Name: Une nouvelle méthode pour localiser rapporteur fluorescent Perles près de la surface de culture cellulaire pour Traction Force Microscopy (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 30 s
Description: Découvrez une méthode pour localiser des microsphères fluorescentes près de la surface de gels de polyacrylamide. Cette technique améliore la microscopie de force de traction cellulaire.

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Les auteurs tiennent à remercier le Programme Initiative interdisciplinaire de l&#39;innovation, de l&#39;Université de l&#39;Illinois, 12035 accorder. SK a été financé à UIUC de la National Science Foundation (NSF) de Grant 0965918 IGERT: Former la prochaine génération de chercheurs en mécanique moléculaire et cellulaire et Bionanotechnology.

La fabrication et la fonctionnalisation des gels d&#39;AP de raideurs des microsphères fluorescentes incorporées à proximité de la surface de culture cellulaire ou moins. 1. fonctionnalisation des Top couvercle en verre glissades <ol><li> Nettoyer les lamelles de verre (# 1.0, 12 mm diam.) Avec de l&#39;eau et du savon, puis par de l&#39;éthanol pour enlever la poussière étrangère. </li><li> Lieu couvercle de verre glisse sur une surface râpée (c.-à-support d&#39;embout de pipette) de telle sorte qu&#39;ils ne se touchent pas pour faciliter l&#39;interaction avec les lamelles. </li><li> Enduire la surface de la couverture glisse avec Poly-D-Lysine (0,1 mg / ml) pendant 1 h (figure 1A). </li><li> Pendant ce temps, effectuer une dilution de 1: 10 000 de la solution de colloïde de 0,1 um de diamètre, les microsphères fluorescentes rouges avec désionisée (DI) de l&#39;eau pour obtenir une densité de particule d&#39;environ 1 pm 20 microsphères par deux sur la surface du gel. Voir la Figure 2 pour les résultats de différentes dilutions. Cette dilution peut être modifié pour répondre aux besoins des expériences spécifiques. </li><li> Placer la solution diluée dans un bain d&#39;eau à ultrasons pendant 30 min. </li><li> Après 1 heure, utiliser des pinces pour soulever soigneusement chaque lamelle et sécher à l&#39;air. Remettre les lamelles sèches à la surface râpé. </li><li> Retirer la solution colloïdale diluée du bain ultrasonique et pipette 150 ul sur chaque lamelle. Laisser reposer 10 min (figure 1B). </li><li> Utilisez des pinces pour soulever soigneusement chaque lamelle et sécher à l&#39;air. Retour la couverture sèche glisse à la surface râpé et magasin dans le noir jusqu&#39;au moment de servir. </li></ol> 2 Préparation PA gel directement sur le verre des boîtes de Pétri de fond <ol><li> Plaque de cuisson Préchauffer le four à 100 ° C. </li><li> Disposez le nombre désiré de fond de verre des boîtes de Pétri (35 mm plat 14 mm micro-bien, # 1.0) sur une surface plane dans une hotte chimique. </li><li> Couvrir la partie en verre de chaque boîte de Pétri micro-bien avec 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane (3 APTES) pendant 7 min pour l&#39;activation chimique. Prenez garde à éviter les entrées par inadvertance des 3-APTES à la surface de la matière plastique dans la boîte de Pétri pour éviter la dégradation du polystyrène. </li><li> Après 7 minutes, remplir la boîte de Pétri avec de l&#39;eau DI et disposer dans un contenant à déchets. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.4 3x pour chaque plat, puis secouez la boîte de Pétri pour éliminer l&#39;eau supplémentaire. Placez les boîtes de Pétri sur la plaque chauffante jusqu&#39;à ce que la partie en verre est sec. </li><li> Retirez les boîtes de Petri de la plaque chaude et revenir à une surface plane dans une hotte chimique. </li><li> Dans une hotte chimique, préparer une solution de glutaraldéhyde à 0,5% et couvrir la partie de verre de chaque boîte de Pétri avec la même solution pendant 30 min. Prendre des précautions pour éviter les entrées par inadvertance du glutaraldéhyde à la surface de la matière plastique dans la boîte de Petri pour éviter la dégradation de la matière plastique. </li><li> Après 30 minutes, remplir la boîte de Pétri avec de l&#39;eau déminéralisée et disposer dans un récipient des déchets de rincer et enlever le glutaraldehyde. