Name: Utilisation de lEssai de superposition pour mesurer qualitativement la production bactérienne et la sensibilité à pneumocoque bactériocines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Apprenez à utiliser l'essai de superposition pour visualiser l'activité des bactériocines chez Streptococcus pneumoniae. Cette méthode permet de caractériser rapidement l'activité antimicrobienne et la sensibilité des souches.

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Ce travail a été soutenu par le prix de recherche Elizabeth E. Kennedy.

1 Préparation du producteur Strain <ol><li> Déposer sur une souche pneumococcique à tester pour la production des bactériocines sur un sang de mouton soja tryptique plaque de gélose de 5% à partir de -80 ° C les stocks de congélation. NOTE: L&#39;utilisation de plaques de sang pour la croissance initiale de la souche à tester pour l&#39;inhibition augmente considérablement la reproductibilité du dosage. En outre, d&#39;autres souches non-pneumococciques qui produisent des bactériocines peuvent être utilisés même si les conditions de croissance peuvent avoir besoin d&#39;être modifié pour un organisme spécifique. Nous avons utilisé Streptococcus mitis et Lactococcus lactis dans le test de superposition avec succès. </li><li> Incuber la plaque pendant une nuit (O / N) à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Après incubation de la souche productrice, préparer la plaque de gélose de soja trypsique (TSA) par pipetage de 3000 à 4000 unités de catalase sur des plaques contenant 25 ml de TSA et propager la solution de catalase à l&#39;aide de billes de verre stériles. Laissez la plaque sécher pendant environ 10 minutes sousune enceinte de sécurité biologique. </li><li> Recueillir une quantité visible de bactéries sur une pointe de pipette. Poignarder la pointe de la pipette dans la plaque TSA séché. NOTE: Plus d&#39;une souche productrice peut être poignardé dans une seule plaque TSA. Il est important d&#39;espacer les coups de sorte que des halos résultant ne se chevauchent pas. <ol><li> Si possible, les bactériocine producteur connu en tant que témoin positif et la souche à être utilisés dans la superposition en tant que contrôle négatif. REMARQUE: Les contrôles positifs et négatifs sont déjà publiées et sont disponibles sur demande 10. </li></ol></li><li> Incuber la plaque TSA contenant de multiples coups de couteau à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 6 heures. </li></ol> 2. la constitution de stocks de glycérol de la souche Overlay <ol><li> Préparation des stocks de glycerol (cultures cultivées jusqu&#39;à la phase mi-exponentielle et ensuite stockés à -80 ° C après addition de glycerol) avant le jour de l&#39;essai d&#39;incrustation. Inoculer 5-10 colonies de str pneumocoqueain à tester pour la sensibilité ou de la sécrétion de phéromone dans un milieu Todd-Hewitt avec 0,5% d&#39;extrait de levure (THY). REMARQUE: Construction de BLPC journalistes inductibles a été décrit précédemment et 2 souches sont disponibles sur demande. </li><li> Incuber 5-10 colonies dans des tubes de verre de 5 ml de THY avec couvercles bien fermés dans un bain d&#39;eau à 37 ° sans agitation. </li><li> Incuber les cultures à 37 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;elles atteignent une DO 620 de 0,3 à 0,5. NOTE: Cela prendra environ 4-5 heures en fonction de la souche utilisée. <ol><li> Retourner doucement le tube à quelques reprises avant de mesure de la DO. </li></ol></li><li> Si l&#39;essai ne peut pas être effectuée de la même journée ou de la souche sera utilisé plusieurs fois dans le futur, faire des stocks de glycerol et reprendre l&#39;expérience à une date ultérieure. Pour les stocks de glycerol, le glycerol ajouter aux cultures à une concentration finale de 20%. cultures aliquotes de 1,5 ml dans des microtubes et conserver à -80 ° C. NOTE: Les échantillons peuvent être sTored pendant des mois à -80 ° C. Si ce n&#39;est pas la constitution de stocks de glycérol, utilisez des échantillons directement pour le dosage de recouvrement. </li></ol> 3 Essai de superposition <ol><li> Juste avant de superposer l&#39;application, mélanger les composants de superposition. Dans un tube conique de 15 ml, ajouter 5 ml de THY, 3000-4000 U de catalase, et 200 pi de la culture de bouillon de souche de recouvrement qui a été soit cultivé ce jour-là ou un stock de glycérol de la culture qui a été décongelé à température ambiante. Si l&#39;on utilise la souche rapporteuse, ajouter 50 ul de X-gal (40 mg / ml) au mélange de revêtement. Utilisez un tube conique par plaque. </li><li> Equilibrer mélange superposition à la température ambiante avant l&#39;addition de fusion TSA. </li><li> Retirer la plaque TSA avec la souche poignardé de l&#39;incubateur. Faire fondre le solide TSA en ondes et le garder à 55 ° C bain d&#39;eau jusqu&#39;au moment de servir. Ajouter 3 ml de TSA fondu avec 1,5% de gélose refroidie à 55 ° C pour recouvrir mélange. <ol><li> Préparer le mélange immédiatement avant le revêtement de pipetage, le mélange commence à se solidifier trèsrapidement. REMARQUE: Si le revêtement commence à se solidifier avant le placage, les résultats seront impossibles à interpréter. </li></ol></li><li> Mélanger le mélange de recouvrement par aspiration et à plusieurs reprises avec une pipette 5 ml en faisant attention de ne pas introduire de bulles dans le mélange. Pipette lentement le mélange de recouvrement directement sur la plaque TSA poignardé. Conservez la plaque sur la paillasse pendant quelques minutes pour permettre l&#39;agar durcir. <ol><li> Ne pas faire pivoter la plaque de distribuer le mélange de recouvrement, ce qui ralentira la croissance de la culture poignardé dans la superposition. </li></ol></li><li> Placer soigneusement la plaque TSA avec superposition en 37 ° C incubateur contenant 5% de CO 2 O / N (environ 16-18 h). </li><li> Respecter les plaques après une nuit de croissance. Les plaques doivent apparaître opaque à partir de la croissance de la souche de recouvrement sauf dans des zones où l&#39;inhibition de la signalisation ou de la phéromone a eu lieu. Ils apparaissent comme des zones soit clair ou bleu autour de la souche poignardé, respectivement. NOTE: Bien que mesurements du diamètre de compensation bleu ou peuvent être déterminées pour l&#39;évaluation quantitative, les différences de diamètre peuvent également varier en fonction de la quantité de bactéries qui a été enfoncée dans la plaque. Le test de superposition est un test qualitatif, une évaluation quantitative doit être interprétée avec prudence. Toute compensation visible par rapport au témoin négatif est considérée comme l&#39;activité. </li></ol>

