Name: Fond plat Plateforme Air-levée: Une nouvelle méthode pour combiner Comportement avec la microscopie ou électrophysiologie sur Awake Rongeurs déplacer librement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie et d'électrophysiologie chez la souris éveillée et en mouvement libre. Cette plateforme sur coussin d'air permet d'étudier l'activité cérébrale dans un environnement familier et moins stressant.

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Les auteurs remercient le Professeur Eero Castrén pour ses précieux commentaires sur le manuscrit. Le travail est soutenu par des subventions de l&#39;Académie de Finlande, Centre pour la mobilité internationale de la Finlande, et finlandais Graduate School of Neuroscience (cerveau et Doctorat esprit).

<ol><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329, 959-964 (2010).</li>
<li>Sitdikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+suppresses+early+cortical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Translational+Neurology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane suppresses early cortical activity.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).</li>
<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+high-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31, 903-912 (2001).</li>
<li>Piyawattanametha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+brain+imaging+using+a+portable+2.9+g+two-photon+microscope+based+on+a+microelectromechanical+systems+scanning+mirror%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+letters%22%5BJournal%5D)">In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror.</a> Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).</li>
<li>Sawinski, J., Wallace, D. J., Greenberg, D. S., Grossmann, S., Denk, W., Kerr, J. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+evoked+activity+in+cortical+cells+imaged+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19557-19562 (2009).</li>
<li>Fee, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+stabilization+of+electrodes+for+intracellular+recording+in+awake+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Active stabilization of electrodes for intracellular recording in awake behaving animals.</a> Neuron. 27, 461-468 (2000).</li>
<li>Greenberg, D., Houweling, A., Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+imaging+of+ongoing+neuronal+activity+in+the+visual+cortex+of+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats.</a> Nat Neurosci. 11 (7), 749-751 (2008).</li>
<li>Fujiwara-Tsukamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinforcing+operandum%3A+rapid+and+reliable+learning+of+skilled+forelimb+movements+by+head-fixed+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents.</a> Journal of Neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).</li>
<li>Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Resolution+Functional+Imaging+in+Behaving+Rats+Using+Voluntary+Head+Restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint.</a> Neuron. 80, 371-384 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).</li>
<li>Parry, T. J., McElligott, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+restraining+awake+rats+using+head+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Physiolog+%26+behavior%22%5BJournal%5D)">A method for restraining awake rats using head immobilization.</a> Physiolog & behavior. 53 (5), 1011-1015 (1993).</li>
<li>Brecht, M., Schneider, M., Sakmann, B., Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whisker+movements+evoked+by+stimulation+of+single+pyramidal+cells+in+rat+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Whisker movements evoked by stimulation of single pyramidal cells in rat motor cortex.</a> Nature. 427 (6976), 704-710 (2004).</li>
<li>Van Looij, M. A. J., Liem, S. -S., van der Burg, H., van der Wees, J., De Zeeuw, C. I., van Zanten, B. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+conventional+anesthesia+on+auditory+brainstem+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice.</a> Hearing research. 193, 75-82 (2004).</li>
<li>Hentschke, H., Schwarz, C., Antkowiak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+is+the+major+target+of+sedative+concentrations+of+volatile+anaesthetics%3A+strong+depression+of+firing+rates+and+increase+of+GABAA+receptor-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neocortex is the major target of sedative concentrations of volatile anaesthetics: strong depression of firing rates and increase of GABAA receptor-mediated inhibition.</a> The European journal of neuroscience. 21, 93-102 (2005).</li>
<li>Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo%2C+low-resistance%2C+whole-cell+recordings+from+neurons+in+the+anaesthetized+and+awake+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain.</a> Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).</li>
<li>Crochet, S., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+whisker+behavior+with+membrane+potential+in+barrel+cortex+of+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice.</a> Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).</li>
<li>Houweling, A. R., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+report+of+single+neuron+stimulation+in+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex.</a> Nature. 451, 65-68 (2008).</li>
<li>Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+brain+state+regulates+membrane+potential+synchrony+in+barrel+cortex+of+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice.</a> Nature. 454, 881-885 (2008).</li>
<li>Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+stereotaxic+recordings+of+neuronal+activity+in+awake%2C+head-restrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice.</a> Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).</li>
<li>De Kock, C. P. J., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+signals+rapidly+switch+tactile+processing+in+rat+barrel+cortex+during+whisker+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements.</a> Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).</li>
<li>Stüttgen, M. C., Rüter, J., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+psychophysical+channels+of+whisker+deflection+in+rats+align+with+two+neuronal+classes+of+primary+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two psychophysical channels of whisker deflection in rats align with two neuronal classes of primary afferents.</a> J. neuroscience. 26, 7933-7941 (2006).</li>
<li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67, 1048-1061 (2010).</li>
<li>Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuating+and+sensory-induced+vasodynamics+in+rodent+cortex+extend+arteriole+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (20), 8473-8478 (2011).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461, 941-946 (2009).</li>
<li>Chen, G., King, J. A., Burgess, N., O’Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+vision+and+movement+combine+in+the+hippocampal+place+code%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">How vision and movement combine in the hippocampal place code.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 378-383 (2013).</li>
<li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7392), 62-68 (2012).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term , high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 19-22 (2009).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Trachtenberg, J. T., de Paola, V., Svoboda, K., Wilbrecht, L., Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neocortical+Neurons+through+a+Chronic+Cranial+Window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging Neocortical Neurons through a Chronic Cranial Window.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).</li>
<li>Garaschuk, O., Milos, R. -I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JPCalc%2C+a+software+package+for+calculating+liquid+junction+potential+corrections+in+patch-clamp%2C+intracellular%2C+epithelial+and+bilayer+measurements+and+for+correcting+junction+potential+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements.</a> Journal of neuroscience methods. 51 (1), 107-116 (1994).</li>
<li>Golshani, P., Gonçalves, J. T., Khoshkhoo, S., Mostany, R., Smirnakis, S., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internally+mediated+developmental+desynchronization+of+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Internally mediated developmental desynchronization of neocortical network activity.</a> The Journal of neuroscience. 29 (35), 10890-10899 (2009).</li>
<li>Polack, P. -O., Friedman, J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+brain+state-dependent+gain+modulation+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex.</a> Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).</li>
<li>Schwarz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+head-fixed+behaving+rat--procedures+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensor.%2C+%26+motor+research%22%5BJournal%5D)">The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls.</a> Somatosensor., & motor research. 