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.4 3x pour chaque plat, puis secouez la boîte de Pétri pour éliminer l&#39;eau supplémentaire. Placez les boîtes de Pétri sur la plaque chauffante jusqu&#39;à ce que la partie en verre est sec. </li><li> Avant de mélanger les composants de la solution de gel PA, déplacer les lames de verre fonctionnalisées dans la hotte chimique de telle sorte qu&#39;ils sont facilement accessibles, ce qui permet la prise en sandwich rapide du gel avec le fond de verre des boîtes de Petri après mélange de la solution de gel. </li><li> Dans un tube à centrifuger de 15 ml, mélanger 40% de bisacrylamide, 2% d&#39;acrylamide et d&#39;acide acrylique, en succession immédiate dans les concentrations indiquées dans le tableau 1 (adaptation de protocole publié 10) pour obtenir l&#39;élasticité souhaitée de la matrice. </li><li> Ajouter 100 mM de HEPES, 10% de persulfate d&#39;ammonium et le TEMED en quantités indiquées dans le tableau 1 correspondant à l&#39;élasticité de la matrice souhaitée pour compléter la solution de gel. </li><li> Immédiatement pipette 15 ul de la solution de gélatine sur le centre de la partie en verredes boîtes de Pétri. </li><li> Ramasser immédiatement un verre lamelle fonctionnalisé avec des pincettes. <ol><li> Retourner la lamelle couvre-objet en verre au-dessus de telle sorte que les billes fluorescentes sont sur la prise de contact latéral avec la solution de gel. </li><li> Disposer la lamelle doucement sur ​​le dessus du gel maintenant PA-liquide de telle sorte que le côté fonctionnalisé est en contact avec le gel (Figure 1C). Remarque: Pour de meilleurs résultats, une deuxième personne est recommandé pour le rôle de l&#39;ajout de la lamelle afin d&#39;éviter le risque de polymérisation partielle tandis que le pipetage liquide solution de gel PA sur plusieurs boîtes de Pétri. </li></ol></li><li> Retournez toutes les boîtes de Pétri sur pour aider à éviter les effets de la gravité sur les nanoparticules fluorescentes de polymérisation dans les niveaux inférieurs du gel PA. </li><li> Attendez au moins 35 minutes, ou jusqu&#39;à ce que la solution mère de gel PA a visiblement polymérisé dans son tube de centrifugeuse. </li><li> Retourner les boîtes de Pétri à l&#39;endroit et de les remplir avec du PBS pour aider à enlever la lamelle. </li><li> Faire soigneusement tout contact avec la partie en verre de la boîte de Pétri et le contour de la lamelle, en utilisant des pinces à gratter de la circonférence de la lamelle. Effectuer plusieurs cycles jusqu&#39;à ce que la lamelle est délogé. Retirer la lamelle et éliminer dans un récipient approprié des déchets piquants ou coupants. </li><li> Après avoir retiré toutes les lamelles, perles fluorescentes ont transféré au gel (figure 1D). Couvrir les gels PA complètement avec du PBS, placez le plat couvercle Petri sur chaque plat, et conserver à 4 ° C. </li></ol> 3. fonctionnalisation gel PA avec la fibronectine <ol><li> Préparer les solutions ci-après prémélangés, comme décrit dans un protocole établi 11: solution de trempage (137 mM NaCl, 5% (v / v) de glycerol) et le tampon 2x de conjugaison (0,2 M 2 (N-morpholino) de l&#39;acide éthanesulfonique (MES), 10 % (v / v) de glycerol, pH 4,5). </li><li> Utilisez une pompe à vide dans une hotte biologique pour éliminer tous PBS des plats à fond de verre contenant les gels PA. </li><li> Pipette solution de trempage sur chaque gel tel que le gel est complètement submergé. Incuber à température ambiante pendant au moins 1 heure. </li><li> Chaud 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide chlorhydrate (EDC) et du N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) à température ambiante. </li><li> Mélanger 10x solutions d&#39;EDC (150 mM, 19 mg / ml dans de l&#39;eau DI) et NHS (250 mM, 29 mg / ml dans de l&#39;eau DI). </li><li> Mélanger 1 partie 10x EDC, une partie 10x NHS, 3 pièces