<ol><li>Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blp+bacteriocins+of+Streptococcus+pneumoniae+mediate+intraspecies+competition+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo.</a> Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).</li>
<li>Sawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+enterocin+W%2C+a+novel+two-peptide+lantibiotic+produced+by+Enterococcus+faecalis+NKR-4-1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).</li>
<li>Kochan, T. J., Dawid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HtrA+protease+of+Streptococcus+pneumoniae+controls+density-dependent+stimulation+of+the+bacteriocin+blp+locus+via+disruption+of+pheromone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion.</a> J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).</li>
<li>Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+bacteriocins+and+activity+spectrum+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae.</a> J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).</li>
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<li>Saizieu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+identification+of+a+novel+Streptococcus+pneumoniae+regulon+controlled+by+an+autoinduced+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide.</a> J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).</li>
<li>Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+production%2C+purification%2C+characterization+and+mechanism+of+action+of+salivaricin+9+lantibiotic+produced+by+Streptococcus+salivarius+NU10%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10.</a> PLoS One. 8 (10), 77751(2013).</li>
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<li>Shea, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactofencin+a%2C+a+new+type+of+cationic+bacteriocin+with+unusual+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity.</a> 4 (6), 00498-00413 (2013).</li>
<li>Son, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mutations+in+the+pneumococcal+bacteriocin+transporter+gene%2C+blpA%2C+result+in+a+complex+population+consisting+of+producers+and+cheaters%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li>
<li>Kochan, T. J., Dawid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HtrA+protease+of+Streptococcus+pneumoniae+controls+density-dependent+stimulation+of+the+bacteriocin+blp+locus+via+disruption+of+pheromone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion.</a> J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).</li>
<li>Widdick, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+engineering+of+the+cinnamycin+biosynthetic+gene+cluster+from+Streptomyces+cinnamoneus+cinnamoneus+DSM+40005%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).</li>
<li>Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+two-peptide+lantibiotic%2C+lichenicidin%2C+following+rational+genome+mining+for+LanM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce test de superposition est un moyen rapide de déterminer l&#39;étendue des activités des producteurs de bactériocines et de démontrer les interactions compétitives qui peuvent survenir entre les souches de pneumocoques. Le dosage de recouvrement peut être adapté pour utiliser pour le criblage de souches multiples pour la production de bactériocine sur une seule plaque. Nous avons passé au crible avec succès de grandes collections de souches avec ce dosage en utilisant un duplicateur de 48 broches pour inoculer plaques...