27, 131-148 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Pour mieux comprendre la physiologie du cerveau et de la pathologie, la recherche doit être effectuée sur une variété de niveaux de complexité de préparation, en utilisant les techniques les plus appropriées pour chaque préparation. À l&#39;heure actuelle, un large éventail de méthodes de neurosciences (de tout le corps à la microscopie STED IRMf sous-organite) sont facilement appliqué aux animaux anesthésiés, tandis que des expériences sur des animaux éveillés et se comportent ont représenté un défi méthodologique important. Ici, une nouvelle approche est décrite où un animal de laboratoire, en dépit d&#39;être fermement la tête fixe, peut se déplacer autour d&#39;un homecage air mobile levé et explorer son environnement tangible dans des conditions sans stress. La préparation des animaux tête fixe comporter présentée ici fournit un certain nombre d&#39;avantages cruciaux. Premièrement, les données électrophysiologiques ou d&#39;imagerie obtenus avec cette méthode sont sans compromis ni par l&#39;anesthésie, ni par le stress induit par contrainte. Positionnement de la souris dans la maison mobilecage est rapide et ne nécessite pas d&#39;anesthésier l&#39;animal, même de manière transitoire. Deuxièmement, la homecage air levé assure la stabilité mécanique qui est nécessaire pour quantifier les changements dans la morphologie des neurones amende et d&#39;enregistrer une seule cellule activité électrophysiologique chez les animaux éveillés. Enfin, la conception de la homecage mobile est plus compact par rapport au tapis roulant sphérique, permettant ainsi le positionnement de la homecage portable sous un microscope droit norme pour l&#39;imagerie à deux photons ou d&#39;enregistrement patch-clamp dans le cerveau de souris éveillé. Cabinet fixation de la tête dans le homecage mobile requiert l&#39;implantation d&#39;un support métallique à quatre ailes spécialement conçu, avec une ouverture ronde dans le centre d&#39;accès optique ou électrique à la région du cerveau sous-jacent. Ces supports métalliques sont fixés sur le crâne à l&#39;aide d&#39;une combinaison de la colle, un ciment dentaire et un petit boulon vissé dans l&#39;os du crâne. Cette intervention chirurgicale a été développé sur la base d&#39;un grand nombre de précédemmentprocédures publiées, et on a trouvé au résultat de la préparation dans une fenêtre crânienne stable et reproductible. Pour vivo expériences électrophysiologiques, une fenêtre en forme de lune 34, une petite craniotomie de taille (moins de 0,5 mm) 32, et une préparation vitré foré 35 ont été utilisées. Ici, le &quot;inversé&quot; fenêtre crânienne a été implanté avec soit un grand (diamètre 3,5 mm) ou petites (diamètre inférieur à 0,5 mm) craniotomie. Minimisant ainsi les mouvements du cerveau est essentiel pour les enregistrements de cellules individuelles stables, c&#39;est pourquoi il est conseillé d&#39;effectuer de petits craniotomies de taille pour les expériences électrophysiologiques. Lors de l&#39;implantation de la fenêtre crânienne pour des expériences d&#39;imagerie optique, les animaux sont laissés récupérer pendant au moins 2 ou 3 semaines, période durant laquelle la première fenêtre de manière transitoire perd sa transparence et ensuite elle regagne (avec un rendement de 50-70%, en fonction de l&#39;arrière-plan génétique de la souche de souris). Transparence de la fenêtre crânienne et la stabilitétion du ciment &quot;bouchon&quot; dentaire attaché au crâne peut être vérifiée au moyen d&#39;un microscope binoculaire et l&#39;inspection régulières physique lors de la manipulation des animaux. A la fin de la période de récupération de 2-3 semaines, les animaux qui présentent des signes d&#39;inflammation post-opératoire résiduelle ou des défauts mécaniques dans le ciment dentaire devraient être exclus des expériences et fin. L&#39;âge optimal pour commencer la formation de la souris est de 2-4 mois (correspondant au poids corporel de 20-40 g). Chez les jeunes animaux, l&#39;ancrage du ciment &quot;bouchon&quot; dentaire au crâne peut ne pas être fiable, ce qui peut diminuer sa capacité de résistance au stress mécanique imposé par la locomotion de la souris sur la tête fixe dans le homecage mobile. Bien que les souris mâles et femelles apparaissent tout aussi prêt à naviguer dans homecage mobile, il ya une tendance à une meilleure pourcentage de fenêtres crâniens retrouver leur transparence chez les souris femelles (données non présentées). Ainsi, dans l&#39;ordre to assurer un équilibre entre les sexes dans la cohorte d&#39;animaux sélectionnés pour l&#39;imagerie, de l&#39;implantation des fenêtres crâniens dans environ 30% des souris plus mâle est recommandé. Les interactions sociales sont connues pour améliorer le bien-être des animaux et de réduire le stress, il est donc souhaitable que la même portée sont exploités et formés en parallèle et maintenus ensemble dans des cages de logement en groupe. A la différence des modes opératoires publiés pour la préparation de tapis roulant sphérique 13, le procédé utilisant le homecage mobile ne nécessite pas d&#39;anesthésier la souris au moment de la fixation de la tête. Cette différence est importante car elle permet d&#39;éliminer les effets résiduels que même un bref épisode d&#39;anesthésie et &quot;lumière&quot; est susceptible d&#39;avoir sur les mesures physiologiques obtenus peu de temps après. En effet, même si dans les études où la tête de fixation a été fait sous anesthésie et les expériences réelles ont commencé après une période d&#39;attente brève 13, on ne peut pasexclure les éventuels effets à long terme de la brève épisode de l&#39;anesthésie sur les données expérimentales. D&#39;autres études se sont appuyés sur la privation d&#39;eau pour l&#39;accoutumance systématique des animaux à la tête de fixation et utilisé récompense de l&#39;eau comme moyen de motiver l&#39;animal à rester immobile 36. Cependant, la méthode tête fixation récompense basée limite le choix des tests de comportement applicables et, surtout, occupe l&#39;une des associations stimulus-récompense bien établies. En revanche, la méthode de la souris de l&#39;accoutumance à la tête de fixation dans homecage mobile ne nécessite pas une privation d&#39;eau et de rendement subséquent. Complétant la homecage mobile avec un système de distribution d&#39;eau est recommandée pour des expériences de longue durée. Les séances de dressage d&#39;animaux et les expériences présentées ici ont été effectuées pendant la journée (8 heures-18 heures), ce qui correspond à la période physiologiquement passive pour les souris qui sont conservés selon le calendrier de la lumière de 12 heures standard (liSMTG sur à 6 heures et descendre à 18 heures). Depuis la prise d&#39;eau est directement liée à l&#39;activité de la souris, les souris pendant la période passives ne nécessitent pas de distribution de l&#39;eau si la durée d&#39;une session de formation / imagerie / d&#39;enregistrement ne dépasse pas 2 heures. En plus de la date et la durée des sessions de formation, il faut aborder la question du nombre optimal de séances nécessaires pour habituer les animaux à homecage mobile. A cette fin, deux critères ont été utilisés pour évaluer le stress induit par des modes opératoires de la tête de fixation: i) la perte de poids, et ii) le niveau de l&#39;activité locomotrice. Comme le montre la figure 6, la perte de poids atteint le niveau moyen de 6% sur deux jours de formation, et est complètement inversé par la formation de 4 jours (Figure 6A). En cohérence avec la dynamique de pesage, le niveau des animaux à tête fixe activité locomotrice est supprimée dans le premier jour de la formation, mais se stabilise par la formation le jour 4 (figure 6D). Sur la base de ces mesures, nous suggestionst que la durée minimale de la période de formation de la souris sur homecage mobile est de 4 jours, comme décrit dans le protocole par les présentes. L&#39;utilisation de l&#39;, homecage portable fond plat air-levée permet d&#39;ajouter des tâches complexes (sensori-motrices, perceptives, cognitives et) les paradigmes de formation pour les souris à tête fixe. Dans la présente étude, deux protocoles de tests comportementaux sont présentés. Les deux protocoles utilisent odeur indices et peuvent être combinés avec longitudinales imagerie / enregistrements dans le cortex de la souris. Bien que le homecage mobile est fabriqué à partir de matériaux non absorbants, il faut encore tenir compte des interférences possibles entre l&#39;odeur de l&#39;appareil et l&#39;odeur (s) d&#39;essai. Un autre facteur qui peut interférer avec des repères visuels / tactiles d&#39;une expérience comportementale est la jonction entre le mur et l&#39;insert, ce qui n&#39;est pas sans faille et peuvent, par conséquent, être perçu par l&#39;animal comme un point de repère. Il convient de noter ici que, afin de minimiser la détresse de l&#39;animal au cours de cette intégrationrventions que le placement d&#39;un coton odeur présentant à la paroi homecage mobile, l&#39;expérimentateur doit pratiquer pour effectuer ces interventions le plus rapidement possible et éviter toute manipulation prolongée de la cage de carbone. Stratégies alternatives pour roman présentation odeur / objet sont envisageables, par exemple, en plaçant solution hydrogel gouttes ou des objets (tels que les puces alimentaires) sur de petites étagères fixées à la surface interne de la paroi de la cage de carbone à la hauteur compatible avec la tête de positionnement de l&#39;animal. Homecage mobile permet aux animaux de la tête fixe pour effectuer un large éventail de mouvements à deux dimensions, y compris la locomotion horizontale, situp, toilettage, en fouettant, lécher, nez-piquer, les mouvements de la patte avant qualifiés, et le mur de toucher avec les pattes avant, comme illustré dans la présente étude . Utilisation homecage mobile et les protocoles présentés ici, les chercheurs peuvent étudier le système neuronal sensori-moteur avec un niveau élevé de contrôle sur à la fois la condition de stimulations et au dépouillement de comportement. En outre, des études de capacités cognitives chez des souris éveillées peuvent être effectuées pendant le conditionnement, la navigation spatiale et les tâches de prise de décision. Il existe plusieurs limitations pratiques de ce procédé. Tout d&#39;abord, une quantité importante d&#39;air sous pression est nécessaire pour obtenir la puissance de homecage-levage et de réaliser des expériences de longue durée. En second lieu, la homecage mobile dans sa mise en oeuvre est présente seulement 18 cm de diamètre, et par conséquent fournit un relativement petit et simple par rapport à l&#39;espace de réalité virtuelle, où un environnement expérimental complexe peut être conçu sans aucune restriction spatiales. Troisièmement, lors de la stimulation des moustaches et des expériences à base de récompense-présentés ici, un dispositif a été utilisé qui limite la possibilité de la paroi contact pour la souris. L&#39;addition d&#39;un canal de stimulation sensorielle visuelle ou externe (comme un projecteur de lumière dirigée œil), il faudrait concevoir un dispositif plus compact et ergonomique, par rapport àles solutions à écran multiple ou d&#39;un dôme de projection qui ont été utilisés dans les expériences de tapis roulant sphériques. En résumé, l&#39;utilisation de la souris à la tête fixe se déplaçant dans la homecage air mobile levée facilite grandement les études qui combinent les niveaux cellulaires, moléculaires et comportementaux d&#39;observation et de manipulation dans une expérience unique. Applications spécifiques illustrés ici comprennent deux photons imagerie microscopique, intrinsèque imagerie de signal optique et les enregistrements de patch-clamp chez les souris Behaving non anesthésiés. Il est prévu que cette approche va ouvrir de nouveaux horizons dans l&#39;expérimentation sur éveillé, la souris se comporter et de servir comme un outil utile à la fois pour le développement de médicaments et la recherche fondamentale de la fonction cérébrale.