d&#39;eau DI, et 5 parties 2x tampon de conjugaison. </li><li> Utilisez une pompe à vide dans une hotte biologique pour éliminer la solution de trempage. Assurez-vous que tout le liquide est enlevé de la surface du gel. </li><li> Ajouter suffisamment de solution NHS / EDC pour couvrir la surface du gel et de remplir le puits de la boîte de Petri (150-250 pi) à fond de verre. Incuber à température ambiante pendant 30 min dans l&#39;obscurité. </li><li> Fibronectine décongeler à température ambiante. Une fois décongelé, mélanger l&#39;eau déminéralisée stérile pour créer un / ml solution de fibronectine 50 pg. </li><li> Utilisez une pompe à vide dans une hotte biologique pour éliminer les solu NHS / EDCtion. Assurez-vous que tout le liquide est enlevé de la surface du gel. </li><li> Ajouter 150 ul de solution de fibronectine à chaque gel. Incuber à température ambiante pendant 35 min pour permettre la fixation de fibronectine. </li><li> Après 35 min, ajouter PBS dans chaque boîte de Pétri et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines. </li></ol> 4 Expérimentations la force de traction <ol><li> Médias chaud de la cellule, du PBS, et de la trypsine à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Rincer gels 5x avec du PBS stérile, aspirer le PBS entre les rinçages, et laissez le à couvert dans la hotte. </li><li> Ajouter 1 ml de trypsine par cm 2 à 25 cellules du flacon contenant. Après que les cellules sont soulevés de ballon, diluer la trypsine avec les médias de cellules et de compter les cellules. Sur la base de la surface de gel, de déterminer le nombre de cellules nécessaires pour gel pour une densité finale de l&#39;ensemencement des cellules de 3.000 cellules / cm 2. Diluer ou concentrer la suspension de telle sorte que 150 ul du mélange cellules-support contient ce nombre de cellules. Aliquotes de 150 pi de suspens cellulairesd&#39;ions sur chaque gel. </li><li> Placez les boîtes de Pétri contenant des cellules dans un incubateur pendant 30 min. Ensuite, retirer soigneusement les boîtes de Pétri et remplir le reste de la boîte de Pétri avec les médias (environ 2 ml) de telle sorte que la surface de la boîte est complètement submergé. </li><li> Placez les boîtes de Pétri dans l&#39;incubateur jusqu&#39;à ce que l&#39;acquisition de l&#39;image. </li><li> Préparez le système d&#39;acquisition microscope et données pour l&#39;imagerie: insérer l&#39;objectif à immersion 40x de l&#39;eau, insérer le contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) prisme, sélectionnez le mCherry ou filtre fluorescent équivalent, et tourner sur la chambre de l&#39;environnement. </li><li> Lorsqu&#39;il est préparé pour l&#39;imagerie, enlevez une boîte de Pétri de l&#39;incubateur et le placer délicatement sur la platine du microscope. Retirez le couvercle plat de Pétri pour l&#39;imagerie DIC. </li><li> Recherchez une seule cellule et capturer une image fixe unique de la cellule en DIC. </li><li> Sans bouger la platine du microscope, changer le mode d&#39;imagerie à fluorescence. Concentrez-vous sur les microsphères fluorescentes et record une image des microsphères. </li><li> Retirez délicatement les médias de la cellule à partir de la boîte de Pétri avec une pipette et ajouter 0,05% de trypsine-EDTA. </li><li> Image, les microsphères sous la cellule après avoir détaché les cellules. </li><li> Utilisation par images de particules (PIV) analyse ImageJ 12 pour calculer le champ de déplacement en raison des forces cellulaires. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

En utilisant cette technique, il est essentiel que la solution de talon est correctement dilué et les perles sont choisies en fonction du diamètre désiré, la rigidité du substrat PA de gel, et l'échelle de la taille des phénomènes qui sont explorées dans l'expérience souhaitée. Il faut être prudent lors de la dilution de la solution de billes avant fonctionnalisation top des lamelles de verre. L'espacement entre les billes sur la surface du gel peut être modifiée en changeant le facteur de d...