Streptococcus pneumoniae, un colonisateur commun de la communauté polymicrobien du nasopharynx, est en mesure de rivaliser avec d&#39;autres pneumocoques et des espèces étroitement apparentées par la production de peptides antimicrobiens produits par des bactéries (des bactériocines). Chaque souche pneumococcique entièrement séquencé examiné à ce jour contient une version de la b acteriocin- l ike p eptide lieu, blp. Production de bactériocine par le pneumocoque a été démontré un rôle important dans les résultats de la fois in vitro et in vivo à concurrence de 1 à 4. Dynamique de compétition sont influencés par l&#39;expression de diverses protéines ainsi que les bactériocines de l&#39;immunité apparentées en réponse à une phéromone peptide spécifique. L&#39;induction de la BLP locus est commandé par un système de détection de quorum dans lequel une phéromone peptidique, BLPC, se lie à la kinase de capteur, BlpH, et initie une cascade de signalisation aboutissant à latranscription du locus 5,6 blp. Il ya quatre variations alléliques de BLPC qui lient chacun à sa BlpH apparenté 6. Pour la cellule de survivre aux effets de son propre bactériocine, les gènes qui codent pour des protéines apparentées à l&#39;immunité sont transcrits sur le même opéron que chacun des gènes des bactériocines. Tuer se produit si une souche de compétiteur n&#39;est pas en mesure de réguler à la hausse le locus blp en réponse à la phéromone ou exogènes, si la souche est dépourvue du gène de l&#39;immunité spécifique requis pour la protection. Le complexe de transporteur, BlpAB est requis pour la sécrétion et le traitement de la phéromone de peptides et les peptides de bactériocines 2,4. Récemment, il a été montré qu&#39;une proportion importante des souches de pneumocoques sont les &quot;tricheurs&quot; qui signifie qu&#39;ils ont une mutation dans le gène conservé APLE qui les rend incapables de sécréter des phéromones et des bactériocines 1,2. Ces souches sont capables de répondre à BLPC exogène 2 sécrétée par hennissementsouches de perçage permettant la production de protéines d&#39;immunité. Bien que, préparations brutes de bactériocines de surnageants peuvent être préparés à partir de souches de producteurs utilisant des méthodes biochimiques étapes pour atteindre la pureté, cette approche n&#39;est pas utile pour le criblage de grandes collections d&#39;isolats et si le niveau d&#39;expression des bactériocines est faible dans le bouillon cultivé cultures 2,7- 9. Le test de recouvrement est utilisé comme un moyen rapide pour étudier la dynamique de concurrence entre les souches qui peuvent exister in vitro. Pour ce faire, une souche pneumococcique est pré-inoculées sur une plaque de gélose et on a laissé croître pour atteindre des concentrations bactériennes locales suffisantes pour l&#39;induction de la BLP locus. Une seconde souche est ensuite inoculée dans une solution d&#39;agar mou fondu qui est ensuite appliqué sur la souche pré-inoculé à tester pour la sensibilité. Pour évaluer l&#39;activité du locus blp (indépendante de l&#39;activité inhibitrice), les souches peuvent être superposées avec une série de three souches rapporteurs BLPC décrites précédemment. Ces souches ont été construites pour contenir l&#39;un des trois allèles blpH différents qui répondent aux trois phéromones les plus courantes BLPC sécrétées par le pneumocoque. Les souches rapporteurs ont un gène lacZ intégré qui est sous le contrôle d&#39;un promoteur dépendant de BlpH et portent une délétion dans le gène qui prévient BLPC auto-stimulation 10,11.