Une tendance récente passionnante dans les neurosciences est de développer des approches expérimentales pour moléculaire et cellulaire de sondage des réseaux neuronaux dans le cerveau de dormir, de se comporter rongeurs. Ces approches prometteuses pour apporter un nouvel éclairage sur les processus neurophysiologiques qui sous-tendent la fonction motrice, l&#39;intégration sensori-motrice, la perception, l&#39;apprentissage, la mémoire, ainsi que la progression de la blessure, la neurodégénérescence et les maladies génétiques. En outre, l&#39;enregistrement à partir du cerveau de l&#39;animal éveillé prometteuse dans le développement de nouveaux agents thérapeutiques et les traitements. Il ya une prise de conscience croissante que l&#39;anesthésie, qui a été couramment utilisé dans les expériences neurophysiologiques, peut affecter les mécanismes de base du fonctionnement du cerveau, pouvant conduire à une interprétation erronée des résultats expérimentaux. Ainsi, la kétamine anesthésie largement utilisé augmente rapidement la formation de nouvelles épines dendritiques et améliore la fonction synaptique 1; un autre anesthésique couramment utiliséic isoflurane à des niveaux d&#39;anesthésie chirurgicale supprime complètement l&#39;activité corticale spontanée chez les rats nouveau-nés et des blocs oscillations fuseau éclater chez les animaux adultes 2. À l&#39;heure actuelle, seul un nombre limité d&#39;approches permettent des expériences chez la souris non anesthésiée à l&#39;aide de deux photons imagerie microscopique ou enregistrements de patch-clamp. Ces approches peuvent être divisés en préparations se déplacer librement et tête fixe. L&#39;attrait unique de préparation des animaux se déplaçant librement, c&#39;est qu&#39;il permet une évaluation du comportement naturel, y compris les mouvements du corps entier pendant la navigation. Une façon de l&#39;image à l&#39;intérieur du cerveau d&#39;un rongeur se déplacer librement est d&#39;attacher un microscope ou fibroscope 3-5 monté sur la tête miniaturisée. Cependant, les dispositifs miniaturisés ont tendance à avoir des performances optiques limitée en comparaison de microscopie à deux photons axé sur les objectifs, et ne peuvent être facilement combinés avec des enregistrements entiers cellule de patch-clamp 6. L&#39;exisolutions de piqûre pour la tête de fixation d&#39;un rongeur éveillé se sont appuyés principalement soit sur ​​la contention physique ou 7,8 sur la formation de l&#39;animal à présenter volontaire appuie-tête 9. Une autre approche populaire est de permettre aux membres de l&#39;animal de se déplacer en le plaçant sur, par exemple, un tapis roulant sphérique 10; cette approche est souvent combiné avec la réalité virtuelle générée par ordinateur. Des expériences électrophysiologiques sur des souris de tête-fixe ont principalement utilisé des enregistrements extracellulaires et ont été utilisés pour étudier la régulation centrale de la fonction cardio-vasculaire 11, les effets de l&#39;anesthésie sur l&#39;activité neuronale 12, la réponse auditive du tronc cérébral 13 et traitement de l&#39;information 14. Les enregistrements entiers de cellules pionnières intracellulaires / des animaux de Behaving éveillés ont été réalisées dans les années 2000 et ont porté sur l&#39;activité neuronale liée à la perception et le mouvement 15-20. Vers la même époque, les premières études d&#39;imagerie microscopique sur des souris ont été éveillés pubblis, où microscopie biphotonique a été utilisé dans le cortex sensoriel de rats retenus physiquement et 7 sur des souris en cours d&#39;exécution sur un tapis roulant sphérique 21. Études in vivo de microscopie et d&#39;électrophysiologie ultérieures ont démontré qu&#39;une préparation tête de fixation peut être combiné avec succès avec paradigmes comportementaux basés sur les mouvements des membres antérieurs, reconnaissance d&#39;odeurs, en fouettant, et lécher 8,22-25. Souris placés sur le tapis roulant sphérique peuvent être formés pour naviguer dans l&#39;environnement visuel virtuel généré par un ordinateur 10,26. Des enregistrements intracellulaires / extracellulaires ont démontré que, chez un animal à tête fixe navigation tel environnement virtuel, l&#39;activation des cellules de lieu de l&#39;hippocampe peut être détectée 27. Dans un environnement visuel virtuel, les souris démontrent rythme thêta relatif aux mouvements normaux du potentiel de champ local et en phase thêta précession pendant le mouvement actif 27. Récemment, l&#39;activit spatiale et temporelledes motifs y de populations neuronales ont été enregistrées optiquement dans des souris au cours du travail des tâches de décision de la mémoire dans un environnement virtuel 28. Malgré avoir permis recherche de pointe, la conception de tapis roulant sphérique a plusieurs limites inhérentes. Tout d&#39;abord, l&#39;animal est nécessaire pour déplacer sur une surface illimitée d&#39;un ballon à air levé rotation, ce qui ne pose pas d&#39;obstacles tangibles tels que des murs ou des barrières. Cette limitation est seulement en partie compensée par la «réalité virtuelle» généré par ordinateur, parce que l&#39;entrée visuelle est sans doute moins efficace sur les souris et les rats par rapport à l&#39;entrée sensorielle tactile (par exemple, favori-touch ou lécher), dont ces espèces dépendent naturellement sur. En second lieu, la courbure importante de la surface de la bille peut être inconfortable pour les souris de laboratoire utilisées pour la marche sur un plancher plat dans leurs cages. Enfin, le diamètre même de la balle (au moins 200 mm pour les souris et 300 mm pour les rats) rend la dimension verticale de la sphériqueDispositif de tapis roulant relativement importante. Il est donc difficile de combiner tapis roulant sphérique avec la majorité des configurations disponibles dans le commerce de microscopie, et nécessite souvent la construction d&#39;une nouvelle installation dans le tapis roulant au moyen de cadres de microscope sur mesure. Ici, une nouvelle méthode est décrite où une souris de tête fixe peut se déplacer autour d&#39;un homecage air mobile levé qui dispose d&#39;un plancher plat et les murs tangibles, et explorer l&#39;environnement physique dans des conditions sans stress. Cet article explique les procédures de formation de la souris et de la tête de fixation, et fournit des exemples représentatifs où la microscopie à deux photons, imagerie optique intrinsèque et de patch-clamp enregistrements sont effectués dans le cerveau de souris Behaving éveillé.