L&#39;interaction mécanique d&#39;une cellule vivante avec son environnement local a souvent été étudiée en utilisant des gels de l&#39;AP. Ces substrats reposent sur ​​un protocole simple et bien établi caractérisé par Wang et Dembo en 1997 1. L&#39;un des principaux avantages de ces substrats est que leur rigidité peut être ajustée en modifiant les concentrations des composants spécifiques de la solution de gel. Ceci fournit une plate-forme souhaitable d&#39;étudier l&#39;interaction des cellules avec des environnements de rigidités différentes. Lorsque gels PA sont recouvertes d&#39;matrice extracellulaire de protéines (ECM), les cellules adhèrent à eux, de génération de force. En raison de la force de la cellule, le gel se déforme comme un corps élastique. Cette déformation dépend de la grandeur de la force appliquée par les cellules et les propriétés élastiques du gel. Diverses études ont utilisé des gels PA pour enquêter sur les forces de traction cellulaires. Dans une variante de PA gel fabrication, microsphères fluorescentes (perles) sont intégrés tout au long de gel de quantifier les forces de traction cellulaire sur des gels de différentes rigidités 2. Lors de l&#39;application de la force de la cellule, les billes déplacent à partir de leur position initiale après une déformation de gel. Le champ de déformation est mesurée à partir des déplacements individuels de talons. Cette zone de déformation est utilisé par la théorie de l&#39;élasticité et les propriétés élastiques du gel de calculer les forces de traction. Ces mesures permettent de mieux comprendre la façon dont les cellules détectent et interagissent avec leur micro-environnement local 3 mécaniquement. Dans de nombreux protocoles gel de fabrication largement utilisées PA, les perles sont mélangées à travers le gel PA dans son état liquide, non polymérisé. Un gel PA entièrement polymérisé contient des billes fluorescentes dans tout son volume. Lorsque le calcul de forces de traction de la cellule, la plupart des perles près de la surface du gel (de l&#39;interface cellule-substrat) sont surveillés. Les déplacements de ces billes sont supposées se produire sur la surface de culture cellulaire pour la simplicité de la force CALCULn. La position réelle des perles au sein de la profondeur du gel n&#39;est pas respectée. Cependant, dans un milieu élastique (tel que le gel PA), un cordon plus proche d&#39;un point d&#39;application de la force se déplace plus d&#39;un bourrelet qui est plus éloignée de la pointe. Ainsi, le traitement du déplacement d&#39;un point (à l&#39;emplacement du bourrelet) distale par rapport à la surface que celle de la surface conduit à une sous-estimation des tractions cellulaires. Le degré d&#39;erreur dépend de la distance de la bille à partir de la surface. L&#39;erreur ne peut être estimée à l&#39;insu de l&#39;emplacement du cordon. Le besoin d&#39;une méthode simple pour limiter les perles très près de la surface de culture cellulaire a été traitée par plusieurs techniques. Un moyen consiste à augmenter la densité des billes de gel tout au long de telle sorte qu&#39;il y ait un nombre suffisant de billes dans le plan focal supérieur à mesurer le mouvement très près de la surface. Une autre technique consiste à construire une chambre d&#39;imagerie confocal pour l&#39;imagerie des cellules vivantes de telle sorte que la lumière provenant deseules les billes dans le plan focal le plus supérieur est recueilli 4. Une autre méthode consiste à superposer une couche extrêmement mince de gel PA contenant des billes sur le dessus d&#39;un gel déjà polymérisé sans billes 5. Un inconvénient de chacune de ces techniques est que l&#39;emplacement précis des billes dans le gel n&#39;est pas connue. Cela introduit une erreur dans le calcul du champ de déplacement des billes, et