<table><tbody><tr><td>Gélose de soja trypticase avec 5</td> % de sang <td>de mouton Fisher</td><td>B21261X</td><td>Pour la croissance à partir de cultures congelées</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C100-500mg</td><td>4 741 unités par assiette</td></tr><tr><td>Todd Hewitt Bouillon + extrait de levure (THY)</td><td>Fisher</td><td>DF0492-17-6&nbsp ;</td><td>30 g de THB, 5 g d’extrait de levure, 1 L ddH2O d’autoclave</td></tr><tr><td>Bouillon de soja trypticase + assiettes de gélose (TSA)</td><td>Fisher</td><td>B11768&nbsp ;</td><td>30 g de TS, 15 g d’agar, 1 L d’autoclave ddH2O</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &beta ;-D-galactopyranoside (X-gal)</td><td>Sigma</td><td>B4252-50MG</td><td>Dissoudre dans des boîtes de Pétri de diméthylformamide</td></tr><tr><td>Spectrophomètre</td><td></td><td></td> Fisher FB0875712 <td>Mesure la DO 620 des cultures</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 37 &deg ;<td></td></tr><tr><td> C bain-marie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg ; Incubateur C avec 5 % de CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube</td><td></td><td></td><td></td> conique de 15 ml</tr></tbody></table>

utilisation de l&#39;essai de superposition pour mesurer qualitativement la production bactérienne et la sensibilité à pneumocoque bactériocines

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonise la communauté polymicrobienne très diversifiée du nasopharynx où il doit rivaliser avec les organismes résidents. Nous avons montré que les peptides antimicrobiens produits par des bactéries (bactériocines) dictent le résultat de ces interactions compétitives. Toutes les souches de pneumocoques entièrement séquencées hébergent un locus bacteriocin-l ike peptide (blp). Le locus blp code pour une gamme de bactériocines diverses et tous les composants hautement conservés nécessaires à leur régulation, leur traitement et leur sécrétion. La diversité des bactériocines présentes dans la région d’immunité à la bactériocine (BIR) du locus est un contributeur majeur de la compétition pneumococcique. Avec les bactériocines, les gènes d’immunité se trouvent dans le BIR et sont nécessaires pour protéger la cellule productrice des effets de sa propre bactériocine. Le test de superposition est une méthode rapide pour examiner un grand nombre de souches à la recherche d’interactions compétitives médiées par des bactériocines. Le test de superposition permet également de caractériser l’immunité spécifique à la bactériocine et de détecter les peptides de détection du quorum sécrétés. L’essai est effectué en pré-inoculant une plaque de gélose avec une souche à tester pour la production de bactériocine, suivie de l’application d’une couche de gélose molle contenant une souche à tester pour la sensibilité à la bactériocine. Une zone de clairance entourant le stab indique que la souche de recouvrement est sensible aux bactériocines produites par la souche pré-inoculée. Si aucune zone de clairance n’est observée, soit la souche de recouvrement est immunisée contre les bactériocines produites, soit la souche pré-inoculée ne produit pas de bactériocines. Pour déterminer si le locus blp est fonctionnel dans une souche donnée, le test de superposition peut être adapté pour évaluer la sécrétion de phéromones peptidiques par la souche pré-inoculée. Dans ce cas, une série de quatre souches lacZ-reporter avec des spécificités de phéromones différentes est utilisée dans le recouvrement.

Il existe deux résultats possibles dans le test de superposition. Il devrait être possible de voir la croissance de la souche poignardé après une nuit d'incubation. Sur la figure 1A, la souche est sensible à la superposition des bactériocines produites. Une zone de dégagement peut être visualisé entourant la contrainte poignardé. En outre, la souche de tourbillonnement enfoncée dans le mélange de recouvrement est possible et peut être vu dans la Figure 1A. Dans la figure 1B,</st...

La compétition chez Streptococcus pneumoniae est médiée par les bactériocines, de petits peptides antimicrobiens ayant une activité inhibitrice envers le pneumocoque et d’autres espèces apparentées. Nous décrivons ici un test de superposition bactérienne optimisé qui permet la caractérisation de l’activité de la bactériocine et du spectre inhibiteur, de l’immunité spécifique à la bactériocine et de la détection des peptides de détection du quorum sécrétés.

