique motorisée typique à l’aide du mode grand champ du microscope à fluorescence et d’un filtre d’émission passe-long. Évaluez le système vasculaire cérébral et sélectionnez une région d’intérêt. Pour imager la vascularisation corticale injecter dans la veine de la queue d’un animal fixe et immobilisé, un texte conjugué de 70 kilos Dalton, Texas rouge.

Cette séquence d’images montre un enregistrement en accéléré des lieux et des artères dans le cortex d’une souris au comportement alors qu’elle navigue autour de la cage de la maison mobile. En traçant le profil des lignes tracées à travers la lumière du vaisseau, on peut mesurer les changements dans le diamètre du vaisseau et la motilité de chaque segment de vaisseau. Le débit sanguin dans les artères et les veines peut être mesuré par balayage linéaire le long des lignes tracées parallèlement à la paroi du vaisseau. Bien.

Les détails de la morphologie des neurones peuvent être visualisés chez les souris transgéniques qui expriment YFP dans la sous-population de neurones sous le promoteur de Taiwan. Ces deux Zacks comparent la stabilité de l’imagerie entre les animaux anesthésiés et éveillés. Le panneau latéral droit montre des dendrites de l’animal anesthésiées avec un mélange de kétamine et de xylazine.

Alors que le panneau latéral gauche montre une image de dendrites dans un animal éveillé marchant autour d’une cage de maison mobile. La morphologie individuelle de la colonne vertébrale chez les animaux éveillés peut être analysée avec la même fiabilité et la même précision que chez les souris anesthésiées. Le déplacement du cerveau pendant la course des animaux ne dépasse généralement pas un à un micromètre et demi.

Ces mouvements se produisent dans les directions horizontales et entraînent très rarement un décalage du plan d’imagerie, ce qui rend inutile la correction des artefacts de mouvement. Dans la plupart des cas, la capacité de surveiller de manière chronique l’activité neuronale dans le cerveau vivant éveillé est essentielle pour comprendre l’organisation et le fonctionnement du système nerveux. En utilisant les souris transgéniques tie one G Camp trois, nous imaginons l’activité neuronale spontanée chez les souris éveillées se comportant dans la cage de la maison mobile.

Cette séquence d’images en accéléré montre des exemples représentatifs de pics de calcium dans les corps cellulaires neuronaux, les nites et les axones. L’imagerie optique basée sur des signaux intrinsèques permet de cartographier la distribution spatiale des domaines fonctionnels pour réaliser une expérience d’imagerie optique intrinsèque. Placez l’animal dressé dans la cage de la maison positionnée sous l’objectif de la caméra.

Nettoyez la vitre de protection de la poussière. Mettez une goutte de glycérol et couvrez-la d’un couvercle rond de cinq millimètres. Réglez la position d’une caméra haute vitesse.

Placez un manipulateur avec un tube de soufflage d’air opposé à la vibration controlatérale. Utilisez des lumières vertes pour imager la carte du navire. Concentrez-vous plus profondément dans le cortex, à environ 400 micromètres sous les vaisseaux corticaux.

Placez un filtre passe-bande devant la caméra et illuminez le cortex d’une lumière rouge. Laissez la souris s’adapter à la plate-forme pendant au moins 30 minutes. Enregistrez l’activité de base pendant un épisode de six minutes.

Stimulez le vibra toutes les 10 secondes avec des bouffées d’air pendant une période totale de six minutes. Cette image illustre l’activité neuronale se propageant le long du cortex somatosensoriel en réponse à la stimulation vibratoire à la fréquence de 0,05 hertz. Pour effectuer des enregistrements électrophysiologiques sur cellule unique, placez l’animal dressé implanté avec une fenêtre crânienne inversée dans la cage de la maison mobile.

Lentement et soigneusement, retirez le verre de protection du support métallique. Rafraîchissez le tampon cortical et nettoyez la fenêtre crânienne des débris avec un tampon hémostatique. Placez l’électrode de terre dans le tampon cortical.

Remplissez la pipette patch clamp avec une solution intracellulaire. Appliquez une pression positive sur la pipette enregistreuse à l’aide d’un micromanipulateur motorisé, approfondissez la pipette dans le cortex et obtenez un contact d’étanchéité giga avec la cellule d’intérêt. Après l’enregistrement, retirez la pipette, rafraîchissez le tampon cortical et fermez la fenêtre crânienne en collant un verre de protection sur le support métallique.

L’utilisation d’une cage domestique aéroportée permet de combiner l’imagerie et l’électrophysiologie avec des paradigmes comportementaux classiques tels que l’apprentissage, la réadaptation ou le comportement lié à l’anxiété. L’olfaction est une entrée sensorielle importante pour les souris et peut être utilisée pour la stimulation dans les tests de mémoire et pour l’évaluation de la réaction à la nouveauté. Pour effectuer un test d’habituation disa olfactive, placez l’animal dressé dans la cage de la maison mobile et laissez-le adopter.

Pendant 30 minutes, fixez un morceau de coton propre imbibé d’eau du robinet à la paroi intérieure de la cage de la maison mobile à l’aide d’un ruban adhésif double face. Après cinq minutes, remplacez le coton propre sur la paroi de la cage de la maison par un nouveau imbibé d’un liquide contenant l’odeur de vanille. Répétez les expositions de cinq minutes à l’odeur de vanille trois fois avec des intervalles de cinq minutes entre les sessions.

Pour mesurer le niveau d’intérêt pour l’odeur. Comptez le temps cumulé que l’animal passe face à la zone cible et le temps total de déplacement de la cage de la maison mobile. Au cours de la cinquième dernière séance, présentez une odeur socialement significative.

Mouillez le nouvel applicateur en coton avec quelques gouttes d’urine de souris du sexe opposé. Pour évaluer la réaction à la nouveauté, divisez la cage de la maison mobile en quatre zones. Fixez deux morceaux de coton opposés l’un à l’autre. Couleur.

Codez-les avec des marqueurs sur le côté extérieur des murs de la cage lors du premier essai. Placez deux morceaux de coton propres. Remplacez ensuite les deux par du coton imbibé d’un extrait de vanille à 1 %.

Au cours du troisième essai, placez le coton à la vanille dans la zone numéro un et le morceau de coton imbibé d’un extrait de banane à 1 % dans la zone. Deuxièmement, pour mesurer la préférence à l’absence d’odeur. Calculez le temps que les animaux passent face à l’absence d’odeur en pourcentage du temps cumulé passé face à d’autres zones.

Bonjour, je suis Leo Kiro, chercheur principal au Centre de neurosciences de l’Université d’Helsinki. J’espère que vous avez aimé regarder la vidéo et que vous l’avez trouvée utile. Nous travaillons avec deux sur la microscopie in vivo depuis cinq ans, et l’utilisation de l’esthétique générale et esthétique a toujours été une grande préoccupation parce qu’une esthétique interfère avec la fonction cérébrale, avec la circulation sanguine et tout.

Et aujourd’hui, je suis heureux que nous puissions travailler sur des animaux éveillés et réaliser des expériences d’imagerie microscopique stable et valider et vérifier les résultats que nous avions précédemment obtenus chez des animaux anesthésiés. Je suis sûr que l’utilisation de la cage de maison mobile et les méthodes que nous avons présentées aujourd’hui augmenteront la pertinence de la recherche in vivo en général et conduiront à des résultats nouveaux et révolutionnaires, et j’ai hâte d’y être.