donc le calcul des forces de cellules. Une autre technique consiste à conjugaison de billes à la surface supérieure d&#39;un gel PA déjà polymérisé en utilisant sulfo-SANPAH 6. Cette technique assure les billes sont en effet uniquement sur la partie supérieure du gel PA, mais la mesure dans laquelle elles sont noyées dans l&#39;épaisseur du gel est inconnu. Cela pourrait créer une topographie locale pour les cellules, ce qui pourrait modifier le comportement de la cellule, comme un travail préalable a suggéré que les cellules peuvent sentir la force de quelques microns de distance 7. Récemment, une technique de structuration gels PA avec 1 um de diamètre fluorescent marqueurs fibronectine de points dans un tableau régularisée a été créé 8. Dans ce cas, la profondeur des marqueurs fluorescents est connu, et est pratiquement nul, car le motif de la fibronectine est indirectement imprimé sur la surface du gel. Cependant, cette méthode ne fournit pas un environnement continu sur lequel les cellules peuvent se fixer, comme la protéine d&#39;ECM est limitée à 1 um de diamètre des points. Une méthode pour intégrer pleinement les perles tracker dans des gels d&#39;AP et les confiner dans un endroit connu de très près de la surface n&#39;a pas encore été établie. Ici, on développe une technique pour contraindre sous-um de diamètre de billes fluorescentes um à un plan focal à proximité de la surface de culture cellulaire à l&#39;intérieur de gel PA. Un gel est habituellement durci par solution en sandwich de gel liquide non polymérisé entre deux plaques de verre. Une des plaques est fonctionnalisé de sorte que le gel adhère fortement à elle. L&#39;autre est non fonctionnalisé et est retiré après les cures de gel. Nous modifions ce verre amovible surface en le revêtant avec une couche de billes. Lors de la prise en sandwich entre le gel liquide fonctionnalisé et la surface de verre revêtue de talon, le transfert des billes de gel pendant qu&#39;il durcit. Cela limite la distance de l&#39;intégration des perles dans le gel à 1,6 um de la surface. Plats de Pétri à fond de verre sont utilisés en tant que la surface adhérente sur laquelle le gel est durci. Pour former une surface supérieure plate de gel au cours de la polymérisation, une lamelle circulaire de verre est utilisé pour prendre en sandwich le gel de la boîte de Pétri à fond de verre. Avant de gel fabrication, le couvercle en verre haut glissement est recouvert de poly-D-lysine (PDL), ce qui donne une charge de surface positive. Le PDL est soufflé avec de l&#39;air comprimé, et une solution de billes dans l&#39;eau est déposée sur les lamelles. Nous utilisons des microbilles fluorescentes carboxyles, qui portent une charge négative, et d&#39;interagir avec la surface chargée positivement créé par traitement avec PDL. Après soufflage de la solution de talon de la lamelle couvre-objet avec de l&#39;air comprimé, une seule couche deperles demeure électrostatique couplé à la lamelle sec. Le revêtement PDL n&#39;affecte pas l&#39;adhérence du verre à la surface du gel, comme les lames de verre sont en bon état et présente dans le gel PA intact. Les boîtes de Pétri à fond de verre sont faites adhérente par un traitement avec 97% de 3-aminopropyl-trimethoxysliane et 0,5% de glutaraldéhyde. Gels PA de rigidités souhaités sont créés en mélangeant des concentrations appropriées de bisacrylamide et d&#39;acrylamide par une procédure standard 9. Une goutte de la solution de gel est introduit à la pipette sur la boîte de Pétri à fond de verre. La lamelle couvre-objet en verre contenant les billes est utilisé pour prendre en sandwich le gel de la boîte de Pétri. Lorsque le gel est durci, le couvercle supérieur est enlevé, laissant glisser les perles noyées dans le gel à l&#39;intérieur de PA 1,6 um à partir de la surface.