Utilisation de l&#39;Essai de superposition pour mesurer qualitativement la production bactérienne et la sensibilité à pneumocoque bactériocines

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

L’objectif global de cette procédure est de visualiser les bactéries et l’activité de la pneumonie à streptocoque à l’aide du test de superposition. Pour ce faire, il suffit d’abord de poignarder la souche du producteur sur une plaque TSA. Dans la deuxième étape, le mélange de souches de recouvrement est préparé, puis pipeté lentement sur la plaque TSA contenant la déformation du producteur étagé.Dans la dernière étape, l’activité bactérienne est évaluée. En fin de compte, le test de superposition peut être utilisé pour montrer l’inactivité des bactéries ou la production de phéromones par la souche d’intérêt poignardée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la purification directe de Bacterin, est qu’elle est un moyen rapide d’établir une gamme de bactéries, d’inactivité et de dépister plusieurs souches de bactéries en production.Natalie Marchek, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure Pour préparer les bactéries dans le producteur, commencez par strier la souche pneumococcique d’intérêt sur une plaque TSA à 5 % de sang de mouton, et incubez la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans du dioxyde de carbone à 5 %. Le lendemain matin, pipetez 3000 à 4 000 unités de catalyseurs sur des plaques contenant 25 millilitres de TSA, et utilisez des billes de verre stériles pour répartir les catalyseurs sur les plaques. Après avoir laissé sécher les plaques pendant environ 10 minutes sous une enceinte de sécurité biologique, recueillez une quantité visible de bactéries sur une pointe de pipette et enfoncez la pointe de la pipette dans la plaque TSA séchée.Si possible, incluez un producteur de bactéries connu comme témoin positif et la souche à utiliser dans le recouvrement comme témoin négatif, en laissant suffisamment d’espace entre les coups de couteau pour que les halos de croissance ne se chevauchent pas. Ensuite, incubez les cultures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant six heures la veille du test de superposition : inoculez cinq à 10 colonies de la souche pneumococcique à tester dans des tubes de verre contenant cinq millilitres de milieu THY contenant 0,5 % d’extrait de levure. Fermez ensuite les couvercles de ces cultures de souches de glycérol et incubez-les dans un bain-marie à 37 degrés Celsius sans secouer.Après quatre à cinq heures, retournez doucement les tubes plusieurs fois, puis mesurez l’od. Lorsque les cultures ont atteint une DO de 60 de 0,3 à 0,5, ajoutez du glycérol à une concentration finale de 20 %, puis aliquotez-les dans des microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre et stockez les tubes à moins 80 degrés Celsius. Le lendemain matin, décongelez une aliquote de stock de glycérol à température ambiante.Ensuite, juste avant l’application de recouvrement, mélangez cinq millilitres de THY 3000 à 4 000 unités de catalyseur et 200 microlitres de glycérol dans un tube conique de 15 millilitres. Pour les souches bactériennes rapporteures, ajoutez 50 microlitres de Xcel au mélange de recouvrement à l’aide d’un tube conique par plaque. Placez le mélange de recouvrement à température ambiante pendant que le mélange équilibre le solide solide de fusion TSA dans un micro-ondes, puis placez-le dans un bain-marie à 55 degrés Celsius.Lorsque le TSA fondu a refroidi à 55 degrés Celsius, ajoutez rapidement trois millilitres de TSA au mélange de recouvrement et pipetez de haut en bas plusieurs fois avec une pipette de cinq millilitres. En prenant soin de ne pas introduire de bulles, puis pipetez lentement le mélange de recouvrement directement sur la plaque TSA poignardée. Après quelques minutes, lorsque la plaque a durci et sans tourner la plaque, remettez soigneusement la culture à l’arme blanche recouverte dans l’incubateur pour une culture pendant la nuit.Le lendemain matin, observez la croissance pendant la nuit. Les plaques doivent apparaître opaques à cause de la croissance de la souche de recouvrement, sauf dans les zones où l’inhibition ou la signalisation des phéromones s’est produite. Il y a deux résultats possibles pour le test de superposition dans cette expérience représentative.Après une culture pendant la nuit, une zone de clairance a été observée autour de la souche poignardée, ce qui indique que cette souche de recouvrement est sensible aux bactéries produites par les péchés. Notez également le tourbillonnement de la souche poignardée dans le mélange de recouvrement. Dans cette expérience, la souche de recouvrement était immunisée contre la sécrétion de bactérine, comme l’indique l’absence de halo entourant le coup de couteau.Il est également possible que la souche poignardée ne sécrète pas de bactérine pour le test de signalisation. Deux issues différentes sont possibles. Dans cette expérience, la souche poignardée a sécrété une phéromone qui a interagi avec l’histidine kinase de la souche superposée, comme observé par la zone bleue indiquant la dégradation du xal dans cette image.Si la phéromone n’active pas la transcription du locus BLP dans la souche du rapporteur, ou si la souche poignardée ne sécrète pas de phéromone, la rupture de l’échelle X ne se produira pas comme observé dans cette image Suite à cette procédure. D’autres méthodes, telles que l’analyse mutationnelle ou le séquençage, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la question de savoir si une activité inhibitrice appréciable est attribuable au locus BLP ou s’il s’agit d’un manque d’activité résultant d’une mutation dans le gène du transporteur.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Contrairement à celle observée pour les eucaryotes, il ya un manque d'études qui dépolarisation de la membrane de détail et de la concentration d'ions changements dans les bactéries, principalement que leur petite taille rend les méthodes conventionnelles de mesure difficile. Ici, nous avons des protocoles détaillés pour le suivi de ces événements dans le Gram-positif important agent pathogène Streptococcus pneumoniae en utilisant des techniques de fluorescence.