<table><tbody><tr><td>Pince à épiler, acier inoxydable, 115 mm</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td></td></tr><tr><td>Tondeuse pour animaux, machine à raser</td><td>Aesculap</td><td>Isis GT420</td><td></td></tr><tr><td>Microscope binoculaire</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de température biologique avec coussin chauffant en acier inoxydable</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>Lame microchirurgicale émoussée</td><td>BD</td><td>REF </td><td></td>374769</tr><tr><td>Tube en borosilicate avec filament</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td>Pour la production de pipettes</td></tr><tr><td>patch Camera&nbsp ;</td><td>Foscam</td><td>FI8903W</td><td>Visibilité nocturne</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl vet</td><td></td></tr><tr><td>Ciment dentaire</td><td>DrguDent, Dentsply</td><td>REF 640 200 271</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>FaunaPharma</td><td>Rapidexon vet</td><td></td></tr><tr><td>Forets jetables</td><td>Meisinger</td><td>HP 310104001001008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s PBS 10x</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pince, 110 mm</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Lubrifiant pour les yeux</td><td>Novartis</td><td>Viscotears</td><td>Pour la protection des yeux pendant le fonctionnement et comme solution de viscose pour l’immersion&nbsp ;</td></tr><tr><td>Foredom drill control</td><td>Foredom&nbsp ;</td><td>FM3545</td><td></td></tr><tr><td>Foredom Micro moteur à main</td><td>Foredom</td><td>MH-145</td><td></td></tr><tr><td>Support métallique à quatre ailes</td><td>Neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Support de tête pour souris</td><td>Narishige</td><td>SG-4N</td><td>Assemblé sur instrument stéréotaxique</td></tr><tr><td>Hémostase Éponge de collagène</td><td>Avitene, Ultrafoam BARD</td><td>Ref 1050050</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Intervet</td><td>Ketaminol vet</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Sil&nbsp ;</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro pince à pansement, 105 mm</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de microélectrodes</td><td>Narishige</td><td>PC-10H</td><td>Extracteur vertical pour la production de pipettes en verre</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Sensapex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini bolt</td><td>Centrostyle</td><td>Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5</td><td></td></tr><tr><td>Mobile Homecage</td><td>Neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à balayage laser multiphotonique</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>Écouvillons non tissés, 5 x 5</td><td>Molnlycke Health Care</td><td>Mesoft</td><td>Tampons chirurgicaux</td></tr><tr><td>Colle polyacrylique</td><td>Henkel</td><td>Loctite 401</td><td></td></tr><tr><td>Lamelle en verre rond</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td></td><td>1.5 épaisseur</td></tr><tr><td>Instrument stéréotaxique pour petits animaux</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris d’étudiant, droits 11,5 cm</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Health Care</td><td>Rompun vétérinaire</td><td></td></tr></tbody></table>

fond plat plateforme air-levée: une nouvelle méthode pour combiner comportement avec la microscopie ou électrophysiologie sur awake rongeurs déplacer librement

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Il est largement reconnu que l&#39;utilisation d&#39;anesthésiques généraux peut nuire à la pertinence des données électrophysiologiques ou microscopiques obtenues à partir du cerveau d&#39;un animal vivant. En outre, la longue récupération de l&#39;anesthésie limite la fréquence des épisodes répétés d&#39;enregistrement / d&#39;imagerie dans des études longitudinales. Par conséquent, de nouvelles méthodes qui permettraient enregistrements stables de souris Behaving non anesthésiés sont attendus pour faire avancer les domaines des neurosciences cellulaires et cognitives. Les solutions existantes vont de la simple contrainte physique à des approches plus sophistiquées, telles que les tapis roulants linéaires et sphériques utilisées en combinaison avec la réalité virtuelle générée par ordinateur. Ici, une nouvelle méthode est décrite où une souris de tête fixe peut se déplacer autour d&#39;un homecage air mobile levé et explorer son environnement dans des conditions sans stress. Cette méthode permet aux chercheurs d&#39;effectuer des tests de comportement (par exemple, l&#39;apprentissage, l&#39;accoutumance ou roman reconnaissance d&#39;objet) en même temps quedeux photons imagerie microscopique et / ou des enregistrements de patch-clamp, toutes réunies en une seule expérience. Cette vidéo-article décrit l&#39;utilisation de l&#39;appareil de tête d&#39;animal de fixation éveillé (de homecage mobile), démontre les procédures d&#39;accoutumance des animaux, et illustre un certain nombre d&#39;applications possibles de la méthode.