<table><tr><tbody><td colspan="4"><fort>réactifs</fort>97</td></tr><tr><td> % 3-aminopropyl-triméthoxysliane (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>70 % Glutaraldehyde</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES solution tampon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>40 % Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>2 % Bisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>0.1 &micro ; m Microsphères fluorescentes (mCherry)</td><td>Invitrogen</td><td>F8801</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine humaine, 1 mg</td><td>BD Biosciences</td> 354008 Persulfate <td>d’ammonium</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-RAD</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl]carbodiimide (EDC)&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Acide acrylique&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>147230</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>Acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>35 mm Plat à fond en verre avec verre de couverture à micro-puits #1 de 14 mm</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-14-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles de protection en verre, 12 mm diam. </td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>Référence 26023</td><td></td></tr></tbody></table>

une nouvelle méthode pour localiser rapporteur fluorescent perles près de la surface de culture cellulaire pour traction force microscopy

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Gels PA ont longtemps été utilisés comme une plate-forme pour étudier les forces de traction cellulaire raison de la facilité de fabrication et la capacité d&#39;ajuster leurs propriétés élastiques. Lorsque le substrat est revêtu d&#39;une protéine de la matrice extracellulaire, les cellules adhèrent au gel et appliquent des forces, ce qui provoque le gel de se déformer. La déformation dépend de la traction de la cellule et les propriétés élastiques du gel. Si le champ de la surface de déformation est connu, la traction de la surface peut être calculée en utilisant la théorie de l&#39;élasticité. Gel de déformation est généralement mesurée par incorporation de perles de marqueur fluorescent uniformément dans le gel. Les sondes déplacent que le gel se déforme. Les sondes proches de la surface du gel sont suivies. Les déplacements signalés par ces sondes sont considérés comme des déplacements de surface. Leurs profondeurs de la surface sont ignorés. Cette hypothèse introduit une erreur dans l&#39;évaluation de la force de traction. Pour une mesure précise des forces de cellules, il est essentiel que l&#39;emplacement des billes, qui sera appelée. Nous avons développéune technique qui utilise la chimie simple de limiter les perles de marqueurs fluorescents, 0,1 et 1 pm de diamètre, dans des gels d&#39;AP, à l&#39;intérieur de 1,6 pm de la surface. On couche une lamelle couvre-objet avec du poly-D-lysine (PDL) et des billes fluorescentes. Solution de gel PA est alors pris en sandwich entre la lamelle et une surface adhérente. Les billes fluorescentes pour transférer la solution de gel au cours du durcissement. Après polymérisation, le gel contient des billes fluorescentes PA sur un plan proche de la surface du gel.

L'imagerie confocale a été utilisé pour déterminer que les billes sont bien en dessous de la surface du gel et de quantifier leur localisation précise dans la profondeur de gel. Des billes fluorescentes de longueur d'onde différente de celle à l'intérieur du gel ont été autorisés à se déposer sur la surface, et la distance entre les nanoparticules fluorescentes incorporées et celles sur la surface a été calculée en utilisant un algorithme d'identification du centre de gravité. L'emplacement de la bille sur la surface du...

Les techniques traditionnelles de fabrication de polyacrylamide (PA) des gels contenant des sondes fluorescentes consistent en sandwich un gel entre une surface adhérente et une lame de verre. Ici, nous montrons que le revêtement de cette lame avec la poly-D-lysine (PDL) et des sondes fluorescentes localise les sondes à l&#39;intérieur de 1,6 um à partir de la surface du gel.

Une nouvelle méthode pour localiser rapporteur fluorescent Perles près de la surface de culture cellulaire pour Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