La surveillance des changements dans la membrane de polarité, Membrane intégrité, et intracellulaires d&#39;ions concentrations dans<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilisation des colorants fluorescents

Les essais in vitro d'adhérence peuvent être utilisés pour étudier la fixation de Streptococcus pneumoniae à des monocouches de cellules épithéliales et d'enquêter sur les interventions possibles tels que l'utilisation des probiotiques pour inhiber la colonisation pneumococcique.

Étude des effets des probiotiques sur la colonisation pneumococcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Respect de dosage

Les dosages de plaque sont l’étalon-or pour la quantification virale, utilisant des superpositions de piégeage sur les monocouches cellulaires de l’hôte pour déterminer les titres viraux. Bien que divers revêtements semi-solides aient traditionnellement été utilisés, nous démontrons ici des techniques de plaque comparant des revêtements semi-solides à une nouvelle cellulose microcristalline liquide parmi plusieurs familles de virus.

Détermination de la concentration virale par Plaque Essais: Systèmes calque à l&#39;aide traditionnels et nouveaux

L’essai d’inhibition différée de la croissance peut être utilisé pour évaluer l’effet de compétition d’un isolat bactérien sur un autre. L’inhibition est quantifiée en mesurant la zone d’élimination autour de l’isolat producteur d’inhibiteurs, ou évaluée qualitativement en déterminant l’étendue visible de l’inhibition.

Croissance différée Essai d&#39;inhibition pour quantifier l&#39;effet des bactéries dérivées Antimicrobiens sur la concurrence

Nous décrivons une méthode simple de criblage des cultures bactériennes pour la production de composés inhibiteurs envers d’autres bactéries.

L&#39;utilisation de la technique de superposition Soft-agar à l&#39;écran pour les composés inhibitrices produites par voie bactérienne

Ce test de mise à mort d’opsonophagocytic est utilisé pour comparer la capacité des cellules immunitaires phagocytaires de répondre à et de tuer les bactéries issus des différents traitements et/ou des conditions. Classiquement, ce test sert de l’étalon-or pour évaluer les fonctions effectrices des anticorps contre une bactérie comme opsonine.

Opsonophagocytic meurtre dosage pour évaluer les réponses immunologiques contre les bactéries pathogènes

Les tests d'interaction de co-culture présentés dans ce protocole sont peu coûteux, haut débit, et simple. Ces essais peuvent être utilisés pour observer les interactions microbiennes dans la co-culture, identifier les modèles d'interaction et caractériser le potentiel inhibiteur d'une souche microbienne d'intérêt contre les agents pathogènes humains et environnementaux.

Tests de co-culture à haut débit pour l'étude des interactions microbiennes

Apprenez à utiliser l'essai de superposition pour visualiser l'activité des bactériocines chez Streptococcus pneumoniae. Cette méthode permet de caractériser rapidement l'activité antimicrobienne et la sensibilité des souches.

Utilisation de lEssai de superposition pour mesurer qualitativement la production bactérienne et la sensibilité à pneumocoque bactériocines (Vidéo) | JoVE Journal

Utilisation de l'Essai de superposition pour mesurer qualitativement la production bactérienne et la sensibilité à pneumocoque bactériocines

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