La méthode présentée ici est destiné à l'imagerie microscopique ou unicellulaires enregistrements électrophysiologiques chez des souris éveillées, tête fixe mais sinon librement mobiles et se comportent. L'animal peut se déplacer dans deux dimensions en un réel (par opposition au virtuel), l'environnement matériel et familier, tandis que le crâne de l'animal est solidement fixé au bras tête de fixation. Habituant la souris à la homecage air mobile levé compose de 4-6 jours de séances biquotidiennes formation de 2 h (Figure 1). Les animaux formés peuvent ensuite être utilisés immédiatement dans les expériences. Une étude typique comprend un certain nombre de séances d'imagerie ou de sessions d'enregistrement patch-clamp qui sont espacées à des intervalles allant de quelques heures à plusieurs jours ou semaines. Surtout, les deux enregistrements optiques et électrophysiologiques peuvent être effectuées simultanément avec des stimuli et des indicateurs comportementaux ou cognitifs, dans une expérience unique. Pour évaluer la stabilité mécanique detête de fixation de la souris dans la homecage mobile, les séquences d'images de navires corticales marqués avec dextran fluorescent conjugué et de dendrites corticaux exprimant YFP ont été recueillies alors que les animaux de laboratoire naviguaient le homecage mobile (figure 2). Les déplacements maximaux du cerveau au cours de la locomotion de l'animal ne dépassent pas généralement 1-1,5 micromètres. Ces déplacements se sont produites dans les directions horizontale et très rarement donné lieu à un changement détectable du plan d'imagerie, ce qui rend inutile toute correction d'artefacts de mouvement. Fixation stable de la tête dans homecage mobile permet la quantification des épines dendritiques individuelles chez les animaux éveillés avec la même fiabilité que dans des souris anesthésiées. Densité des épines dendritiques, la morphologie et le chiffre d'affaires peuvent être surveillés au cours des études longitudinales avec des séances d'imagerie multiples effectuées à des intervalles allant de quelques heures à plusieurs jours ou semaines. La facilité d'utilisation de la mobile homecage pour l'imagerie optique fonctionnelle a été testé dans le cortex somatosensoriel des souris éveillées en utilisant deux approches: i) la microscopie à deux photons sur les souris transgéniques Thy1-GCaMP3 et ii) intrinsèque imagerie de signal optique chez les souris de type sauvage. Ca 2 + imagerie a été effectuée dans la couche 2/3, qui contient des corps cellulaires des neurones marqués par fluorescence nombreux, ainsi que leurs dendrites et des axones (figure 3). Les parcelles de fluorescence sur la durée de certaines régions d'intérêt (ROI) sont présentés dans la figure 3, montrant l'activité neuronale spontanée (mesurée par des augmentations transitoires de fluorescence de GCaMP3) pendant la navigation active de la souris dans la homecage mobile. L'imagerie optique basé sur des signaux intrinsèques permet de cartographier la distribution spatiale des domaines fonctionnels. Figure 4 illustre les changements de forme ondulée dans le niveau d'oxygénation du sang (reflétant l'activation neuronale régionale) qui propagent le long de cortex somatosensoriel en réponse à vibrissa stimulation à la fréquence de 0,05 Hz. Pour tester la faisabilité de patch-clamp enregistrements avec homecage mobile, nous avons utilisé des souris C57BL/6J 2-3 mois vieux. Couche 2/3 de neurones dans le cortex somatosensoriel ont été enregistrés à partir de la configuration de cellules entières en utilisant le mode de blocage de courant. Enregistrement patch-clamp dans le cerveau de souris éveillé tête fixée sur homecage mobile était essentiellement similaire à aveugler patch-clamp dans des tranches de cerveau. Environ 50% des tentatives pour résultat la formation de gigaseal réussi, dont plus de 70% a produit stable enregistrement de configuration à cellules entières. Aucun événement de perdre le contact gigaseal par déplacement mécanique de cellules ont été observées. Figure 5 illustre un fragment de 60 secondes d'un représentant de 10 minutes de temps d'enregistrement actuel pince corrélée avec des épisodes de actif (marche) de la souris et (au repos) Etats passifs. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" src='"/' files width='"600"'> Figure 1. La méthode de fixation tête de souris éveillé dans la homecage mobile. A) Vue d'ensemble de la conception de homecage air mobile levé et illustrations du concept général. B) Schéma d'un calendrier expérimental typique. L'étude commence à l'implantation de la fenêtre crânienne deux semaines avant habituer la souris pour la manutention et de l'emballage, qui est suivi par huit formations deux fois par jour. L'étude typique comprend un certain nombre de séances d'imagerie ou de sessions d'enregistrement patch-clamp qui sont espacées à des intervalles allant de quelques heures à plusieurs jours ou semaines. Les deux mesures optiques et électrophysiologiques peuvent être faites en parallèle avec des stimuli et des indicateurs cognitifs ou comportementaux au sein d'une seule expérience. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 2. Exemple de deux photons imagerie microscopique sur des souris éveillées en mouvement autour de la homecage mobile. A, B) du système vasculaire corticale, marqué avec le dextrane conjugué à du rouge Texas 70 kDa. Le diamètre des segments individuels de bateau est mesurée en traçant au fil du temps le profil des lignes à travers la lumière du vaisseau pendant les périodes de repos et de fonctionnement (A) de la souris. La vitesse d'écoulement du sang dans les artères et les veines est mesurée par la ligne de balayage le long des lignes tracées parallèlement à la paroi de la cuve (B). C, D) détails fins de la morphologie neuronale visualisée dans le cerveau de souris transgéniques qui expriment la YFP en sous-population de neurones dans le cadre du promoteur Thy1. Reconstruction tridimensionnelle des neurones pyramidaux du cortex somatosensoriel de la souris (C). Les images d'un b dendritiqueranch acquis, une souris se comporter éveillé sont suffisamment stables pour la quantification de personne épines dendritiques morphologie (D). E) Quantification du mouvement au cerveau causés par les mouvements de la souris. Des déplacements plus importants d'amplitude en corrélation avec les périodes de fonctionnement de la souris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig2highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" width="600"> Figure 3. Exemple d'activité de la population neuronale dans éveillé Thy1-GCaMP3 souris se déplacer autour de la homecage mobile. A) l'image à deux photons de la couche corticale II / III neurones. ROI, par exemple les corps cellulaires neuronaux, dendrites et des axones sont indiqués en jaune. B) AF / F traces de la fluorescence de GCaMP3 de ROI indiquées dans A (temps depêches enregistré à 1.5 sec / image). C) zoomée en région imagée à 65 ms / cadre. D) Fluorescence de ROI jaunes dans C tracée au fil du temps, montre les augmentations transitoires (rouge) de la fluorescence de GCaMP3 qui correspondent à l'action Ca 2 + épisodes potentiels induits par d'afflux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" width="600"> Figure 4. L'exemple de cartographie de la répartition spatiale des réponses fonctionnelles dans le cortex d'une souris éveillés au moyen d'une image des signaux optiques intrinsèques. A) de Bright champ des vaisseaux sanguins superficiels par la fenêtre crânienne. B) carte Magnitude de l'activité de base dans ho mobilesmecage lors d'un épisode de 6 minutes. C) carte Magnitude de l'activité neuronale se propageant le long cortex somatosensoriel en réponse à la stimulation de vibrisses à une fréquence de 0,05 Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" width="600"> Figure 5. Exemple de cellule entière d'enregistrement patch-clamp dans le cortex de souris éveillé un déplacement autour de la homecage mobile. A) l'enregistrement actuel-clamp d'un neurone dans la couche corticale de la souris 2/3. A 0,5 sec, injection de courant de 100 pA (indiqué ci-dessous la trace) se traduit par une salve de potentiels d'action. La cellule a montré la fréquence de pic adaptation caractéristique de neurones pyramidaux. B) continue l'enregistrement courant pincede la même neurone en corrélation avec l'activité souris »locomoteur (en rose ci-dessus la trace). Activité spontanée représentant de la couche 2/3 neurones pendant les périodes de la souris de repos (C) et le fonctionnement (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" width="600"> Figure 6. Perte de poids des animaux et de l'activité locomotrice des souris head-fixed/non-fixed au cours des sessions de formation dans le homecage mobile. A) poids de l'animal (moyenne + SD,%) avant les sessions de formation. Notez que la perte de poids est intégralement reprise par la session de formation 7-8 ème. B) de la trajectoire horizontale de locomotion rapport de la souris pour le homecage mobile,qui a été extrapolée à partir de la circulation suivi de la homecage mobile pendant 8 ème session de formation. C) des mouvements chenilles d'une souris non-tête fixe explorer la cage ronde pendant 8 ème session de formation. D) Durée de la tête fixe (cercle) et non-fixe (triangle) mouvement de la souris pendant 1-4 ème journée de formation (moyenne + SD,%). Notez que, le jour 4, les souris de tête-Correction de l'affichage ni gel (comme le jour 1), ni l'activité locomotrice excessive. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Cette méthode crée un environnement familier tangible pour la souris pour naviguer et explorer pendant imagerie ou unicellulaires microscopiques enregistrements électrophysiologiques, qui exigent la fixation ferme de la tête de l&#39;animal.