L’objectif global de cette procédure est de fabriquer des gels de polyacrylamide ou de PA pour la culture cellulaire avec des microsphères fluorescentes intégrées très près de la surface du gel. Ceci est accompli en fonctionnalisant d’abord les lamelles de verre avec de la poly D lysine. La deuxième étape consiste à enduire les lamelles de verre d’une solution contenant des microsphères fluorescentes.Ensuite, les gels PA sont formulés en mélangeant des concentrations appropriées de bis, d’acrylamide et d’acrylamide, et pris en sandwich entre une surface sous-jacente et le côté fonctionnalisé des lamelles de recouvrement en verre. La dernière étape consiste à fonctionnaliser le gel avec une protéine de matrice extracellulaire et des cellules de culture à la surface du gel. En fin de compte, la microscopie à force de traction est utilisée pour mesurer les forces mécaniques exercées par les cellules à la suite de la déformation du substrat induite par les cellules.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la fabrication traditionnelle de PHL, est qu’elle localise les microsphères fluorescentes à un endroit connu dans la profondeur du gel, ce qui permet un calcul plus précis des forces de traction cellulaires. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car un durcissement spatial doit être effectué lors de la fonctionnalisation des lamelles de recouvrement en verre afin de garantir le transfert correct des bits de fluorescence vers le premier lieu de la PHL. Le couvercle en verre précédemment nettoyé glisse sur une surface râpée de sorte qu’il ne se touche pas.Pour faciliter l’interaction avec les lamelles, enduire toute la surface des lamelles avec 0,1 milligramme par millilitre de lysine poly D pendant une heure. Pendant ce temps, effectuez une dilution de un à 10 000 de la solution colloïdale de 0,1 micromètre de diamètre. Microsphères fluorescentes rouges avec de l’eau déminéralisée pour obtenir une densité de particules d’environ une microsphère par 20 microns carrés à la surface du gel.Placez la solution diluée dans un bain-marie à ultrasons pendant 30 minutes. Au bout d’une heure, à l’aide d’une pince à épiler, soulevez délicatement chaque lamelle et séchez-la à l’air. Remettez ensuite les lamelles sèches sur la surface râpée.Une fois que la solution colloïdale diluée a été retirée du bain à ultrasons, pipetez 150 microlitres de la solution sur chaque lamelle. Après 10 minutes, utilisez une pince à épiler pour soulever délicatement chaque lamelle et séchez-la à l’air. Une fois que les lamelles sèches ont été remises sur la surface nivelée, rangez-les dans l’obscurité jusqu’au moment de l’utiliser.Ensuite, disposez le nombre souhaité de boîtes de Pétri à fond de verre sur une surface plane dans une hotte chimique. Couvrez la portion en verre de chaque boîte de Pétri. Micro puits avec 97 % de trois amino propyl triméthyle pendant sept minutes pour l’activation chimique.Après sept minutes, remplissez la boîte de Pétri avec de l’eau désionisée et jetez la solution dans un récipient à déchets. Couvrez soigneusement la portion en verre de chaque boîte de Pétri. Eh bien, avec une solution de glutaraldéhyde à 0,5 % préalablement préparée pendant 30 minutes.Après 30 minutes, remplissez la boîte de Pétri avec de l’eau déminéralisée et jetez-la dans un récipient à déchets pour rincer et retirer la peau du glutaraldéhyde. Avant de mélanger les composants de la solution de gel de polyacrylamide, déplacez les lames de verre fonctionnalisées dans la hotte chimique de manière à ce qu’elles soient facilement accessibles, ce qui permet de prendre rapidement en sandwich le gel avec les boîtes de Pétri à fond de verre. Après avoir mélangé la solution de gel dans un tube à centrifuger de 15 millilitres, mélangez 40 % d’acrylamide bis, 2 % d’acrylamide et de l’acide acrylique en succession immédiate.Pour obtenir l’élasticité matricielle souhaitée, ajoutez ensuite 100 HEP millimolaires, 10 % d’ammonium par sulfate, et associez-les en quantités correspondant à l’élasticité matricielle souhaitée. Pour compléter la solution gélifiée, pipetez immédiatement 15 microlitres de solution de gel au centre de la partie en verre des boîtes de Pétri. Après avoir ramassé une lamelle en verre fonctionnalisé à l’aide d’une pince à épiler, retournez-la de manière à ce que les billes fluorescentes soient sur le côté et entrent en contact avec la solution de gel.Posez ensuite délicatement la lamelle sur le gel de polyacrylamide maintenant liquide de sorte que le côté fonctionnalisé soit en contact avec le gel. Ensuite, retournez toutes les boîtes de Pétri pour éviter les effets de gravité sur les nanoparticules fluorescentes. Polymérisation en niveaux inférieurs de gel de polyacrylamide.Après la polymérisation, retournez les boîtes de Pétri et remplissez-les de BS. Prenez soin de toucher la partie en verre de la boîte de Pétri et le contour de la gaine à l’aide d’une pince à épiler pour gratter la circonférence de la lamelle. Après plusieurs cycles de grattage. Retirez la lamelle et jetez-la dans un contenant approprié pour les déchets tranchants.Après avoir retiré toutes les lamelles, placez le couvercle de la boîte de Pétri sur chaque plat et conservez-le à quatre degrés Celsius. Une fois que les gels de polyacrylamide sont chauds à température ambiante, utilisez une pompe à vide dans une hotte biologique pour retirer tout le PBS des plats à fond de verre contenant les gels, pipetez la solution de trempage préalablement préparée sur chaque gel de sorte que le gel soit complètement immergé. Après l’incubation à température ambiante pendant au moins une heure, ajoutez 150 à 250 microlitres d’une solution H-S-E-D-C préalablement préparée pour couvrir la surface du gel et bien remplir le fond en verre de la boîte de Pétri.Ensuite, incubez les gels à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité. Une fois que la solution N-H-S-E-D-C a été retirée sous vide, ajoutez 150 microlitres d’une solution de fibronectine préalablement préparée à chaque gel. Encore une fois, incubez à température ambiante pendant 35 minutes pour permettre la fixation de la fibronectine.À ce stade, réchauffez le PBS et la trypsine à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau. Rincez les gels cinq fois avec de l’eau déminéralisée stérile. En aspirant l’eau entre les rinçages, couvrez les gels en les laissant dans la capuche.Ajouter un millilitre de trypsine par 25 centimètres carrés dans la fiole contenant les cellules. Une fois les cellules retirées du ballon, diluez la trypsine avec un milieu cellulaire. Comptez ensuite les cellules à l’aide d’un hémocytomètre basé sur la surface du gel.Déterminez le nombre de cellules nécessaires par gel pour une densité finale de 3000 cellules par centimètre carré, diluez ou concentrez la suspension de manière à ce que 150 microlitres du mélange de milieux cellulaires contiennent ce nombre de cellules. Ensuite, Eloqua injecte 50 microlitres de suspension cellulaire sur chaque gel. Suite à ce lieu, les boîtes de Pétri contenant des cellules dans un incubateur pendant 30 minutes.Après avoir soigneusement retiré les boîtes de Pétri de l’incubateur, remplissez le reste de la boîte de Pétri avec environ deux millilitres de milieu de sorte que la surface de la boîte soit complètement immergée. Remettez les boîtes de Pétri dans l’incubateur jusqu’à l’acquisition de l’image. Une fois prêt pour l’imagerie, placez délicatement l’une des boîtes de Pétri sur la platine du microscope.Après avoir retiré le couvercle de la boîte de Pétri pour l’imagerie DIC, localisez une seule cellule et capturez une seule image fixe de la cellule en DIC sans déplacer la platine du microscope. Basculez le mode d’imagerie sur la fluorescence. Concentrez-vous sur les microsphères fluorescentes et enregistrez une image des microsphères.Retirez délicatement le milieu cellulaire de la boîte de Pétri à l’aide de la pipette et ajoutez 0,05 % de trypsine EDTA. Concentrez-vous sur l’image DIC pour montrer le gel dont la cellule s’est maintenant détachée. Ensuite, imagez les microsphères sous la cellule après que les cellules se sont détachées.L’imagerie confocale a été utilisée pour déterminer que les billes se trouvaient sous la surface du gel et pour quantifier leur emplacement précis, des billes fluorescentes d’une taille et d’une longueur d’onde différentes de celles à l’intérieur du gel ont été autorisées à se déposer sur la surface. L’emplacement des billes déposées sert de référence pour la surface supérieure du gel où les cellules appliquent une force lors de l’adhésion. Après l’imagerie confocale, la distance entre les nanoparticules fluorescentes intégrées et celles à la surface a été calculée.Cette distance déterminait la profondeur précise des billes à l’intérieur du gel. La représentation ici est la distribution spatiale des billes et la vue projetée sur le plan YZ. L’échelle fournit la profondeur de toutes les billes de la surface du gel.La profondeur moyenne des billes de 0,1 micron est de 619 nanomètres, 467 nanomètres, 278 nanomètres pour les gels de poly acrylamide de rigidité un, 10 et 40 kilopascals respectivement. Les profondeurs correspondantes pour des billes d’un micron de diamètre sont de moins 20 nanomètres dans les gels de 40 kilopascals, de 12 nanomètres dans les gels de 10 kilopascals et de 1 255 nanomètres dans les gels d’un kilopascal. La profondeur des billes dispersées dans le gel a été mesurée et comparée aux profondeurs.En utilisant la technique présentée. La variabilité de la dispersion des billes dans la profondeur d’un gel de polyacrylamide à l’aide de méthodes de fabrication traditionnelles est illustrée ici. Le champ de déplacement d’une cellule de fibroblaste et la couche de billes fluorescentes correspondante sont illustrés ici.Les perles situées près de la périphérie de l’image apparaissent légèrement floues, ce qui est un effet optique dû à l’objectif d’immersion dans l’eau. Lors de l’ajout de trypsine, la cellule est libérée de la surface, ce qui fait que la surface déformée du gel de polyacrylamide revient à son état d’origine. Une fois maîtrisée, cette technique de fabrication et de fonctionnalisation des PHL peut être réalisée en six heures si elle est correctement exécutée.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication de gels de polyacrylamide avec des microsphères fluorescentes, localisées à un endroit connu dans la profondeur du gel près de la surface de la culture cellulaire. Pour un calcul plus précis des forces de traction des cellules.

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