Fond plat Plateforme Air-levée: Une nouvelle méthode pour combiner Comportement avec la microscopie ou électrophysiologie sur Awake Rongeurs déplacer librement

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

Bonjour, je suis Hel Lin, étudiant de troisième cycle au Near Science Center de l’université d’Helsinki. Aujourd’hui, mes collègues et moi allons vous montrer comment effectuer des enregistrements optiques et électrophysiologiques dans la tête éveillée, mais autrement en mouvement libre et se comporter avec des animaux. Notre méthode crée un environnement tangible et familier pour que la souris puisse naviguer et explorer.Lors d’une imagerie microscopique ou d’enregistrements électrophysiologiques sur cellule unique, qui nécessitent une fixation ferme de la tête de l’animal, nous implantons une fenêtre crânienne chronique et habituons la souris à une cage de maison mobile aéroportée, qui glisse sous les pieds de l’animal. Lors de la locomotion sur une surface plane, la cage de la maison mobile peut être positionnée sous un microscope vertical standard pour l’imagerie à deux photons ou placée dans un dispositif d’électrophysiologie pour des enregistrements par patch clamp dans le cerveau d’une souris éveillée. Toutes les procédures expérimentales présentées ici ont été approuvées par le comité d’éthique local.Nous implantons des fenêtres crâniennes selon les protocoles publiés avec des modifications mineures lors de l’implantation de fenêtres crâniennes. L’animal est autorisé à récupérer pendant au moins deux ou trois semaines pendant cette période de récupération, la fenêtre retrouve normalement sa transparence. Les animaux présentant des signes d’inflammation postopératoire résiduelle sont exclus des expériences.Entraînez les animaux sélectionnés pour une étude à les habituer à la fixation de la tête. Dans la cage de la maison mobile, manipulez la souris calmement pendant cinq à 10 minutes, en évitant les mouvements brusques et les bruits, puis remettez-la dans la cage de la maison. Répétez la procédure deux ou trois fois à intervalles inégaux.La cage de maison mobile permet une fixation de la tête sans anesthésier l’animal avant la fixation de la tête. Utilisez un chiffon pour envelopper la souris deux ou trois fois à intervalles inégaux. Assurez-vous que l’animal reste calme lorsqu’il est enveloppé.Sinon, répétez la procédure jusqu’à ce que la souris s’y habitue complètement. Commencez l’entraînement deux fois par jour des souris sur la cage de la maison mobile le lendemain de la fin de la manipulation. Pesez les animaux avant chaque séance d’entraînement.Les animaux présentant une perte de poids supérieure à 10 % doivent être exclus de l’étude. Ajustez la position du bras de fixation de la tête pour qu’elle corresponde à la taille de l’animal dressé. Connectez l’entrée d’air de la cage de la maison mobile à la sortie d’air sous pression standard du laboratoire.Assurez-vous que la pression de l’air est suffisante pour la flottaison libre de la cage domestique transportée par avion. Commencer l’entraînement des animaux habitués dans la cage de la maison mobile. Immobilisez la souris en l’enveloppant dans le chiffon.Insérez le support métallique fixé à la tête de l’animal dans le bras de fixation de la tête et fixez-le fermement en serrant les vis. Activez le flux d’air pour faire léviter la cage d’accueil aéroportée. Retirez le chiffon et laissez la souris explorer la cage de la maison.Au cours de la première séance d’entraînement, les souris peuvent présenter un comportement de gel et de tremblement et une érection de la queue. Pour habituer l’animal au bruit, assurez-vous d’une exposition constante aux sons ambiants en utilisant, par exemple, une traduction radio ou de la musique et des paroles enregistrées pendant toutes les séances d’entraînement ainsi que pendant les expériences. Pour éviter le stress chronique, utilisez un éclairage à lumière vive pendant la première heure de la séance d’entraînement.Après la première heure, effectuez l’entraînement dans l’obscurité et utilisez une caméra proche infrarouge pour surveiller le comportement de l’animal. Lorsque la séance d’entraînement est terminée, libérez l’animal du bras de fixation de la tête en perdant les vis. Retournez l’animal dans la cage de la maison pendant au moins deux heures avant la prochaine séance d’entraînement.Garder la souris dans une cage avec deux autres souris ou plus réduira le niveau de stress. En option, vous pouvez placer la cage transportée par avion avec l’animal dans sa cage d’origine. Cela enrichira l’environnement et pourra renforcer l’habitation de l’animal à la cage de la maison mobile.Au cours de la dernière séance d’entraînement, les souris sont habituées à la fixation de la tête et doivent présenter un comportement sans stress en naviguant calmement autour de la cage domestique transportée par avion. En l’absence de lumière visible, la trajectoire de la locomotion de la souris peut être suivie en surveillant les mouvements de la cage avec une caméra proche infrarouge ou avec une souris d’ordinateur optique. Lors de séances d’entraînement prolongées qui durent plus d’une ou deux heures, envisagez de fournir de l’eau potable à la souris, soit manuellement, soit à l’aide d’un porte-pipette fixé au cadre de la cage de la maison mobile.Le diagramme suivant résume la chronologie d’une étude expérimentale typique. L’étude commence par l’implantation de la fenêtre crânienne deux semaines avant la manipulation des souris et se poursuit par huit séances d’entraînement deux fois par jour. L’étude typique comprend un certain nombre de séances d’imagerie ou de séances d’enregistrement par patch clamp espacées de quelques heures à plusieurs jours ou semaines.Des expériences optiques et électrophysiologiques peuvent être réalisées en parallèle avec des stimuli et des lectures cognitifs ou comportementaux. La microscopie à deux photons est une technologie optique non linéaire unique qui permet de visualiser en temps réel les structures cellulaires et même subcellulaires dans les couches corticales profondes du cerveau d’un rongeur. Pour effectuer une expérience d’imagerie microscopique à deux photons, placez un animal dressé dans la cage de la maison mobile, ajustez les bouchons pour protéger l’optique du microscope contre les dommages accidentels.Nettoyez la vitre de protection de la fenêtre crânienne pour enlever les particules de poussière. Déposez un liquide d’immersion sur la vitre de protection. Nous recommandons d’utiliser une solution de visque car l’eau s’évapore rapidement.La plate-forme peut être placée au-dessus d’une table optique motorisée typique à l’aide du mode grand champ du microscope à fluorescence et d’un filtre d’émission passe-long. Évaluez le système vasculaire cérébral et sélectionnez une région d’intérêt. Pour imager la vascularisation corticale injecter dans la veine de la queue d’un animal fixe et immobilisé, un texte conjugué de 70 kilos Dalton, Texas rouge.Cette séquence d’images montre un enregistrement en accéléré des lieux et des artères dans le cortex d’une souris au comportement alors qu’elle navigue autour de la cage de la maison mobile. En traçant le profil des lignes tracées à travers la lumière du vaisseau, on peut mesurer les changements dans le diamètre du vaisseau et la motilité de chaque segment de vaisseau. Le débit sanguin dans les artères et les veines peut être mesuré par balayage linéaire le long des lignes tracées parallèlement à la paroi du vaisseau. Bien.Les détails de la morphologie des neurones peuvent être visualisés chez les souris transgéniques qui expriment YFP dans la sous-population de neurones sous le promoteur de Taiwan. Ces deux Zacks comparent la stabilité de l’imagerie entre les animaux anesthésiés et éveillés. Le panneau latéral droit montre des dendrites de l’animal anesthésiées avec un mélange de kétamine et de xylazine.Alors que le panneau latéral gauche montre une image de dendrites dans un animal éveillé marchant autour d’une cage de maison mobile. La morphologie individuelle de la colonne vertébrale chez les animaux éveillés peut être analysée avec la même fiabilité et la même précision que chez les souris anesthésiées. Le déplacement du cerveau pendant la course des animaux ne dépasse généralement pas un à un micromètre et demi.Ces mouvements se produisent dans les directions horizontales et entraînent très rarement un décalage du plan d’imagerie, ce qui rend inutile la correction des artefacts de mouvement. Dans la plupart des cas, la capacité de surveiller de manière chronique l’activité neuronale dans le cerveau vivant éveillé est essentielle pour comprendre l’organisation et le fonctionnement du système nerveux. En utilisant les souris transgéniques tie one G Camp trois, nous imaginons l’activité neuronale spontanée chez les souris éveillées se comportant dans la cage de la maison mobile.Cette séquence d’images en accéléré montre des exemples représentatifs de pics de calcium dans les corps cellulaires neuronaux, les nites et les axones. L’imagerie optique basée sur des signaux intrinsèques permet de cartographier la distribution spatiale des domaines fonctionnels pour réaliser une expérience d’imagerie optique intrinsèque. Placez l’animal dressé dans la cage de la maison positionnée sous l’objectif de la caméra.Nettoyez la vitre de protection de la poussière. Mettez une goutte de glycérol et couvrez-la d’un couvercle rond de cinq millimètres. Réglez la position d’une caméra haute vitesse.Placez un manipulateur avec un tube de soufflage d’air opposé à la vibration controlatérale. Utilisez des lumières vertes pour imager la carte du navire. Concentrez-vous plus profondément dans le cortex, à environ 400 micromètres sous les vaisseaux corticaux.Placez un filtre passe-bande devant la caméra et illuminez le cortex d’une lumière rouge. Laissez la souris s’adapter à la plate-forme pendant au moins 30 minutes. Enregistrez l’activité de base pendant un épisode de six minutes.Stimulez le vibra toutes les 10 secondes avec des bouffées d’air pendant une période totale de six minutes. Cette image illustre l’activité neuronale se propageant le long du cortex somatosensoriel en réponse à la stimulation vibratoire à la fréquence de 0,05 hertz. Pour effectuer des enregistrements électrophysiologiques sur cellule unique, placez l’animal dressé implanté avec une fenêtre crânienne inversée dans la cage de la maison mobile.Lentement et soigneusement, retirez le verre de protection du support métallique. Rafraîchissez le tampon cortical et nettoyez la fenêtre crânienne des débris avec un tampon hémostatique. Placez l’électrode de terre dans le tampon cortical.Remplissez la pipette patch clamp avec une solution intracellulaire. Appliquez une pression positive sur la pipette enregistreuse à l’aide d’un micromanipulateur motorisé, approfondissez la pipette dans le cortex et obtenez un contact d’étanchéité giga avec la cellule d’intérêt. Après l’enregistrement, retirez la pipette, rafraîchissez le tampon cortical et fermez la fenêtre crânienne en collant un verre de protection sur le support métallique.L’utilisation d’une cage domestique aéroportée permet de combiner l’imagerie et l’électrophysiologie avec des paradigmes comportementaux classiques tels que l’apprentissage, la réadaptation ou le comportement lié à l’anxiété. L’olfaction est une entrée sensorielle importante pour les souris et peut être utilisée pour la stimulation dans les tests de mémoire et pour l’évaluation de la réaction à la nouveauté. Pour effectuer un test d’habituation disa olfactive, placez l’animal dressé dans la cage de la maison mobile et laissez-le adopter.Pendant 30 minutes, fixez un morceau de coton propre imbibé d’eau du robinet à la paroi intérieure de la cage de la maison mobile à l’aide d’un ruban adhésif double face. Après cinq minutes, remplacez le coton propre sur la paroi de la cage de la maison par un nouveau imbibé d’un liquide contenant l’odeur de vanille. Répétez les expositions de cinq minutes à l’odeur de vanille trois fois avec des intervalles de cinq minutes entre les sessions.Pour mesurer le niveau d’intérêt pour l’odeur. Comptez le temps cumulé que l’animal passe face à la zone cible et le temps total de déplacement de la cage de la maison mobile. Au cours de la cinquième dernière séance, présentez une odeur socialement significative.Mouillez le nouvel applicateur en coton avec quelques gouttes d’urine de souris du sexe opposé. Pour évaluer la réaction à la nouveauté, divisez la cage de la maison mobile en quatre zones. Fixez deux morceaux de coton opposés l’un à l’autre. Couleur.Codez-les avec des marqueurs sur le côté extérieur des murs de la cage lors du premier essai. Placez deux morceaux de coton propres. Remplacez ensuite les deux par du coton imbibé d’un extrait de vanille à 1 %.Au cours du troisième essai, placez le coton à la vanille dans la zone numéro un et le morceau de coton imbibé d’un extrait de banane à 1 % dans la zone. Deuxièmement, pour mesurer la préférence à l’absence d’odeur. Calculez le temps que les animaux passent face à l’absence d’odeur en pourcentage du temps cumulé passé face à d’autres zones.Bonjour, je suis Leo Kiro, chercheur principal au Centre de neurosciences de l’Université d’Helsinki. J’espère que vous avez aimé regarder la vidéo et que vous l’avez trouvée utile. Nous travaillons avec deux sur la microscopie in vivo depuis cinq ans, et l’utilisation de l’esthétique générale et esthétique a toujours été une grande préoccupation parce qu’une esthétique interfère avec la fonction cérébrale, avec la circulation sanguine et tout.Et aujourd’hui, je suis heureux que nous puissions travailler sur des animaux éveillés et réaliser des expériences d’imagerie microscopique stable et valider et vérifier les résultats que nous avions précédemment obtenus chez des animaux anesthésiés. Je suis sûr que l’utilisation de la cage de maison mobile et les méthodes que nous avons présentées aujourd’hui augmenteront la pertinence de la recherche in vivo en général et conduiront à des résultats nouveaux et révolutionnaires, et j’ai hâte d’y être.

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Une procédure est décrite pour la manipulation de l'activité du cortex cérébral neurones pyramidaux optogenetically tandis que l'électroencéphalogramme, électromyogramme, et la concentration de lactate cérébral sont surveillés. Enregistrements expérimentaux sont effectués sur les câbles attachés-souris tandis qu'ils subissent spontanément veille / sommeil cycles. Optogenetic matériel est assemblé dans notre laboratoire, le matériel d'enregistrement est disponible dans le commerce.

Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l&#39;activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs

Ce protocole décrit la conception et l’implantation chirurgicale d’un mécanisme de retenue de la tête pour surveiller l’activité neuronale dans les structures cérébrales sous-corticales chez des rats alertes.  Il décrit des procédures permettant d’isoler des neurones uniques dans la configuration juxtacellulaire et d’identifier efficacement leurs emplacements anatomiques.

Suivi juxtacellulaire et localisation des neurones unique au sein de structures cérébrales sous-corticales d&#39;alerte, Head-Rats retenu

Instructions pour la construction à faible coût et l’implantation chirurgicale d’un montage électroencéphalographique transcrânien chronique à haute densité chez la souris sont fournies. Les techniques d’enregistrement, d’extraction et de traitement du signal sont également décrites.

Haute densité électroencéphalographie Acquisition dans un modèle Rongeur Utilisation de faible coût et Open-source Ressources

Ici, nous présentons une procédure pour effectuer une image à grande échelle Ca 2+ avec une résolution cellulaire à travers de multiples couches corticales chez des souris qui se déplacent librement. Des centaines de cellules actives peuvent être observées simultanément à l'aide d'un microscope à tête miniature couplé à une sonde de prisme implantée.

Multi-couche Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imagerie dans les souris à mouvement libre avec des sondes prisme et microscopie à fluorescence miniaturisée

Un réseau sans fil, système bidirectionnel pour les neurones enregistrements multicanaux et la stimulation en comportement librement des rats est introduit. Le système est léger et compact, ayant ainsi un impact minimal sur le répertoire comportemental du animal´s. En outre, ce système bidirectionnel fournit un outil sophistiqué afin d’évaluer les relations causales entre les modèles d’activation de cerveau et le comportement.

Un réseau sans fil, Interface bidirectionnelle pour In Vivo d’enregistrement et la Stimulation de l’activité neuronale en comportement librement des Rats

Cette étude présente une méthode pour l’enregistrement simultané des potentiels de champs locaux dans le cerveau, les électrocardiogrammes, les électromyogrammes et respiration des signaux d’un rat librement mobile. Cette technique, ce qui réduit les coûts de l’expérimentales et simplifie l’analyse des données, contribuera à la compréhension des interactions entre le cerveau et les organes périphériques.

Enregistrements simultanés des potentiels corticaux champ Local, électrocardiogramme, électromyogramme et respiration rythmique d’un Rat librement mobile

Le protocole présenté ici fournit des informations sur l’électroencéphalographie (EEG) simultanée et l’évaluation comportementale en temps réel. Nous avons discuté de toutes les étapes impliquées dans ce protocole comme une solution attrayante pour les chercheurs dans de nombreux domaines des neurosciences, en particulier dans les domaines de l’apprentissage et de la mémoire.

Surveillance simultanée de l’électrophysiologie sans fil et du test comportemental de la mémoire comme outil pour étudier la neurogenèse de l’hippocampe

Présenté ici est un protocole pour l’implantation d’une fenêtre crânienne chronique pour l’imagerie longitudinale des cellules du cerveau chez des souris éveillées et retenues par la tête.

Implantation d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie in vivo répétée chez des souris éveillées

Nous avons développé une plate-forme unique pour suivre le comportement des animaux lors de deux tâches d’apprentissage associative dépendantes des fibres d’escalade. La conception à faible coût permet l’intégration avec des expériences optogénétiques ou d’imagerie orientées vers l’activité cérébelleuse associée aux fibres grimpantes.

Une plate-forme flexible pour la surveillance de l’apprentissage associatif sensoriel dépendant du cervelet

Une nouvelle procédure détaillée pour l’imagerie fonctionnelle de rats éveillés et fixés à la tête est décrite.

Implants de tête pour la neuroimagerie de rats éveillés fixés à la tête

Le protocole décrit la méthodologie de l’enregistrement extracellulaire dans le cortex moteur (MC) pour révéler les propriétés électrophysiologiques extracellulaires chez les souris conscientes se déplaçant librement, ainsi que l’analyse des données des potentiels de champ locaux (LFP) et des pointes, ce qui est utile pour évaluer l’activité neuronale du réseau sous-jacente aux comportements d’intérêt.

Enregistrement extracellulaire multicanal chez des souris se déplaçant librement

Découvrez une méthode d'imagerie et d'électrophysiologie chez la souris éveillée et en mouvement libre. Cette plateforme sur coussin d'air permet d'étudier l'activité cérébrale dans un environnement familier et moins stressant.

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